Определение активности ферментов. Ферментативная активность

Ферментативная активность почв [от лат. Fermentum - закваска] -способность почвы проявлять каталитическое воздействие на процессы превращения экзогенных и собственных органических и минеральных соединений благодаря имеющимся в ней ферментам. Характеризуя ферментативную активность почв, имеют в виду суммарный показатель активности. Ферментативная активность различных почв неодинакова и связана с их генетическими особенностями и комплексом взаимодействующих экологических факторов. Уровень ферментативной активности почв определяется активностью различных ферментов (инвертазы, протеаз, уреазы, дегидрогеназ, каталазы, фосфатаз), выражаемой количеством разложенного субстрата за единицу времени на 1 г почвы.

Биокаталитическая активность почв зависит от степени обогащенности их микроорганизмами и от типа почв. Активность ферментов изменяется по генетическим горизонтам, которые отличаются по содержанию гумуса, типам реакций, окислительно-восстановительным потенциалом и другими показателями по профилю.

В целинных лесных почвах интенсивность ферментативных реакций в основном определяют горизонты лесной подстилки, а в пахотных - пахотные слои. Все биологически менее активные генетические горизонты, находящиеся под горизонтами А или Ап, имеют низкую активность ферментов. Активность их незначительно возрастает при окультуривании почв. После освоения лесных почв под пашню ферментативная активность образованного пахотного горизонта по сравнению с лесной подстилкой резко снижается, но по мере его окультуривания повышается и в сильно окультуренных почвах приближается или превышает показатели лесной подстилки.

Ферментативная активность отражает состояние плодородия почв и внутренние изменения, происходящие при сельскохозяйственном использовании и повышении уровня культуры земледелия. Эти изменения обнаруживаются как при вовлечении целинных и лесных почв в культуру, так и при различных приемах их использования .

По всей Беларуси в пахотных почвах ежегодно теряется до 0,9 т/га гумуса. В результате эрозии ежегодно безвозвратно уносится с полей 0,57 т/га гумуса. Причинами дегумификации почв являются усиление минерализации почвенного органического вещества, отставание процессов новообразования гумуса от минерализации в связи с недостаточным поступлением в почву органических удобрений и снижения ферментативной активности почвы .

Биохимические превращения органического вещества почвы происходят в результате микробиологической деятельности под влиянием ферментов. ферментативный активность почва микроорганизм

Особую роль играют ферменты в жизнедеятельности животных, растений и микроорганизмов. Почвенные ферменты участвуют при распаде растительных, животных и микробных остатков, а также синтезе гумуса. В результате питательные вещества из трудно усвояемых соединений переходят в легко доступные формы для растений и микроорганизмов. Ферменты отличаются высокой активностью, строгой специфичностью действия и большой зависимостью от различных условий внешней среды. Благодаря каталитической функции они обеспечивают быстрое протекание в организме или вне его огромного числа химических реакций .

Совместно с другими критериями ферментативная активность почв может служить надёжным диагностическим показателем для выяснения степени окультуренности почв. В результате исследований 4, с. 91 установлена зависимость между активностью микробиологических и ферментативных процессов и проведением мероприятий, повышающих плодородие почв. Обработка почв, внесение удобрений существенно изменяют экологическую обстановку развития микроорганизмов.

В настоящее время в биологических объектах обнаружено несколько тысяч индивидуальных ферментов, а несколько сотен из них выделено и изучено. Известно, что живая клетка может содержать до 1000 различных ферментов, каждый из которых ускоряет ту или иную химическую реакцию .

Интерес к применению ферментов вызван еще и тем, что постоянно возрастают требования по увеличению безопасности технологических процессов. Присутствуя во всех биологических системах, являясь одновременно продуктами и инструментами этих систем, ферменты синтезируются и функционируют при физиологических условиях (pH, температура, давление, присутствие неорганических ионов), после чего легко выводятся, подвергаясь разрушению до аминокислот. Как продукты, так и отходы большинства процессов, протекающих с участием ферментов, являются нетоксичными и легко разрушаемыми. Кроме того, во многих случаях, ферменты, используемые в промышленности, получают экологически безопасным путем. От небиологических катализаторов ферменты отличают не только безопасность и повышенная способность к биодеградации, но и специфичность действия, мягкие условия протекания реакций и высокая эффективность. Эффективность и специфичность действия ферментов позволяет получать целевые продукты с высоким выходом, что делает использование ферментов в промышленности экономически выгодным. Применение ферментов способствует сокращению расхода воды и энергии в технологических процессах, уменьшает выбросы в атмосферу CO2, снижает риск загрязнения окружающей среды побочными продуктами технологических циклов .

Применением передовой агротехники можно изменять в благоприятную сторону микробиологические процессы не только пахотного, но и подпахотного слоев почвы.

При непосредственном участии внеклеточных ферментов происходит разложение органических соединений почвы. Так, протеолитические ферменты расщепляют белковые вещества и до аминокислот.

Уреаза разлагает мочевину до СО2 и NH3. Образующийся аммиак и аммонийные соли служат источником азотного питания растений и микроорганизмов.

Инвертаза и амилаза участвуют в расщеплении углеводов. Ферменты группы фосфатов разлагают фосфорорганические соединения почвы и играют важную роль в фосфатном режиме последней.

Для характеристики общей ферментативной активности почвы обычно используют наиболее распространенные ферменты, свойственные подавляющему большинству почвенной микрофлоры - инвертазу, каталазу, протеазу и другие .

В условиях нашей республики проводилось немало исследований 16, с. 115 по изучению изменения уровня плодородия и ферментативной активности почв при антропогенном воздействии, однако полученные данные не дают исчерпывающий ответ на характер изменений из-за сложности сопоставления результатов в виду различия условий проведения опытов и методик исследований.

В связи с этим поиск оптимального решения проблемы улучшения гумусного состояния почвы и ее ферментативной активности в конкретных почвенно-климатических условиях на основе разработки ресурсосберегающих приемов основной обработки почвыё применения почвозащитных севооборотов, способствующих сохранению структуры, предотвращению переуплотнения почвы и улучшению их качественного состояния и восстановлению плодородия почв при минимальных затратах, весьма актуален.

Понятие активности фермента

В повседневной биохимической практике практически не оценивается количество фермента, а только его активность. Активность - более широкое понятие, чем количество. Она подразумевает в первую очередь результат реакции , а именно убыль субстрата или накопление продукта. Естественно, при этом нельзя игнорировать время, которое проработал фермент и число молекул фермента. Но так как число молекул фермента подсчитать обычно нереально, то используют количество биологического материала, содержащего фермент (объем или массу).

Таким образом при определении активности ферментов нужно одновременно учитывать три переменные:

масса полученного продукта или исчезнувшего субстрата;
время, потраченное на реакцию;
количество фермента, но на самом деле массу или объем биологического материала, содержащего фермент.

Для понимания соотношений указанных факторов наглядным и простым примером может служить строительство двух зданий. Здания приравняем к продукту реакции, рабочие - это ферменты, бригада пусть соответствует объему биологического материала. Итак, задачи из 3-го класса:

На постройке одного здания трудилась бригада из 10 человек, другого такого же здания - бригада из 5 человек. Строительство закончено одновременно и в полном объеме. Где выше активность рабочих?
На постройке одного здания из 3 этажей трудилась бригада из 10 человек, другого здания из 12 этажей - бригада тоже из 10 человек. Строительство закончено одновременно и в полном объеме. Где выше активность рабочих?
На постройке одного здания из 5 этажей трудилась бригада из 10 человек, другого такого же здания - бригада тоже из 10 человек. Строительство первого здания заняло 20 дней, второе построено за 10 дней. Где выше активность рабочих?

Основы количественного определения активности ферментов

1. Активность фермента выражается в скорости накопления продукта или скорости убыли субстрата в пересчете на количество материала, содержащего фермент.

В практике обычно используют:

единицы количества вещества - моль (и его производные ммоль, мкмоль), грамм (кг, мг),
единицы времени - минута, час, секунда,
единицы массы или объема - грамм (кг, мг), литр (мл).

Активно используются и другие производные - катал (моль/с), международная единица активности (МЕ, Unit) соответствует мкмоль/мин.

Таким образом, активность фермента может выражаться, например, в ммоль/с×л, г/час×л, МЕ/л, кат/мл и т. д.

Например, известно,

2. Создание стандартных условий, чтобы можно было сравнивать результаты, полученные в разных лабораториях - оптимальная рН и фиксированная температура, например, 25°С или 37°С, соблюдение времени инкубации субстрата с ферментом.

Прежде чем обсуждать свойства ферментов и зависимость ферментов от каких-либо факторов необходимо определиться с понятием активность ферментов .

В повседневной биохимической практике практически не оценивается количество фермента, а только его активность . Активность – более широкое понятие, чем количество. Она подразумевает в первую очередь результат реакции , а именно убыль субстрата или накопление продукта. Естественно, при этом нельзя игнорировать время , которое проработал фермент и число молекул фермента. Но так как число молекул фермента подсчитать обычно нереально, то используют количество биологического материала, содержащего фермент (объем или массу).

Таким образом при определении активности ферментов нужно одновременно учитывать три переменные :

масса полученного продукта или исчезнувшего субстрата,
время , потраченное на реакцию,
количество фермента , но на самом деле массу или объем биологического материала, содержащего фермент.

Для понимания соотношений указанных факторов наглядным и простым примером может служить строительство двух зданий. Здания приравняем к продукту реакции, рабочие – это ферменты, бригада пусть соответствует объему биологического материала. Итак, задачи из 3-го класса:

1. На постройке одного здания трудилась бригада из 10 человек, другого такого же здания – бригада из 5 человек. Строительство закончено одновременно и в полном объеме. Где выше активность рабочих?

2. На постройке одного здания из 3 этажей трудилась бригада из 10 человек, другого здания из 12 этажей – бригада тоже из 10 человек. Строительство закончено одновременно и в полном объеме. Где выше активность рабочих?

3. На постройке одного здания из 5 этажей трудилась бригада из 10 человек, другого такого же здания – бригада тоже из 10 человек. Строительство первого здания заняло 20 дней, второе построено за 10 дней. Где выше активность рабочих?

Основы количественного определения активности ферментов

1. Активность фермента выражается в скорости накопления продукта или скорости убыли субстрата в пересчете на количество материала , содержащего фермент.

В практике обычно используют:

единицы количества вещества – моль (и его производные ммоль, мкмоль), грамм (кг, мг),
единицы времени – минута, час, секунда,
единицы массы или объема – грамм (кг, мг), литр (мл).

Активно используются и другие производные – катал (моль/с), международная единица активности (МЕ, Unit) соответствует мкмоль/мин.

Таким образом, активность фермента может выражаться, например, в ммоль/с×л, г/час×л, МЕ/л, кат/мл и т.д.

Например, известно,

что 1 г пепсина расщепляет 50 кг яичного белка за один час – таким образом, его активность составит 50 кг/час на 1 г фермента,
если 1,6 мл слюны расщепляет 175 кг крахмала в час – активность амилазы слюны составит 109,4 кг крахмала в час на 1 мл слюны или 1,82 кг/мин×г или 30,3 г крахмала/ с×мл.

2. Создание стандартных условий , чтобы можно было сравнивать результаты, полученные в разных лабораториях – оптимальная рН и фиксированная температура , например, 25°С или 37°С, соблюдение времени инкубации субстрата с ферментом.

Метаболизм - поддерживающая жизнь совокупность химических реакций организма. Вспомнив о миллиардах постоянно происходящих реакций, можно удивиться, как у нас остаются силы на что-то еще. А поскольку одна из главных целей метаболизма - обеспечение организма готовой к использованию энергией, очень важно, чтобы ее выработка превышала - и намного - затраты на производство. К счастью, в ходе эволюции мы получили молекулы, основной задачей которых стало уменьшение энергозатрат, необходимых для химических реакций в организме. Их называют ферментами.

Это крупные белковые молекулы, присутствующие во всех наших клетках и путем серии реакций превращающие одно (скажем, молекулу сахара), именуемое субстратом, в другое (например, связанное с глюкозой вещество, из которого организм синтезирует жиры) - продукт, или метаболит. Представьте себе ферменты как большие автоматизированные фабрики: с одной стороны огромного здания вы подаете бревно (субстрат), а на выходе получаете красивую салатницу (продукт). Конечно, можно сделать ее вручную, но на это уйдет намного больше сил и времени; фабрика сильно повышает эффективность.

Ферменты делают то же внутри клетки, быстро превращая субстраты в продукты и потребляя при этом очень мало энергии. Реакции, которые они вызывают (биологи используют слово «катализируют»), редко или вовсе не происходят без помощи ферментов. Если это случается, скорость реакции составляет крохотную долю возможной при участии фермента, а затраты энергии намного выше.

Относительные размеры ферментов очень велики. Их молекулы могут быть в 10–20 тыс. раз больше молекул субстрата, который они обрабатывают. И правда похоже на фабрику и полено. На рис. 7.4 показан субстрат А, превращающийся в продукт Б. Однако большинство реакций не происходит изолированно: они сопряжены с последующими, где Б (теперь уже субстрат) превращается в В (новый продукт). Фермент 1 превращает А в Б, а фермент 2 - Б в В.

Рис. 7.4. Простая ферментативная реакция

Ферменты могут работать с разной силой в зависимости от запасов (количества субстрата) и потребностей (количества имеющегося в клетке продукта). Как конвейер, который движется быстрее или медленнее в зависимости от поставки сырья и спроса на готовую продукцию, ферменты меняют скорость превращения субстратов (на профессиональном языке - «активность»). Они могут катализировать даже обратные реакции, превращая продукт в субстрат. В общем, от ферментов зависит, произойдет ли реакция, а если да, то как быстро и в каком направлении.

Ферментативная активность и форма фермента

Исходная форма ферментов напоминает цепочку аминокислот, расположенных в последовательности, которая закодирована в ДНК. Но, поскольку аминокислоты имеют химическое и физическое сродство, цепочка складывается и образует трехмерную форму, как очень длинная нить намагниченных бусин (рис. 7.5).

Рис. 7.5. Компьютерная модель фермента цАДФ-рибозы-гидролазы (CD38)

Один из способов корректировки ферментативной активности - изменение формы фермента . Это имеет серьезные последствия, потому что меняет его химические и физические свойства, а также способность модифицировать скорость реакции. Многие ученые-энзимологи поэтизируют быстроту, с которой ферменты меняют конфигурацию для выполнения своих задач. Вот показательная статья из New World Encyclopedia (http:// www. newworldencyclopedia. org):

Чтобы фермент был функционален, он должен принять трехмерную форму. Как происходит этот сложный процесс, остается загадкой. Небольшая цепочка из 150 аминокислот образует фермент, имеющий невероятное число возможных конфигураций: если проверять по 1012 разных конфигураций в секунду, потребуется 1026 лет, чтобы найти верную...

Но денатурировавший фермент может правильно сложиться за долю секунды, а затем участвовать в химических реакциях… Это показывает ошеломляющую сложность и гармонию Вселенной.

Пытаясь описать неописуемое, автор приводит пример сравнительно небольшой (для фермента) гипотетической молекулы. Скорость складывания фермента из линейной цепочки в готовую к работе сферу феноменальна. Не менее потрясает химическое разнообразие субстратов, которые может метаболизировать один активный фермент. И так же впечатляет огромное число факторов, способных модифицировать структуру ферментов, их число и активность.

Все это показывает глубокую связь между метаболизмом питательных веществ и миром ферментов . Катализируемые ими реакции, бесконечные числом и бесконечно переплетенные, контролируются нутриентами и связанными соединениями, число которых тоже бесконечно.

Ферменты - биологические катализаторы, высокомолекулярные вещества белковой природы, вырабатываемые живой клеткой. Они строго специфичны и играют важнейшую роль в обмене веществ микроорганизмов. Специфичность их связана с активными центрами, образуемыми группой аминокислот, т. е. каждый фермент реагирует с определенным химическим соединением или катализирует одну или несколько близких химических реакций. Например: фермент лактаза расщепляет лактозу, мальтаза - мальтозу и т. д.

Экзоферменты - выделяясь во внешнюю ере- Эндоферменты - участ-ду, расщепляют макромолекулы питательных Вуют в реакциях обмена веществ до более простых соединений, которые могут быть усвоены микробной клеткой (экзоферменты гидролиза вызывают гидролиз жиров, белков, углеводов).

Ферментный состав микроорганизмов является постоянным, а различные виды микробов четко различаются по набору ферментов. Поэтому изучение ферментативного состава имеет важное значение для идентификации различных микроорганизмов.

Практическое использование ферментативных свойств микробов: процессы брожения, грибы в пивоварении и виноделии, обработка шкур, для смягчения; консервирование. Приготовление биодобавок к стиральным порошкам, для удаления белковых загрязнений, так как они расщепляют белки до водорастворимых.

С помощью ферментов получают витамины, гормоны, алкалозы.

веществ, происходящих внутри клетки.

ПОСМОТРЕТЬ ЕЩЕ:

В жизнедеятельности бактерий ферменты играют важную роль, так как являются обязательными участниками разнообразных биохимических реакций, лежащих в основе функций питания, дыхания, размножения.

Устойчивость ферментативных систем бактерий позволяет использовать их биохимические свойства в сочетании с морфологическими и культуральными признаками для определения видов микроорганизмов.

Для обнаружения ферментов используют только чистые культуры микроорганизмов, которые засевают на специальные дифференциально-диагностические среды. Преимущественное значение при исследовании биохимической активности бактерий имеют сахаролитические, протеолитические и окислительно-восстановительные ферменты.

Сахаролитические ферменты микробов. Сахаролитическая активность микроорганизмов определяется по ферментативному расщеплению многоатомных спиртов и углеводов при посеве их на дифференциально-диагностические среды. Различные виды микробов при оптимальных условиях по-разному относятся к одним и тем же сахарам, расщепляя одни и оставаясь нейтральными по отношению к другим. Этосвойство микробов используется в бактериологической практике для дифференциации различных видов и разновидностей бактерий.

На плотных, жидких и полужидких питательных средах, содержащих различные индикаторы (чаще всего индикатор Андреде), сахара под действием сахаролитических ферментов бактерий расщепляются на альдегиды и кислоты. Конечными продуктами их расщепления являются углекислый газ и водород. Накопление кислот снижает рН питательной среды, что приводит к изменению цвета индикатора и самой среды. Если бактерии не выделяют фермент к данному углеводу, то цвет индикатора и питательной среды не меняется. Поэтому набор питательных сред с индикаторами называют пестрым или цветным рядом.

Для обнаружения сахаролитических ферментов исследуемую культуру бактерий чаще всего засевают в цветные среды («пестрый ряд») Гисса (рец. 15) с углеводами и индикатором Андреде (рец. 16) или индикатором ВР (смесь водного голубого с розоловой кислотой). «Пестрый ряд» Гисса содержит обычно пять пробирок; с глюкозой, лактозой, маннитом, мальтозой и сахарозой. В некоторых случаях для более углубленного изучения биохимических свойств микроорганизмов «пестрый ряд» Гисса дополняют дульцитом, сорбитом, ксилозой, арабинозой. Сахара, применяемые для обнаружения сахаролитических ферментов, должны быть химически чистыми.

Среды Гисса бывают жидкие и полужидкие (с добавлением 0,5% агар-агара). В пробирки с жидкими питательными средами опускают бродильную трубочку (поплавок), которая представляет собою стеклянную трубочку, запаянную с одного конца. При стерилизации поплавок полностью заполняется питательной средой. При образовании в среде газообразных продуктов они вытесняют жидкость из поплавка с образованием воздушного колокола. В полужидких средах газообразование определяют по наличию пузырьков в толще среды.

Протеолитические ферменты микробов. Некоторые микроорганизмы продуцируют и выделяют во внешнюю среду протеолитические ферменты, катализирующие расщепление белков. В результате расщепления молекулы белка образуются высокомолекулярные промежуточные продукты распада — пептоны, аминокислоты и полипептиды.

Для выявления протеолитических ферментов исследуемую культуру микроорганизмов засевают в питательную среду, содержащую тот или иной белок. Чаще всего для этой цели применяют желатину, реже — свернутую лошадиную сыворотку, коагулированный яичный белок, молоко или кусочки вареного мяса.

Для определения протеолитической активности микроорганизмов на желатине готовят мясо-пептонную желатину (рец. 17) и разливают в пробирки столбиком по 5-6 мл. После застывания питательной среды производят посев уколом, погружая петлю в глубь питательной среды до дна пробирки.

Микробы, способные расти при низкой температуре, инкубируют при 20°С-22°С. Остальные посевы инкубируют при 37°С. При температуре 37°С желатина плавится, поэтому после инкубации вынутые пробирки помещают в холодильник или холодную воду для застывания среды. После застывания среды приступают к просмотру результатов роста микроорганизмов. При выделении протеолитического фермента желатиназы происходит расщепление белков и наблюдается разжижение питательной среды, с рисунком, характерным для определенных видов микроорганизмов (рис. 37). Например, сибиреязвенная палочка разжижает желатину желатину в виде воронки, стафилококки — в виде чулка, синегнойная палочка — послойно и т.д.

ФЕРМЕНТАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ

Различные формы разжижения желатины микроорганизмами

Определение протеолитической активности микробов на молочном агаре Эйкмана. Готовят молочный агар Эйкмана, для чего к 10 мл стерильного расплавленного питательного агара добавляют 3 мл обезжиренного молока и смешивают. Молочный агар Эйкмана (рец. 18) разливают в чашки Петри и после остывания засевают исследуемым микроорганизмом петлей штрихами или шпателем, чтобы получить изолированные колонии. Через 24-48 часов инкубации в термостате культуры, продуцирующие протеолитические ферменты, разлагают молочный белок — казеин, в результате чего вокруг колоний образуются четкие прозрачные зоны на фоне мутной питательной среды.

Дата публикования: 2015-11-01; Прочитано: 1165 | Нарушение авторского права страницы

studopedia.org — Студопедия.Орг — 2014-2018 год.(0.001 с)…

Лекция № 3. Химическая структура, биохимические свойства и ферменты бактерий.

Клетка — универсальная единица живой материи. По химическому составу существенных отличий прокариотических и эукариотических клеток нет.

Химические элементы, входящие в состав живой материи, можно разделить на три основные группы.

1.Биогенные химические элементы (С, О, N, H). На их долю приходится 95% сухого остатка, в т.ч. 50%- C, 20%- O, 15%- N, 10%- H).

2.Макроэлементы — P, S,Cl, K, Mg, Ca, Na. На них приходится около 5 %.

3.Микроэлементы- Fe, Cu, I, Co, Mo и др. На них приходятся доли процента, однако они имеют важное значение в обменных процессах.

Химические элементы входят в состав различных веществ — воды, белков, липидов, нейтральных жиров, углеводов, нуклеиновых кислот. Синтез соединений контролируется генами. Многие вещества бактериальная клетка может получать извне — из окружающей среды или организма хозяина.

Вода составляет от 70 до 90 % биомассы. Содержание воды больше у капсульных бактерий, меньше всего- в спорах.

Белки встречаются во всех структурных элементах клетки. Белки могут быть более простые (протеины) и сложные (протеиды), в чистом виде или в комплексе с липидами, сахарами. Выделяют структурные (структурообразующие) и функциональные (регуляторные) белки, к последним относятся ферменты.

В состав белков входят как обычные для эукариотов аминокислоты, так и оригинальные- диаминопимелиновая, D-аланин, D-глютанин, входящие в состав пептидогликанов и капсул некоторых бактерий. Только в спорах находится дипиколиновая кислота , с которой связана высокая резистентность спор. Жгутики построены из белка флагеллина , обладающего сократительной способностью и выраженными антигенными свойствами. Пили (ворсинки) содержат особый белок — пилин .

Пептидную природы имеют капсулы представителей рода Bacillus, возбудителя чумы, поверхностные антигены ряда бактерий, в том числе стафилококков и стрептококков. Белок А — специфический белок S.aureus — фактор, обусловлавливающий ряд свойств этого возбудителя. Белок М — специфический белок гемолитических стрептококков серогруппы А, позволяющий дифференцировать серовары (около 100), что имеет эпидемиологическое значение.

Ряд белков содержит наружная мембрана грамотрицательных бактерий, из которых 3 — 4 мажорных (основных) и более 10- второстепенных, выполняющих различные функции. Среди мажорных белков- порины , образующие диффузные поры, через которые в клетку могут проникать мелкие гидрофильные молекулы.

Белки входят в состав пептидогликана — биополимера, составляющего основу бактериальной клеточной стенки. Он состоит из остова (чередующиеся молекулы двух аминосахаров) и двух наборов пептидных цепочек — боковых и поперечных. Наличие двух типов связей — гликозидных (между аминосахарами) и пептидных, которые соединяют субъединицы пептидогликанов, придают этому гетерополимеру структуру молекулярной сети . Пептидогликан- наиболее устойчивое соединение, которое образует ригидную мешковидную макромолекулу, определяющую постоянную форму бактерий и ряд их свойств .

1.Пептидогликан содержит родо- и видоспецифические антигенные детерминанты.

2.Он запускает классический и альтернативный пути активации системы комплемента.

3.Пептидогликан тормозит фагоцитарную активность и миграцию макрофагов.

4.Он способен инициировать развитие гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ).

5.Пептидогликан обладает противоопухолевым действием.

6.Он оказывает пирогенное действие, т.е. вызывает лихорадку.

Из соединений белков с небелковыми компонентами наибольшее значение имеют липопротеиды, гликопротеиды и нуклеопротеиды .

Удивительное таинство жизни — синтез белка осуществляется в рибосомах . Существует два основных типа рибосом — 70S (S- константа седиментации, единица Сведберга) и 80S. Рибосомы первого типа встречаются только у прокариотов. Антибиотики не действуют на синтез белка в рибосомах типа 80S, распространенных у эукариотов.

Липиды (главным образом форфолипиды) содержатся в цитоплазматической мембране (липидный бислой), в также в наружной мембране грамотрицательных бактерий. Есть микроорганизмы, содержащие большое количество липидов (до 40% сухого остатка)- микобактерии. В состав липидов входят различные жирные кислоты , весьма специфичные для разных групп микроорганизмов. Их определение имеет в ряде случаев диагностическое значение, например у анаэробов, микобактерий.

У микобактерий туберкулеза в составе липидов имеется ряд кислотоустойчивых жирных кислот- фтионовая, миколовая и др. Высокое содержание липидов и их состав определяют многие свойства микобактерий туберкулеза:

Устойчивость к кислотам, щелочам и спиртам;

Трудная окрашиваемость красителями (используют специальные методы окраски, чаще- по Цилю- Нильсену);

Устойчивость возбудителя к солнечной радиации и дезосредствам;

— патогенность.

Тейхоевые кислоты встречаются в клеточных стенках грамположительных бактерий.

Представляют собой водорастворимые линейные полимеры, содержащие остатки глицерина или рибола, связанные фосфодиэфирными связыми. С тейхоевыми кислотами связаны главные поверхностные антигены ряда грамположительных бактерий.

Углеводы встречаются чаще в виде полисахаридов , кторые могут быть экзо- и эндоклеточными. Среди экзоклеточных полисахаридов выделяют каркасные (входят в состав капсул) и истинно экзополисахариды (выходят во внешнюю среду). Среди бактериальных полисахаридов многие находят медицинское применение. Декстраны — полисахариды с большой молекулярной массой, по виду напоминают слизь. 6% раствор- кровезаменитель полиглюкин. Декстрановый гель сефадекс используется в колоночной хроматографии как молекулярное сито. Эндоклеточные полисахариды- запасные питательные вещества клетки (крахмал, гликоген и др.).

Липополисахарид (ЛПС) — один из основных компонентов клеточной стенки грамотрицательных бактерий, это соединение липида с полисахаридом. ЛПС состоит из комплекса:

1.Липид А .

2.Одинаковое для всех грамотрицательных бактерий полисахаридное ядро.

3.Терминальная сахаридная цепочка (О- специфическая боковая цепь) .

Синонимы ЛПС- эндотоксин, О- антиген.

ЛПС выполняет две основные функции- определяет антигенную специфичность и является одним из основных факторов патогенности. Это- эндотоксин, токсические свойства которого проявляются преимущественно при разрушении бактериальных клеток. Его токсичность определяется липидом А. ЛПС запускает синтез более 20 биологически активных веществ, определяющих патогенез эндотоксикоза, обладает пирогенным действием.

Нуклеиновые кислоты — ДНК и РНК. Рибонуклеиновые кислоты (РНК) находятся главным образом в рибосомах (р-РНК- 80- 85%), т(транспортные)- РНК- 10%, м(матричные)- РНК- 1- 2%, главным образом в одноцепочечной форме. ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) может находиться в ядерном аппарате (хромосомная ДНК) или в цитоплазме в специализированных образованиях- плазмидах- плазмидная (внехромосомная) ДНК. Микроорганизмы отличаются по структуре нуклеиновых кислот, содержанию азотистых оснований . Генетический код состоит всего из четырех букв (оснований) — А (аденин), Т (тимин), Г (гуанин) и Ц (цитозин). Наиболее часто для характеристики микроорганизмов используют как таксономический признак процентное соотношение Г/Ц, которое существенно отличается у различных групп микроорганизмов.

Микроорганизмы синтезируют различные ферменты — специфические белковые катализаторы. У бактерий обнаружены ферменты 6 основных классов .

1.Оксидоредуктазы- катализируют окислительно- восстановительные реакции.

2.Трансферазы- осуществляют реакции переноса групп атомов.

3.Гидролазы- осущесвляют гидролитическое расщепление различных соединений.

4.Лиазы- катализируют реакции отщепления от субстрата химической группы негидролитическим путем с образованием двойной связи или присоединения химической группы к двойным связям.

5.Лигазы или синтетазы- обеспечивают соединение двух молекул, сопряженное с расщеплением пирофосфатной связи в молекуле АТФ или аналогичного трифосфата.

6.Изомеразы — определяют пространственное расположение групп элементов.

В соответствии с механизмами генетического контроля у бактерий выделяют три группы ферментов:

— конститутивные , синтез которых происходит постоянно;

— индуцибельные , синтез которых индуцируется наличием субстрата;

— репрессибельные , синтез которых подавляется избытком продукта реакции.

Ферменты бактерий делят на экзо- и эндоферменты . Экзоферменты выделяются во внешнюю среду, осуществляют процессы расщепления высокомолекулярных органических соединений. Способность к образованию экзоферментов во многом определяет инвазивность бактерий- способность проникать через слизистые, соединительнотканные и другие тканевые барьеры.

Примеры: гиалуронидаза расщепляет гиалуроновую кислоту, входящую в состав межклеточного вещества, что повышает проницаемость тканей (клостридии, стрептококки, стафилококки и многие другие микроорганизмы); нейраминидаза облегчает преодоление слоя слизи, проникновение внутрь клеток и распространение в межклеточном пространстве (холерный вибрион, дифтерийная палочка, вирус гриппа и многие другие). К этой же группе относятся энзимы, разлагающие антибиотики.

В бактериологии для дифференциации микроорганизмов по биохимическим свойствам основное значение часто имеют конечные продукты и результаты действия ферментов. В соответствии с этим существует микробиологическая (рабочая) классификация ферментов.

1.Сахаролитические.

2.Протеолитические.

3.Аутолитические.

4.Окислительно- восстановительные.

5.Ферменты патогенности (вирулентности).

Ферментный состав клетки определяется геномом и является достаточно постоянным признаком. Знание биохимических свойств микроорганизмов позволяет идентифицировать их по набору ферментов. Основные продукты ферментирования углеводов и белков- кислота, газ, индол, сероводород, хотя реальный спектр для различных микроорганизмов намного более обширный.

Основные ферменты вирулентности- гиалуронидаза, плазмокоагулаза, лецитиназа, нейраминидаза, ДНК-аза. Определение ферментов патогенности имеет значение при идентификации ряда микроорганизмов и выявления их роли в патологии.

Ряд ферментов микроорганизмов широко используется в медицине и биологии для получения различных веществ (аутолитические, протеолитические), в генной инженерии (рестриктазы, лигазы).

Предыдущая12345678910111213141516Следующая

ПОСМОТРЕТЬ ЕЩЕ:

Ферменты бактерий. Ферментативная активность

Ферменты бактерий Ферменты являются высокоспецифичными биологическими катализаторами, без которых невозможны жизнь и размножение. Большое количество реакций, происходящих при жизни бактериальной клетки, указывает на существование у бактерий значительного количества ферментов. Ферменты - вещества белковой природы с большим молекулярным весом. Некоторые из них относятся к протеинам, другие являются сложными белками. Они построены из двух частей белка и небелковой части, называемой простетической группой. В состав ее могут входить витамины. нуклеотиды, атомы железа и пр. Связь между белковой частью фермента и го простетической группой может быть прочной и непрочной. При наличии непрочной связи в растворах наступает диссоциация фермента и при этом может освобождаться свободная простетическая группа.
Легко диссоциирующие иростетические группы ферментов называются коферментами. Обычно ферменты подразделяются на следующие основные группы:

1. Оксидоредуктазы. все ферменты, катализирующие окислительно восстановительные реакции.
2. Трансферазы. катализирующие перенос тех или иных групп (например аминогрупп, фосфатных остатков и т. д.
3.

Методы изучения ферментативной активности бактерий.

Гидролазы, расщепляющие путем гидролиза Гт или иные соединения; к этому классу относятся также фосфатазы и дезампназы - ферменты, отщепляющие соответственно гидролитическим путем фосфат или аммонийные группы от различных органических соединений.
4. Лиазы, ферменты, отщепляющие от субстратов негидролитическим путем определенные группы (например, СОг, НгО, SH2 и т. д.).
5. Изомеразы, катализирующие внутримолекулярные перестройки в субстрате.
6. Лигазы (синтетазы) - класс ферментов, катализирующих присоединение друг к другу двух молекул с одновременным разрывом ппрофосфатной связи в трифосфатах (например, образующие С-О, С-N или С-S связи).

Наиболее высокой ферментативной активностью обладают сапрофиты; в меньшей степени это свойство выражено у патогенных бактерий. Изучение ферментов патогенных бактерий имеет исключительно важное значение, так как на основании определения ферментативной активности микробов можно дифференцировать различные виды и определять природу того или иного возбудителя заболеваний. Наряду с этим ферментативная активность микробов определяет патогенез и клиническую картину инфекционного заболевания.
Ферменты дифференцируют на экзо и эндоферменты. Экзоферменты выделяются клеткой во внешнюю среду, осуществляют процессы расщепления высокомолекулярных органических соединений на более простые, доступные для ассимиляции.
Ферменты бактерий подразделяются на конституитивные и индуцибельные. К первой группе относятся те ферменты, которые синтезируются бактериальной клеткой вне зависимости от того, на какой среде бактерия выращивается. Индуцибельные ферменты продуцируются данной бактерией лишь в ответ на действие специфического индуктора, присутствующего в среде.

В основе всех метаболических реакций в бактериальной клетке лежит деятельность ферментов, которые принадлежат к 6 классам:оксиредуктазы, трансферазы, гидролазы, лигазы, лиазы, изомеразы. Ферменты, образуемые бактериальной клеткой, могут локализоваться как внутри клетки - эндоферменты, так и выделяться в окружающую среду - экзоферменты. Экзоферменты играют большую роль в обеспечении бактериальной клетки доступными для проникновения внутрь источниками углерода и энергии. Большинство гидролаз является экзоферментами, которые, выделяясь в окружающую среду, расщепляют крупные молекулы пептидов, полисахаридов, липидов до мономеров и димеров, способных проникнуть внутрь клетки. Ряд экзоферментов, например гиалуронидаза, коллагеназа и другие, являются ферментами агрессии. Некоторые ферменты локализованы в периплазматическом пространстве бактериальной клетки. Они участвуют в процессах переноса веществ в бактериальную клетку. Ферментативный спектр является таксономическим признаком, характерным для семейства, рода и - в некоторых случаях - для видов. Поэтому определением спектра ферментативной активности пользуются при установлении таксономического положения бактерий. Наличие экзоферментов можно определить при помощи дифференциально-диагностических сред, поэтому для идентификации бактерий разработаны специальные тест-системы, состоящие из набора дифференциально-диагностических сред.

Идентификация бактерий по ферментативной активности

Наиболее часто определяют ферменты класса гидролаз и оксидоредуктаз, используя специальные методы и среды.

Для определения протеолитической активности микроорганизмы засевают в столбик желатина уколом. Через 3-5 дней посевы просматривают и отмечают характер разжижения желатина. При разложении белка некоторыми бактериями могут выделяться специфические продукты - индол, сероводород, аммиак. Для их определения служат специальные индикаторные бумажки, которые помещают между горлышком и ватной пробкой в пробирку с МПБ или (и) пептонной водой, засеянными изучаемыми микроорганизмами. Индол (продукт разложения триптофана) окрашивает в розовый цвет полоску бумаги, пропитанной насыщенным раствором щавелевой кислоты. Бумага, пропитанная раствором ацетата свинца, в присутствии сероводорода чернеет. Для определения аммиака используют красную лакмусовую бумажку.

Для многих микроорганизмов таксономическим признаком служит способность разлагать определенные углеводы с образованием кислот и газообразных продуктов. Для выявления этого используют среды Гисса, содержащие различные углеводы (глюкозу, сахарозу, мальтозу, лактозу и др.). Для обнаружения кислот в среду добавлен реактив Андреде, который изменяет свой цвет от бледно-желтого до красного в интервале рН 7,2-6,5, поэтому набор сред Гисса с ростом микроорганизмов называют «пестрым рядом».

Для обнаружения газообразования в жидкие среды опускают поплавки или используют полужидкие среды с 0,5% агара.

Для того чтобы определить интенсивное кислотообразование, характерное для брожения смешанного типа, в среду с 1% глюкозы и 0,5% пептона (среда Кларка) добавляют индикатор метиловый красный, который имеет желтый цвет при рН 4,5 и выше, и красный - при более низких значениях рН.

Гидролиз мочевины определяют по выделению аммиака (лакмусовая бумажка) и подщелачиванию среды.

При идентификации многих микроорганизмов используют реакцию Фогеса - Проскауэра на ацетоин - промежуточное соединение при образовании бутандиола из пировиноградной кислоты. Положительная реакция свидетельствует о наличии бутандиолового брожения.

Обнаружить каталазу можно по пузырькам кислорода, которые начинают выделяться сразу же после смешивания микробных клеток с 1 % раствором перекиси водорода.

Для определения цитохромоксидазы применяют реактивы:

1) 1% спиртовый раствор сс-нафтола-1;

2) 1% водный раствор N-диметил-р-фенилендиамина дигидрохлорида.

О наличии цитохромоксидазы судят по синему окрашиванию, появляющемуся через 2-5 мин.

Для определения нитритов используют реактив Грисса: появление красного окрашивания свидетельствует о наличии нитритов.

Ферментативные свойства бактерий

Для определения сахаролитических свойств из углеводов обычно используют лактозу, глюкозу, мальтозу, сахарозу, маннит. Результат реакции определяется при помощи добавляемых в питательную среду различных индикаторов, дающих цветные реакции. Поэтому метод посева на дифференциально-диагностические среды получил название посева на пестрый ряд. Иногда, в так называемый длинный пестрый ряд, добавляют арабинозу, ксилозу, галактозу, инулин, крахмал и др.

При разложении углеводов происходит образование органических кислот (молочной, уксусной, муравьиной) и газа (СО2 и Н2). Кислоты вызывают изменение рН среды, что приводит к из-менению ее цвета в результате реакции индикатора. Образую-щийся газ вытесняет жидкость в верхней части поплавка (при ис-пользовании жидкого пестрого ряда) или вызывает разрыв агара (при применении полужидких сахаров).

Среды для определения сахаролитических свойств

Среды Гисса состоят из пептонной воды, 1% углевода и ин-дикатора Андреде (кислый фуксин, обесцвеченный щелочью). В среду опускается поплавок, который при стерилизации запол-няется средой. При сбраживании сахара бактериями, цвет среды меняется на красный, а газ скапливается в поплавке.

Полужидкие сахара состоят из 0,7% мясопептонного агара, 1% сахара и индикатора рН (водно-голубая краска и розоловая кислота). Посев производится уколом. При ферментации сахара цвет среды становится голубым, при наличии газообразования по ходу посева видны пузырьки газа, сам агар разрывается. В ла-бораторной практике широко применяются и другие дифферен-циально-диагностические среды, в состав которых входят сахара.

Протеолитические свойства бактерий (расщепление белков) определяются обнаружениемконечных продуктов ферментации белков (индола, сероводорода, аммиака) и по способности раз-жижать желатину (мясопептонный бульон с 10-15% желатин).

Разжижать желатину способны микробы, выделяющие фер-мент типаколлагеназы. Процесс разжижения идет сверху, при-чем различные виды микробов дают характерную для них фор-му, потому это свойство также используется в целях идентифи-кации бактерий.

Определение ферментации белков по конечным продуктам распада проводится при посеве на мясопептонный бульон или пептонную воду.

Таким образом, завершая работу по выделению чистой культуры, мы имеем данные о морфологических, тинкториальных, культуральных и биохимических свойствах выделенных культур бактерий. Это дает основание приступить к видовой идентификации – основной задаче последнего этапа бактерио-логического исследования. Для этого используют определитель Берги. Это справочное издание, каталог бактерий. В нем все микроорганизмы сгруппированы по основным биологическим свойствам. Сопо-ставляя свойства выделенных культур с приведенными в опреде-лителе, устанавливают их принадлежность к группе, семейству, ро-ду и, наконец, виду.

По морфологии, типу дыхания, тинкториальным свойствам, способности к спорообразованию находят таксономическую группу для идентифицируемой культуры. По полным морфологическим, тинкториальным свойствам, типу дыхания, спорообразованию, культуральным свойствам и неко-торым биохимическим признакам находят семейство, по методо-логическим особенностям (наличие капсул, жгутиков и т.д.), культуральным и биохимическим признакам определяют род, а внут-ри рода по биохимическим и антигенным свойствам устанавли-вают вид.

Cамостоятельная работа студента

На практическом занятии

Контрольные вопросы

1. Питание бактерий: аутотрофы и гетеротрофы.

2. Классификация питательных сред.

3. Условия культивирования микробов.

4. Требования, предъявляемые к питательным средам.

5. Химический состав микробов.

6. Понятие о чистой культуре и колониях.

7. Методы выделения чистых культур аэробных микробов.

8. Этапы выделения чистой культуры аэробных бактерий.

9. Культуральные свойства бактерий.

10. Биологическое окисление у аэробных и анаэробных бактерий.

11. Методы культивирования анаэробов.

12. Методы выделения чистых культур анаэробов.

13. Значение ферментов в идентификации бактерий.

Тема:«Влияние факторов внешней среды на микроорганизмы. Действие физических и химических факторов. Стерилизация и дезинфекция»

Цель:

– научиться методам стерилизации лабораторной по-суды и

питательных сред.

Задачи:

– уметь правильно подобрать соответствующий метод стерилизации

различных объектов (среда, посуда, инструменты и т.д.);

– освоить основные группы дезинфицирующих ве-ществ и механизм

их действия на бактерии.

Во внешней среде на микробы действуют физические, хими-ческие и биологические факторы, которые или угнетают, или стимулирует их жизнедеятельность.

К физическим факторам относятся: высокая и низкая темпе-ратура, высушивание, лучистая энергия, ультразвук, высокое давление.

Температура . Физиологическая деятельность любого микроорганизма приспособлена к определенному температурному оптимуму. По отношению к температуре все микроорганизмы делятся на психрофилы (от 0 до +10°С), мезофилы (от +20°С до +40°С) и термофилы (+50°С – +70°С). Большинство патогенных микроорганизмов относится к мезофилам.

Большинство микроорганизмов устойчивы к низким температурам (исключение составляют гонококки и менингококки).

Ферментативная активность бактерий

Высокая температура (+50°С – +60°С) губительно действует на вегетативные формы бактерий. Споры выдерживают кипячение до 2 часов. Губительное действие высокой температуры и лежит в основе методов стерилизации.

Основные противоэпидемические мероприятия

В лаборатории

Стерилизация

Стерилизация — удаление или уничтожение всех живых микроорганизмов (вегетативных и споровых форм) внутри или на поверхности предметов.

Стерилизация проводится различными методами: физическими, химическими,механическими.

Основные требования, предъявляемые к процессу стерилизации, отражены в отраслевом стандарте 42-21-2-82 «Стерилизация и дезинфекция изделий медицинского назначения. Методы, средства, режимы».

Физические методы

Самым распространенным методом стерилизации является воздействие высокой температуры. При температуре, приближающейся к 100 °С, происходит гибель большинства патогенных бактерий и вирусов. Споры почвенных бактерий-термофилов погибают при кипячении в течение 8,5 часов. Микроорганизмы, попавшие в глубинные слои земли, или покрытые свернувшейся кровью, оказываются защищенными от воздействия высокой температуры и сохраняют свою жизнеспособность.

При стерилизации физическими методами применяют действие высоких температур, давления, ультрафиолетового облучения и др.

Наиболее простой, но надежный вид стерилизации — прокаливание . Его применяют при поверхностной стерилизации негорючих и теплоустойчивых предметов непосредственно перед их использованием.

Другим простым и легко доступным методом стерилизации считается кипячение . Этот процесс проводят в стерилизаторе - металлической коробке прямоугольной формы с двумя ручками и плотно закрывающейся крышкой. Внутри расположена вынимающаяся металлическая сетка с ручками по бокам, на которую кладут стерилизуемый инструмент. Основной недостаток метода заключается в том, что он не уничтожает споры, а только вегетативные формы.

При паровой стерилизации необходимо выполнение определенных условий, которые гарантируют ее эффективность и сохранение стерильности изделий в течение определенного срока. Прежде всего, стерилизация инструментов, операционного белья, перевязочного материала должна проводиться в упаковке. С этой целью используют: стерилизационные коробки (биксы), двойную мягкую упаковку из бязи, пергамент, влагопрочную бумагу (крафт-бумага), полиэтилен высокой плотности.

Обязательное требование к упаковке — герметичность. Сроки сохранения стерильности зависят от вида упаковки и составляют трое суток для изделий простерилизованных в коробках без фильтров, в двойной мягкой упаковке из бязи, бумаги мешочной влагопрочной. В стерилизационных коробках с фильтрами стерильность изделий сохраняется в течение года.

Стерилизация сухим жаром

Процесс стерилизации сухим жаром проводят в сухожаровом шкафу (в печи Пастера и др.) — металлическом шкафу с двойными стенками. В корпусе шкафа расположены рабочая камера, в которой имеются полки для размещения предметов для обработки, и нагревательные элементы, которые служат дляравномерного нагрева воздуха в рабочей камере.

Режимы стерилизации:

температура 150 °С – 2 часа;

температура 160 °С – 170 °С – 45 минут — 1час;

температура 180 °С – 30 минут;

температура 200 °С – 10-15 минут.

Необходимо помнить, что при температуре 160 °С бумага и вата желтеют при более высокой температуре - сгорают (обугливаются). Началом стерилизации является тот момент, когда температура в печи достигает нужной величины. После окончания стерилизации печь выключается, прибор остывает до 50 °С, после чего из него вынимают простерилизованные предметы.

Изделия в воздушном стерилизаторе можно стерилизовать без упаковки, но только в тех случаях, если они используются сразу же после стерилизации. В качестве упаковки может быть использована бумага мешочная, изготовленная по ГОСТ 2228-81, в ней изделия хранятся не менее 3-х суток.

Режим воздушной стерилизации представлен двумя значениями температуры – 160 °С в течение 2,5 часов, либо 180 °С – в течение 1 часа.

Стерилизация текучим паром

Этот вид стерилизации производится в аппарате Коха или в автоклаве при незавинченной крышке и открытом выпускном кране. Аппарат Кохапредставляет собой металлический полый цилиндр с двойным дном. Стерилизуемый материал загружают в камеру аппарата не плотно, для того,чтобы обеспечить возможность наибольшего контакта его с паром. Начальный подогрев воды в приборе происходит в течение 10-15 минут.

Текучим паром стерилизуют материалы, которые разлагаются или портятся при температуре выше 100 °С — питательные среды с углеводами, витаминами, растворы углеводов и т. п.

Стерилизацию текучим паром проводят дробным методом – при температуре не выше 100 оС по 20-30 минут в течение 3-х дней. При этомвегетативные формы бактерий погибают, а споры сохраняют жизнеспособность и прорастают в течение суток при комнатной температуре. Последующее прогревание обеспечивает гибель этих вегетативных клеток, появляющихся из спор в промежутках между этапами стерилизации.

Тиндализация – метод дробной стерилизации, при котором прогревание стерилизуемого материала проводится при температуре 56-58 оС в течение часа 5-6 дней подряд.

Пастеризация – однократное нагревание материала до 50-65 °С (в течение 15-30 минут), 70-80 °С (в течение 5-10 минут). Используется для уничтожения бесспоровых форм микробов в пищевых продуктах (молоко, соки, вино, пиво).

Предыдущая1234567891011121314Следующая