Μέτρηση ενζυματικής δραστηριότητας. Μεταβολισμός και Ένζυμα

Έννοια των ενζύμων

Ένζυμα (ένζυμα)είναι διαλυτές ή δεσμευμένες στη μεμβράνη πρωτεΐνες προικισμένες με καταλυτική δράση. (Εκτός από τις πρωτεΐνες, ορισμένα RNA (ριβοένζυμα) και αντισώματα (abzymes) μπορούν να επιδείξουν καταλυτική δράση στο σώμα, αλλά είναι χιλιάδες φορές λιγότερο αποτελεσματικά από τα ένζυμα.) Αυτά τα ονόματα προέρχονται από το λατινικό "fermentatio" - ζύμωση και το ελληνικό " εν ζυμ” - μέσα στο προζύμι . Θυμίζουν τις πρώτες πηγές ενζύμων. Η βιοχημεία, η οποία μελετά τα ένζυμα, ονομάζεται ενζυμολογία. Στα διαγράμματα και τις εξισώσεις αντίδρασης, τα μόρια ενζύμου χαρακτηρίζονται - μι. Οι ουσίες των οποίων οι μετασχηματισμοί καταλύονται από ένζυμα ονομάζονται υποστρώματα (S). Προϊόνταενζυματική αντίδραση σημαίνει - R. Δεδομένου ότι τα ένζυμα είναι πρωτεΐνες, λαμβάνονται σε ομοιογενή μορφή χρησιμοποιώντας τις ίδιες μεθόδους με άλλες πρωτεΐνες. Τα ένζυμα χαρακτηρίζονται από φυσικοχημικές ιδιότητες που είναι εγγενείς στις πρωτεΐνες.

Διαφορά μεταξύ ενζύμων και ανόργανων καταλυτών:

α) να επιταχύνει τις αντιδράσεις πολύ πιο αποτελεσματικά.

β) προικισμένο με υψηλή ειδικότητα δράσης.

γ) υπόκεινται σε ρύθμιση υπό φυσιολογικές συνθήκες·

δ) λειτουργούν υπό ήπιες συνθήκες.

Η δομή των ενζύμων

Τα ένζυμα μπορεί να είναι απλές και σύνθετες (συζευγμένες) πρωτεΐνες, οι οποίες μπορεί να περιλαμβάνουν λιπίδια, υδατάνθρακες, μεταλλικά ιόντα, αζωτούχες βάσεις και παράγωγα βιταμινών. Στο σώμα, τα ένζυμα μπορούν να λειτουργήσουν τόσο σε διαλυτή κατάσταση όσο και με τη μορφή αδιάλυτων συμπλεγμάτων ή να αποτελούν μέρος βιολογικών μεμβρανών.

Ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα των ενζύμων είναι η παρουσία ενεργό κέντρο. Ενεργό κέντρο -Αυτός είναι ένας μοναδικός συνδυασμός υπολειμμάτων αμινοξέων κοντά στο διάστημα, που παρέχει:

α) αναγνώριση του μορίου του υποστρώματος,

β) δέσμευση του υποστρώματος με το ένζυμο,

γ) υλοποίηση καταλυτικού μετασχηματισμού (στην περίπτωση ενός σύνθετου ενζύμου, στην πράξη της κατάλυσης συμμετέχει και το συνένζυμο που αποτελεί μέρος του ενεργού κέντρου).

Η ενεργή θέση εμφανίζεται όταν η πρωτεΐνη διπλώνει και παίρνει τη φυσική της (ενεργή) διαμόρφωση. Η δομή του ενεργού κέντρου μπορεί να αλλάξει κατά την αλληλεπίδραση με το υπόστρωμα. Σύμφωνα με τη μεταφορική έκφραση του D. Koshland, το υπόστρωμα προσεγγίζει το ενεργό κέντρο σαν ένα χέρι σε ένα γάντι.

Ένα μόριο ενζύμου, ειδικά αν αποτελείται από πολλές υπομονάδες, μπορεί να περιέχει περισσότερες από μία ενεργές θέσεις.

Υπάρχουν δύο περιοχές στο ενεργό κέντρο. Η πρώτη περιοχή είναι υπεύθυνη για την αναγνώριση και τη δέσμευση του υποστρώματος. Ονομάζεται θέση δέσμευσης υποστρώματος ή θέση αγκύρωσης. Το δεύτερο τμήμα ονομάζεται καταλυτικό τμήμα και περιέχει υπολείμματα αμινοξέων που συμμετέχουν στην πράξη της κατάλυσης.

Τα ένζυμα είναι πρωτεΐνες που ποικίλλουν πολύ σε μοριακό βάρος και δομική πολυπλοκότητα. Ένα παράδειγμα ενζύμου μικρού μορίου είναι η ριβονουκλεάση, η οποία αποτελείται από μία υπομονάδα με μοριακό βάρος 13.700 Da. (Η αλληλουχία αμινοξέων της ριβονουκλεάσης έχει προσδιοριστεί. Το 1969, η ριβονουκλεάση συντέθηκε στο εργαστήριο του B. Merrifield στη Νέα Υόρκη.) Πολλά ένζυμα αποτελούνται από πολλές υπομονάδες, για παράδειγμα, η γαλακτική αφυδρογονάση αποτελείται από τέσσερις υπομονάδες δύο τύπων. Μέχρι σήμερα είναι γνωστά αρκετά πολυενζυμικά σύμπλοκα, που αποτελούνται από δεκάδες διαφορετικές υπομονάδες και αρκετούς τύπους συνενζύμων. Για παράδειγμα, το σύμπλοκο πυροσταφυλικής αφυδρογονάσης αποτελείται από 60 υπομονάδες τριών τύπων και πέντε τύπους συμπαραγόντων. Το μοριακό βάρος ενός τέτοιου συμπλόκου είναι 2,3 * 10 6 - 10 * 10 6 Da, ανάλογα με την πηγή του ενζύμου. Το μόριο του ενζύμου μπορεί να είναι μικρότερο από το μόριο του υποστρώματος. Για παράδειγμα: τα μόρια των ενζύμων αμυλάση και ριβονουκλεάση είναι μικρότερα από τα μόρια των υποστρωμάτων τους - άμυλο και RNA.

Το πρωτεϊνικό μέρος των σύνθετων ενζύμων είναι καταλυτικά ανενεργό και ονομάζεται αποένζυμο. Η δέσμευση ενός αποενζύμου με ένα μη πρωτεϊνικό συστατικό οδηγεί στο σχηματισμό ενός καταλυτικά ενεργού ενζύμου (ολοένζυμο):

Πολλά ένζυμα περιέχουν ένα μεταλλικό ιόν που μπορεί να εκτελέσει διάφορες λειτουργίες:

α) συμμετέχουν στη δέσμευση του υποστρώματος και στη διαδικασία του καταλυτικού μετασχηματισμού του.

β) να προωθήσει την προσκόλληση του συνενζύμου στο μόριο του ενζύμου.

γ) σταθεροποίηση της τριτοταγούς δομής του ενζύμου (για παράδειγμα, Ca2+ σε αμυλάση).

δ) με σύνδεση στο υπόστρωμα, σχηματίζοντας ένα αληθινό υπόστρωμα στο οποίο δρα το ένζυμο.

Πολλά συνένζυμα είναι παράγωγα βιταμινών, επομένως οι μεταβολικές διαταραχές που οφείλονται σε ανεπάρκεια βιταμινών προκαλούνται από τη μείωση της δραστηριότητας ορισμένων ενζύμων.

Ορισμένα ένζυμα περιέχουν, μαζί με ένα ενεργό κέντρο, αλλοστερικό (ρυθμιστικό) κέντρο -μια περιοχή ενός πρωτεϊνικού σφαιριδίου, έξω από το ενεργό κέντρο, όπου μπορούν να συνδεθούν ουσίες που ρυθμίζουν την ενζυματική δραστηριότητα. Αυτές οι ουσίες ονομάζονται αλλοστερικές τελεστές (αλλοστερικοί ενεργοποιητές ή αναστολείς). Ως αποτέλεσμα της δέσμευσης του τελεστή στο αλλοστερικό κέντρο, συμβαίνει μια αλλαγή στη δομή της πρωτεΐνης, που οδηγεί σε αλλαγή στη χωρική διάταξη των υπολειμμάτων αμινοξέων στο ενεργό κέντρο και, τελικά, σε αλλαγή της ενζυμικής δραστηριότητας .

Τα ένζυμα που βρίσκονται στον ίδιο οργανισμό και καταλύουν την ίδια χημική αντίδραση, αλλά με διαφορετικές πρωτεϊνικές δομές, ονομάζονται ισοένζυμα. Τα ισοένζυμα διαφέρουν μεταξύ τους σε φυσικοχημικές ιδιότητες όπως το μοριακό βάρος, η θερμική σταθερότητα, η ειδικότητα του υποστρώματος και η ηλεκτροφορητική κινητικότητα. Η φύση της εμφάνισης των ισοενζύμων ποικίλλει, αλλά τις περισσότερες φορές οφείλεται σε διαφορές στη δομή των γονιδίων που κωδικοποιούν αυτά τα ισοένζυμα ή τις υπομονάδες τους. Για παράδειγμα, το ένζυμο γαλακτική αφυδρογονάση (LDH), το οποίο καταλύει την αναστρέψιμη αντίδραση της οξείδωσης του γαλακτικού σε πυροσταφυλικό, έχει τέσσερις υπομονάδες δύο τύπων Μ και Η, ο συνδυασμός αυτών των υπομονάδων αποτελεί τη βάση του σχηματισμού πέντε ισοενζύμων LDH (Εικ. 1). Για τη διάγνωση παθήσεων της καρδιάς και του ήπατος, είναι απαραίτητο να μελετηθεί το φάσμα ισοενζύμων της LDH στον ορό του αίματος, καθώς οι LDH 1 και LDH 2 είναι ενεργές στον καρδιακό μυ και τα νεφρά και οι LDH 4 και LDH 5 είναι ενεργές στους σκελετικούς μύες. και το συκώτι.

Εικ. 1 Δομή διαφόρων ισοενζύμων LDH.

Μέτρηση ενζυμικής δραστηριότητας

Η ενζυμική δραστηριότητα προσδιορίζεται με τη μέτρηση του ρυθμού των καταλυόμενων αντιδράσεων. Ο ρυθμός των ενζυματικών αντιδράσεων μετριέται με τη μείωση της συγκέντρωσης του υποστρώματος ή την αύξηση της συγκέντρωσης του προϊόντος ανά μονάδα χρόνου:

v = -ΔΣ S /Δτ, v = ΔC P /Δτ,

Οπου ΔΣ Σ– αλλαγή στη μοριακή συγκέντρωση του υποστρώματος (mol/l),

ΔC P- μεταβολή στη μοριακή συγκέντρωση του προϊόντος αντίδρασης (mol/l),

Δτ - αλλαγή ώρας (min, sec).

Συνιστάται η διεξαγωγή κινητικών μελετών σε συγκεντρώσεις κορεσμού του υποστρώματος, διαφορετικά το ένζυμο δεν θα μπορέσει να παρουσιάσει μέγιστη δραστικότητα.

Μονάδες ενζυμικής δραστηριότητας:

Διεθνής Ενζυμική Μονάδα (U)- αυτή είναι η ποσότητα του ενζύμου που καταλύει τη μετατροπή 1 μmol υποστρώματος σε 1 λεπτό σε θερμοκρασία 25 o C και στο βέλτιστο pH του περιβάλλοντος.

Η μονάδα SI του ενζύμου είναι έλασης (κατ)– αυτή είναι η ποσότητα του ενζύμου που καταλύει τη μετατροπή ενός mole υποστρώματος σε 1 δευτερόλεπτο. Είναι εύκολο να υπολογιστεί ότι:

1 U = (1 * 10 -6 M)/60 s = 1,67 * 10 -8 M s-1 = 1,67 * 10 -8 cat = 16,7 ncat.

Συχνά ορίζεται συγκεκριμένη δραστηριότηταπαρασκευάσματα ενζύμων διαιρώντας τη δραστηριότητα ενός δείγματος του ενζυμικού παρασκευάσματος, εκφρασμένη σε (U), με το βάρος του δείγματος σε χιλιοστόγραμμα:

A beat = U/βάρος του φαρμάκου (mg)

Όταν τα ένζυμα καθαρίζονται, η ειδική δραστηριότητα αυξάνεται. Αυξάνοντας την ειδική δραστηριότητα, μπορεί κανείς να κρίνει την αποτελεσματικότητα των σταδίων καθαρισμού και την καθαρότητα του παρασκευάσματος ενζύμου.

Για την αξιολόγηση της δραστικότητας των υψηλά καθαρών, ομοιογενών ενζυμικών παρασκευασμάτων, ο αριθμός των διεθνών μονάδων (U) του ενζύμου στο δείγμα διαιρείται με την ποσότητα της ενζυμικής ουσίας (μmol) σε αυτό το δείγμα, που υπολογίζεται μοριακή δραστηριότητα(Ταχύτητα). Από φυσική άποψη, η μοριακή δραστηριότητα είναι ο αριθμός των μορίων του υποστρώματος που υφίστανται μετασχηματισμό σε ένα μόριο ενζύμου σε 1 λεπτό ή 1 δευτερόλεπτο. Για παράδειγμα: για την ουρεάση, η οποία επιταχύνει την υδρόλυση της ουρίας, η μοριακή δραστηριότητα είναι 30.000, η θρυψίνη - 102, η οξειδάση της γλυκόζης - 17.000 κύκλοι ανά δευτερόλεπτο.

Ιδιότητες των ενζύμων

4.1. Μηχανισμός δράσης.Τα ένζυμα δεν μετατοπίζουν την ισορροπία των καταλυόμενων αντιδράσεων προς το σχηματισμό προϊόντων, επομένως η σταθερά ισορροπίας της αντίδρασης παραμένει σταθερή. Όπως όλοι οι καταλύτες, τα ένζυμα μειώνουν μόνο τον χρόνο που χρειάζεται για να επιτευχθεί αυτή η ισορροπία. Στις περισσότερες περιπτώσεις, τα ένζυμα επιταχύνουν τις αντιδράσεις κατά 10 7 - 10 14 φορές. Η αποτελεσματικότητα της ενζυμικής κατάλυσης βασίζεται σε μια ισχυρή μείωση της ενέργειας ενεργοποίησης της αντίδρασης λόγω της μετατροπής του υποστρώματος στο προϊόν μέσω μεταβατικών καταστάσεων.

4.2. Ειδικότητα δράσης. Η ειδικότητα της δέσμευσης στο υπόστρωμα και η διαδρομή της ενζυμικής αντίδρασης προσδιορίζονται από το αποένζυμο. Η ειδικότητα της δράσης των ενζύμων καθορίζει τον κατευθυντικό μεταβολισμό στο σώμα.

Τα ένζυμα λέγεται ότι έχουν στενή εξειδίκευση υποστρώματος, εάν δρουν σε πολύ μικρό εύρος υποστρωμάτων. Μερικές φορές μπορούμε να μιλήσουμε για απόλυτη εξειδίκευση υποστρώματος,για παράδειγμα, η καταλάση καταλύει μόνο μία αντίδραση - την αποσύνθεση του υπεροξειδίου του υδρογόνου:

Τα περισσότερα ένζυμα χαρακτηρίζονται από σχετική (ευρεία, ομαδική) εξειδίκευση υποστρώματοςόταν καταλύουν μια ομάδα παρόμοιων αντιδράσεων. Για παράδειγμα, η αλκοολική αφυδρογονάση καταλύει το μετασχηματισμό των αλκοολών σε αλδεΰδες και η μεθανόλη, η αιθανόλη, η προπανόλη και άλλες αλκοόλες μπορούν να δράσουν ως υποστρώματα. Ένα ενδιαφέρον γεγονός είναι ότι η αλκοολική αφυδρογονάση μπορεί να οξειδώσει τις μη γραμμικές αλκοόλες, καθώς και την ομάδα αλκοόλης που είναι μέρος σύνθετων μορίων, συγκεκριμένα, αυτό το ένζυμο μπορεί να καταλύσει τη μετατροπή της ρετινόλης σε αμφιβληστροειδή. Φυσικά, ένζυμα προικισμένα με ευρεία εξειδίκευση υποστρώματος καταλύουν τον μετασχηματισμό υποστρωμάτων με ποικίλες αποδόσεις.

Τα ένζυμα είναι επίσης προικισμένα στερεοχημική ειδικότητα: το ενεργό κέντρο τους αναγνωρίζει τα μόρια του υποστρώματος με χωρική διαμόρφωση. Για παράδειγμα, οι οξειδάσες L-αμινοξέων είναι δραστικές μόνο έναντι των L-αμινοξέων και δεν έχουν καμία επίδραση στα D-ανάλογά τους. Για την οξειδωτική απαμίνωση των D-αμινοξέων, οι ζωντανοί οργανισμοί έχουν οξειδάσες D-αμινοξέων που δεν δρουν στα L-αμινοξέα. Είναι η ικανότητα του ενεργού κέντρου να δεσμεύεται σε ορισμένα στερεοϊσομερή του υποστρώματος που αποτελεί τη βάση της λειτουργίας ενζύμων όπως οι ρακεμάσες, που μετατρέπουν ορισμένα στερεοϊσομερή σε άλλα.

Ιδιαιτερότητα των μονοπατιών μετασχηματισμούείναι ότι ένα υπόστρωμα υπό τη δράση διαφορετικών ενζύμων μπορεί να μετατραπεί σε προϊόντα που διαφέρουν ως προς τη δομή και το ρόλο στο μεταβολισμό.

Εδώ είναι ένα παράδειγμα: Οξειδάση L-αμινοξέοςδρουν στα L-αμινοξέα, μετατρέποντάς τα σε άλφα-κετοοξέα με το σχηματισμό αμμωνίας και υπεροξειδίου του υδρογόνου.

L-αμινοξύ αποκαρβοξυλάσηδεσμεύονται στα ίδια υποστρώματα, αλλά καταλύουν μια διαφορετική αντίδραση: αποκαρβοξυλίωση με σχηματισμό βιογενών αμινών και απελευθέρωση διοξειδίου του άνθρακα.

Ένα άλλο παράδειγμα είναι η δυνατότητα μετατροπής της φωσφορικής γλυκόζης-6 υπό τη δράση διαφόρων ενζύμων, κατά μήκος μιας από τις πιθανές μεταβολικές οδούς:

4.3. Θερμική αστάθεια .

Όπως πολλές πρωτεΐνες, όταν η θερμοκρασία αυξάνεται, τα ένζυμα υφίστανται θερμική μετουσίωση, η οποία οδηγεί σε διαταραχή της φυσικής διαμόρφωσης του ενζύμου και αλλαγή στη δομή του ενεργού κέντρου. Τα ένζυμα των θηλαστικών αρχίζουν να μετουσιώνονται αισθητά σε θερμοκρασίες άνω των 40°C.

Σε σχέση με τα παραπάνω, συνιστάται η αποθήκευση των ενζυμικών σκευασμάτων σε χαμηλές θερμοκρασίες. Ένας από τους καλύτερους τρόπους διατήρησης των ενζύμων είναι η λυοφιλοποίησή τους (στεγνή σε θερμοκρασίες κάτω των -70 o C σε κενό), η μετατροπή τους σε μερικώς μετουσιωμένη κατάσταση χρησιμοποιώντας άλατα αμμωνίου και η τοποθέτηση τους στο ψυγείο.

4.4. Εξάρτηση του ρυθμού αντίδρασης από τη θερμοκρασία.Ο ρυθμός των ενζυματικών αντιδράσεων, όπως κάθε χημική αντίδραση, εξαρτάται από τη θερμοκρασία. Όταν η θερμοκρασία αυξάνεται κατά 10 o C, ο ρυθμός αντίδρασης αυξάνεται κατά 2-4 φορές σύμφωνα με τον κανόνα του Van't Hoff. Ωστόσο, σε θερμοκρασίες πάνω από 40 o C, η μετουσίωση των ενζύμων γίνεται σημαντική, γεγονός που οδηγεί σε μείωση της συνολικής δραστηριότητας (Εικ. 2):

Ρύζι. 2. Εξάρτηση του ρυθμού της ενζυμικής αντίδρασης από τη θερμοκρασία.

4.5. Εξάρτηση του ρυθμού αντίδρασης από το pH.Η εξάρτηση του ρυθμού της ενζυμικής αντίδρασης από το pH έχει σχήμα καμπάνας (Εικ. 3). Οι τιμές pH στις οποίες παρατηρείται ο υψηλότερος ρυθμός ενζυμικής αντίδρασης ονομάζονται βέλτιστες (pH-optimum). Η φύση των καμπυλών και η τιμή του βέλτιστου pH εξαρτώνται από τη φύση των φορτισμένων ομάδων του υποστρώματος και των φορτισμένων ομάδων του ενζύμου (ειδικά εκείνων που περιλαμβάνονται στο ενεργό κέντρο). Το βέλτιστο pH για τα περισσότερα ένζυμα βρίσκεται στην περιοχή από 6,0 έως 8,0 (Εικ. 3).

Ρύζι. 3. Εξάρτηση του ρυθμού της ενζυματικής αντίδρασης από το pH.

Ωστόσο, υπάρχουν εξαιρέσεις, για παράδειγμα, η πεψίνη είναι πιο ενεργή σε pH 1,5 - 2,0 και η αλκαλική φωσφατάση σε pH 10,0 - 10,5 (Εικ. 4)

Ρύζι. 4. Εξάρτηση του ρυθμού ενζυματικής αντίδρασης (v) από το pH του μέσου.

Σε ακραίες (πολύ χαμηλές ή πολύ υψηλές) τιμές pH, η τριτοταγής δομή του μορίου του ενζύμου διαταράσσεται, οδηγώντας σε απώλεια της ενζυμικής δραστηριότητας.

Σχετική πληροφορία.

Έννοια της ενζυμικής δραστηριότητας

Στην καθημερινή βιοχημική πρακτική, πρακτικά δεν αξιολογείται η ποσότητα του ενζύμου, αλλά μόνο η δραστηριότητά του. Η δραστηριότητα είναι μια ευρύτερη έννοια από την ποσότητα. Συνεπάγεται, πρώτα απ' όλα, το αποτέλεσμα της αντίδρασης, δηλαδή την απώλεια υποστρώματος ή τη συσσώρευση προϊόντος. Φυσικά, δεν μπορεί κανείς να αγνοήσει τον χρόνο που δούλεψε το ένζυμο και τον αριθμό των μορίων του ενζύμου. Επειδή όμως είναι συνήθως αδύνατο να υπολογιστεί ο αριθμός των μορίων του ενζύμου, χρησιμοποιείται η ποσότητα του βιολογικού υλικού που περιέχει το ένζυμο (όγκος ή μάζα).

Έτσι, κατά τον προσδιορισμό της ενζυμικής δραστηριότητας, τρεις μεταβλητές πρέπει να λαμβάνονται υπόψη ταυτόχρονα:

τη μάζα του προκύπτοντος προϊόντος ή του εξαφανισμένου υποστρώματος·
χρόνος που αφιερώνεται στην αντίδραση.
την ποσότητα του ενζύμου, αλλά στην πραγματικότητα τη μάζα ή τον όγκο του βιολογικού υλικού που περιέχει το ένζυμο.

Για να κατανοήσουμε τις σχέσεις μεταξύ αυτών των παραγόντων, ένα σαφές και απλό παράδειγμα μπορεί να είναι η κατασκευή δύο κτιρίων. Ας εξισώσουμε τα κτίρια με το προϊόν αντίδρασης, οι εργάτες είναι ένζυμα και ας αφήσουμε την ομάδα να αντιστοιχεί στον όγκο του βιολογικού υλικού. Λοιπόν, προβλήματα από την τρίτη τάξη:

Μια ομάδα 10 ατόμων εργάστηκε για την κατασκευή ενός κτιρίου και μια ομάδα 5 ατόμων εργάστηκε σε ένα άλλο παρόμοιο κτίριο. Η κατασκευή ολοκληρώθηκε ταυτόχρονα και πλήρως. Πού είναι υψηλότερη η δραστηριότητα των εργαζομένων;
Μια ομάδα 10 ατόμων εργάστηκε για την κατασκευή ενός κτιρίου 3 ορόφων και μια ομάδα 10 ατόμων εργάστηκε σε ένα άλλο κτίριο 12 ορόφων. Η κατασκευή ολοκληρώθηκε ταυτόχρονα και πλήρως. Πού είναι υψηλότερη η δραστηριότητα των εργαζομένων;
Μια ομάδα 10 ατόμων εργάστηκε για την κατασκευή ενός κτιρίου 5 ορόφων και μια ομάδα 10 ατόμων εργάστηκε σε ένα άλλο παρόμοιο κτίριο. Η κατασκευή του πρώτου κτιρίου κράτησε 20 ημέρες, το δεύτερο χτίστηκε σε 10 ημέρες. Πού είναι υψηλότερη η δραστηριότητα των εργαζομένων;

Βασικά στοιχεία της ποσοτικοποίησης της ενζυμικής δραστηριότητας

1. Η ενζυμική δραστηριότητα εκφράζεται στον ρυθμό συσσώρευσης του προϊόντος ή στο ρυθμό απώλειας του υποστρώματος ως προς την ποσότητα του υλικού που περιέχει το ένζυμο.

Στην πράξη συνήθως χρησιμοποιούν:

μονάδες ποσότητας μιας ουσίας - mole (και τα παράγωγά της mmol, μmol), γραμμάριο (kg, mg),
μονάδες χρόνου - λεπτό, ώρα, δευτερόλεπτο,
μονάδες μάζας ή όγκου - γραμμάριο (kg, mg), λίτρο (ml).

Άλλα παράγωγα χρησιμοποιούνται επίσης ενεργά - catal (mol/s), η διεθνής μονάδα δραστηριότητας (IU, Unit) αντιστοιχεί σε μmol/min.

Έτσι, η ενζυμική δραστηριότητα μπορεί να εκφραστεί, για παράδειγμα, σε mmol/s×l, g/h×l, IU/l, cat/ml, κ.λπ.

Για παράδειγμα, είναι γνωστό

2. Δημιουργία τυπικών συνθηκών ώστε να μπορούν να συγκριθούν τα αποτελέσματα που λαμβάνονται σε διαφορετικά εργαστήρια - βέλτιστο pH και σταθερή θερμοκρασία, για παράδειγμα, 25 ° C ή 37 ° C, παρατηρώντας το χρόνο επώασης του υποστρώματος με το ένζυμο.

Ενζυμική δραστηριότητα.Κάτω από ενζυμική δραστηριότητα κατανοήσουν την ποσότητα του που καταλύει τον μετασχηματισμό μιας ορισμένης ποσότητας υποστρώματος ανά μονάδα χρόνου. Για να εκφραστεί η δραστηριότητα των ενζυμικών παρασκευασμάτων, χρησιμοποιούνται δύο εναλλακτικές μονάδες: η διεθνής (IU) και η καταλ (cat). Πίσω διεθνή μονάδα δραστηριότητας Η ποσότητα του ενζύμου που λαμβάνεται είναι τέτοια που καταλύει τη μετατροπή 1 μmol υποστρώματος σε προϊόν σε 1 λεπτό υπό τυπικές συνθήκες (συνήθως βέλτιστες). Ένας έκανε πατινάζ υποδηλώνει την ποσότητα του ενζύμου που καταλύει τη μετατροπή 1 mol υποστρώματος σε 1 s (1 γάτα = 6 ∙ 10 7 IU). Στη διμοριακή αντίδραση A + B = C + D, ως μονάδα ενζυμικής δραστηριότητας λαμβάνεται η ποσότητα που καταλύει τη μετατροπή 1 μmol Α ή Β ή 2 μmol Α (αν Β = Α), σε 1 λεπτό .

Συχνά τα ενζυμικά παρασκευάσματα χαρακτηρίζονται από ειδική δράση, η οποία αντανακλά τον βαθμό καθαρισμού του ενζύμου. Συγκεκριμένη δραστηριότητα είναι ο αριθμός των μονάδων ενζυμικής δραστηριότητας ανά 1 mg πρωτεΐνης.

Μοριακή δραστηριότητα (αριθμός κύκλου εργασιών ενζύμου) - ο αριθμός των μορίων του υποστρώματος που μετατρέπονται από ένα μόριο ενζύμου σε 1 λεπτό όταν το ένζυμο είναι πλήρως κορεσμένο με το υπόστρωμα. Είναι ίσος με τον αριθμό των μονάδων ενζυμικής δραστηριότητας διαιρεμένος με την ποσότητα του ενζύμου που εκφράζεται σε μικρογραμμομόρια. Η έννοια της μοριακής δραστηριότητας ισχύει μόνο για καθαρά ένζυμα.

Όταν είναι γνωστός ο αριθμός των ενεργών κέντρων σε ένα μόριο ενζύμου, εισάγεται η έννοια δραστηριότητα του καταλυτικού κέντρου . Χαρακτηρίζεται από τον αριθμό των μορίων του υποστρώματος που υφίστανται μετασχηματισμό σε 1 λεπτό ανά ενεργό κέντρο.

Η δραστηριότητα των ενζύμων εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τις εξωτερικές συνθήκες, μεταξύ των οποίων η θερμοκρασία και το pH του περιβάλλοντος είναι υψίστης σημασίας. Μια αύξηση της θερμοκρασίας στην περιοχή 0−50°C συνήθως οδηγεί σε ομαλή αύξηση της ενζυμικής δραστηριότητας, η οποία σχετίζεται με την επιτάχυνση του σχηματισμού του συμπλέγματος ενζύμου-υποστρώματος και όλα τα επακόλουθα καταλυτικά γεγονότα. Για κάθε αύξηση της θερμοκρασίας κατά 10°C, ο ρυθμός αντίδρασης διπλασιάζεται περίπου (κανόνας van't Hoff). Ωστόσο, μια περαιτέρω αύξηση της θερμοκρασίας (>50°C) συνοδεύεται από αύξηση της ποσότητας του αδρανοποιημένου ενζύμου λόγω μετουσίωσης του πρωτεϊνικού του τμήματος, η οποία εκφράζεται σε μείωση της δραστικότητας. Κάθε ένζυμο χαρακτηρίζεται βέλτιστη θερμοκρασία– την τιμή θερμοκρασίας στην οποία καταγράφεται η μεγαλύτερη δραστηριότητά του.

Η εξάρτηση της ενζυμικής δραστηριότητας από την τιμή του pH του μέσου είναι πολύπλοκη. Κάθε ένζυμο χαρακτηρίζεται βέλτιστο pH περιβάλλον, στο οποίο παρουσιάζει τη μέγιστη δραστηριότητα. Καθώς απομακρύνεστε από αυτήν την τιμή προς τη μία ή την άλλη κατεύθυνση, η ενζυματική δραστηριότητα μειώνεται. Αυτό εξηγείται από μια αλλαγή στην κατάσταση του ενεργού κέντρου του ενζύμου (μείωση ή αύξηση του ιονισμού λειτουργικών ομάδων), καθώς και από την τριτοταγή δομή ολόκληρου του μορίου πρωτεΐνης, η οποία εξαρτάται από την αναλογία κατιονικού και ανιονικού επικεντρώνεται σε αυτό. Τα περισσότερα ένζυμα έχουν βέλτιστο pH στο ουδέτερο εύρος. Ωστόσο, υπάρχουν ένζυμα που παρουσιάζουν μέγιστη δράση σε pH 1,5 (πεψίνη) ή 9,5 (αργινάση). Όταν εργάζεστε με ένζυμα, είναι απαραίτητο να διατηρείται το pH χρησιμοποιώντας κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα.

Η ενζυμική δραστηριότητα υπόκειται σε σημαντικές διακυμάνσεις ανάλογα με την έκθεση αναστολείς(ουσίες που μειώνουν εν μέρει ή πλήρως τη δραστηριότητα) και ενεργοποιητές(ουσίες που αυξάνουν τη δραστηριότητα). Το ρόλο τους παίζουν κατιόντα μετάλλων, ορισμένα ανιόντα, φορείς φωσφορικών ομάδων, αναγωγικά ισοδύναμα, συγκεκριμένες πρωτεΐνες, ενδιάμεσα και τελικά προϊόντα μεταβολισμού κ.λπ.

Αρχές ενζυματικής κινητικής.Η ουσία των κινητικών μελετών είναι να προσδιοριστεί ο μέγιστος ρυθμός μιας ενζυμικής αντίδρασης ( V max) και σταθερές Michaelis K M. Η ενζυμική κινητική μελετά τους ρυθμούς ποσοτικών μετασχηματισμών ορισμένων ουσιών σε άλλες υπό τη δράση ενζύμων. Ο ρυθμός μιας ενζυμικής αντίδρασης μετριέται με την απώλεια υποστρώματος ή την αύξηση του προκύπτοντος προϊόντος ανά μονάδα χρόνου ή με μια αλλαγή στη συγκέντρωση μιας από τις παρακείμενες μορφές συνενζύμου.

Επιρροή συγκέντρωση ενζύμουο ρυθμός αντίδρασης εκφράζεται ως εξής: εάν η συγκέντρωση του υποστρώματος είναι σταθερή (υπό την προϋπόθεση ότι υπάρχει περίσσεια υποστρώματος), τότε ο ρυθμός αντίδρασης είναι ανάλογος της συγκέντρωσης του ενζύμου. Για κινητικές μελέτες, χρησιμοποιείται συγκέντρωση ενζύμου 10 - 8 Μ ενεργών θέσεων. Η βέλτιστη τιμή της συγκέντρωσης του ενζύμου προσδιορίζεται από ένα γράφημα της εξάρτησης της δραστηριότητας του ενζύμου από τη συγκέντρωσή του. Η βέλτιστη τιμή θεωρείται ότι βρίσκεται στο οροπέδιο του γραφήματος που προκύπτει στο εύρος των τιμών της ενζυμικής δραστηριότητας που εξαρτώνται ελαφρώς από τη συγκέντρωσή του (Εικ. 4.3).

Ρύζι. 4.3. Εξάρτηση του ρυθμού της ενζυμικής αντίδρασης

στη συγκέντρωση του ενζύμου

Να μελετήσει την επιρροή συγκέντρωση υποστρώματοςγια να προσδιορίσετε τον ρυθμό μιας ενζυματικής αντίδρασης, κατασκευάστε πρώτα μια κινητική καμπύλη που αντανακλά την αλλαγή στη συγκέντρωση του υποστρώματος (S 1) ή του προϊόντος (P 1) με την πάροδο του χρόνου (Εικ. 4.4) και μετρήστε την αρχική ταχύτητα ( V 1) αντιδράσεις ως η εφαπτομένη της γωνίας κλίσης της εφαπτομένης στην καμπύλη στο σημείο μηδέν.

Ρύζι. 4.4. Κινητικές καμπύλες ενζυμικής αντίδρασης

Κατασκευάζοντας κινητικές καμπύλες για άλλες συγκεντρώσεις ενός δεδομένου υποστρώματος (S 2, S 3, S 4, κ.λπ.) ή προϊόντος (P 2, P 3, P 4, κ.λπ.) και προσδιορίζοντας τους αρχικούς ρυθμούς ( V 2, V 3 , V 4, κ.λπ.) αντιδράσεις, κατασκευάστε μια γραφική παράσταση της εξάρτησης της αρχικής ταχύτητας της ενζυματικής αντίδρασης από τη συγκέντρωση του υποστρώματος (σε σταθερή συγκέντρωση του ενζύμου), που έχει τη μορφή υπερβολής (Εικ. 4.5).

Ρύζι. 4.5. Εξάρτηση του αρχικού ρυθμού μιας ενζυμικής αντίδρασης

στη συγκέντρωση του υποστρώματος

Η κινητική πολλών ενζυματικών αντιδράσεων περιγράφεται από την εξίσωση Michaelis–Menten. Σε σταθερή συγκέντρωση ενζύμου και χαμηλές συγκεντρώσεις υποστρώματος[S] ο αρχικός ρυθμός αντίδρασης είναι ευθέως ανάλογος του [S] (Εικ. 4.5). Σε αυτή την περίπτωση, μιλάμε για μισό κορεσμό του ενζύμου με το υπόστρωμα, όταν τα μισά από τα μόρια του ενζύμου έχουν τη μορφή συμπλόκου ενζύμου-υποστρώματος και ο ρυθμός αντίδρασης V = 1/2VΜέγιστη. Όσον αφορά το υπόστρωμα, η αντίδραση είναι 1ης τάξης (ο ρυθμός αντίδρασης είναι ευθέως ανάλογος με τη συγκέντρωση ενός αντιδρώντος) ή 2ης τάξης (ο ρυθμός αντίδρασης είναι ανάλογος με το προϊόν των συγκεντρώσεων των δύο αντιδρώντων).

Στο υψηλές αξίες συγκέντρωση υποστρώματος[S] ο ρυθμός αντίδρασης είναι σχεδόν ανεξάρτητος από το [S]: με περαιτέρω αύξηση του [S], ο ρυθμός αντίδρασης αυξάνεται όλο και πιο αργά και τελικά γίνεται σταθερός (μέγιστος) (Εικ. 4.5). Στην περίπτωση αυτή, επιτυγχάνεται πλήρης κορεσμός του ενζύμου με το υπόστρωμα, όταν όλα τα μόρια του ενζύμου έχουν τη μορφή συμπλόκου ενζύμου-υποστρώματος και V = VΜέγιστη.

Σε σχέση με το υπόστρωμα, η αντίδραση έχει 0ης τάξης (ο ρυθμός αντίδρασης δεν εξαρτάται από τη συγκέντρωση των αντιδρώντων).

Το 1913, ο L. Michaelis και ο M. Menten πρότειναν ένα απλό μοντέλο για να εξηγήσουν τέτοιες κινητικές. Σύμφωνα με αυτό το μοντέλο, ο σχηματισμός ενός συγκεκριμένου συμπλόκου ενζύμου-υποστρώματος είναι ένα απαραίτητο ενδιάμεσο βήμα στην κατάλυση. 1 Το 1913, ο L. Michaelis και ο M. Menten πρότειναν ένα απλό μοντέλο για να εξηγήσουν τέτοιες κινητικές. Σύμφωνα με αυτό το μοντέλο, ο σχηματισμός ενός συγκεκριμένου συμπλόκου ενζύμου-υποστρώματος είναι ένα απαραίτητο ενδιάμεσο βήμα στην κατάλυση. 3

E + S ⇄ ES → E + P Το 1913, ο L. Michaelis και ο M. Menten πρότειναν ένα απλό μοντέλο για να εξηγήσουν τέτοιες κινητικές. Σύμφωνα με αυτό το μοντέλο, ο σχηματισμός ενός συγκεκριμένου συμπλόκου ενζύμου-υποστρώματος είναι ένα απαραίτητο ενδιάμεσο βήμα στην κατάλυση.Το ένζυμο Ε συνδυάζεται με το υπόστρωμα S, σχηματίζοντας το σύμπλεγμα ES. Η σταθερά ρυθμού για αυτή τη διαδικασία είναι Το 1913, ο L. Michaelis και ο M. Menten πρότειναν ένα απλό μοντέλο για να εξηγήσουν τέτοιες κινητικές. Σύμφωνα με αυτό το μοντέλο, ο σχηματισμός ενός συγκεκριμένου συμπλόκου ενζύμου-υποστρώματος είναι ένα απαραίτητο ενδιάμεσο βήμα στην κατάλυση. 1 . Η μοίρα του συμπλέγματος ES είναι διπλή: μπορεί είτε να διαχωριστεί στο ένζυμο Ε και στο υπόστρωμα S με σταθερά ταχύτητας Το 1913, ο L. Michaelis και ο M. Menten πρότειναν ένα απλό μοντέλο για να εξηγήσουν τέτοιες κινητικές. Σύμφωνα με αυτό το μοντέλο, ο σχηματισμός ενός συγκεκριμένου συμπλόκου ενζύμου-υποστρώματος είναι ένα απαραίτητο ενδιάμεσο βήμα στην κατάλυση. 2, ή υφίστανται περαιτέρω μετασχηματισμό, σχηματίζοντας το προϊόν Ρ και το ελεύθερο ένζυμο Ε, με σταθερά ταχύτητας

3. Υποτίθεται ότι το προϊόν της αντίδρασης δεν μετατρέπεται στο αρχικό υπόστρωμα. Αυτή η προϋπόθεση πληρούται στο αρχικό στάδιο της αντίδρασης, ενώ η συγκέντρωση του προϊόντος είναι χαμηλή. Ο ρυθμός κατάλυσης προσδιορίζεται σεσυνθήκες νοσηλείας

, όταν η συγκέντρωση των ενδιάμεσων προϊόντων παραμένει σταθερή, ενώ η συγκέντρωση των αρχικών ουσιών και των τελικών προϊόντων ποικίλλει. Αυτό συμβαίνει όταν ο ρυθμός σχηματισμού του συμπλέγματος ES είναι ίσος με τον ρυθμό διάσπασής του. Μπορείτε να εισάγετε μια νέα σταθερά K M -Μιχάλης σταθερός

(mol/l), που ισούται μεΕξίσωση Michaelis–Menten

(4.2)

, που εκφράζει την ποσοτική σχέση μεταξύ του ρυθμού της ενζυματικής αντίδρασης και της συγκέντρωσης του υποστρώματος, έχει τη μορφή Αυτή η εξίσωση αντιστοιχεί σε ένα γράφημα του ρυθμού αντίδρασης σε σχέση με τη συγκέντρωση του υποστρώματος. Στοχαμηλές συγκεντρώσεις υποστρώματος V = V, όταν το [S] είναι πολύ χαμηλότερο από το K M, max [S] / K M, δηλαδή ο ρυθμός αντίδρασης είναι ευθέως ανάλογος με τη συγκέντρωση του υποστρώματος. Στουψηλές συγκεντρώσεις υποστρώματος V = V max, δηλαδή ο ρυθμός αντίδρασης είναι μέγιστος και δεν εξαρτάται από τη συγκέντρωση του υποστρώματος.

Αν [S] = K M, τότε V = Vμέγ./2.

Έτσι, ο Κ Μ ίση με τη συγκέντρωση του υποστρώματος στην οποία ο ρυθμός αντίδρασης είναι ο μισός του μέγιστου.

Σταθερά Michaelis (K M) και μέγιστος ρυθμός αντίδρασης ( V max) είναι σημαντικά χαρακτηριστικά ταχύτητας σε διαφορετικές συγκεντρώσεις υποστρώματος. V max – μια σταθερή τιμή για κάθε ένζυμο σας επιτρέπει να αξιολογήσετε την αποτελεσματικότητα της δράσης του.

Η σταθερά Michaelis δείχνει τη συγγένεια του υποστρώματος για το ένζυμο (στην περίπτωση που Το 1913, ο L. Michaelis και ο M. Menten πρότειναν ένα απλό μοντέλο για να εξηγήσουν τέτοιες κινητικές. Σύμφωνα με αυτό το μοντέλο, ο σχηματισμός ενός συγκεκριμένου συμπλόκου ενζύμου-υποστρώματος είναι ένα απαραίτητο ενδιάμεσο βήμα στην κατάλυση. 2 >> Το 1913, ο L. Michaelis και ο M. Menten πρότειναν ένα απλό μοντέλο για να εξηγήσουν τέτοιες κινητικές. Σύμφωνα με αυτό το μοντέλο, ο σχηματισμός ενός συγκεκριμένου συμπλόκου ενζύμου-υποστρώματος είναι ένα απαραίτητο ενδιάμεσο βήμα στην κατάλυση. 3): όσο μικρότερο είναι το KM, τόσο μεγαλύτερη είναι η συγγένεια και τόσο υψηλότερος ο ρυθμός αντίδρασης και αντίστροφα. Κάθε υπόστρωμα χαρακτηρίζεται από τη δική του τιμή KM για ένα δεδομένο ένζυμο και οι τιμές τους μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να κριθεί η εξειδίκευση του υποστρώματος του ενζύμου. Η σταθερά Michaelis εξαρτάται από τη φύση του υποστρώματος, τη θερμοκρασία, το pH, την ιοντική ισχύ του διαλύματος και την παρουσία αναστολέων.

Λόγω του ότι ο ορισμός V max και K M απευθείας από τη γραφική σχέση Michaelis–Menten (Εικ. 4.5) είναι διφορούμενη, καταφεύγουν στη γραμμικοποίηση αυτής της εξίσωσης. Για να γίνει αυτό, μετατρέπεται σε τέτοια μορφή που μπορεί να εκφραστεί γραφικά ως ευθεία γραμμή. Υπάρχουν πολλές μέθοδοι γραμμικοποίησης, μεταξύ των οποίων χρησιμοποιούνται συχνότερα οι μέθοδοι Lineweaver–Burk και Edy–Hofstee.

Μετατροπή Lineweaver–Burk μοιάζει με

(4.3)

Δημιουργήστε ένα γράφημα εξάρτησης 1/ V = φά(1/[S]) και πάρτε μια ευθεία, η τομή της οποίας με τον άξονα y δίνει την τιμή 1/ VΜέγιστη ; το τμήμα που αποκόπτεται από την ευθεία στον άξονα της τετμημένης δίνει την τιμή −1/K M και η εφαπτομένη της γωνίας κλίσης της ευθείας στον άξονα της τετμημένης είναι ίση με K M / V max (Εικ. 4.6). Αυτό το γράφημα σας επιτρέπει να προσδιορίσετε με μεγαλύτερη ακρίβεια VΜέγιστη. Όπως θα δούμε παρακάτω, πολύτιμες πληροφορίες σχετικά με την αναστολή της ενζυμικής δραστηριότητας μπορούν επίσης να συλλεχθούν από αυτό το γράφημα.

Ρύζι. 4.6. Μέθοδος γραμμικοποίησης για την εξίσωση Michaelis–Menten

(σύμφωνα με το Lineweaver - Burke)

Μέθοδος Edie–Hofstee βασίζεται στον μετασχηματισμό της εξίσωσης Michaelis–Menten πολλαπλασιάζοντας και τις δύο πλευρές επί VΜέγιστη:

(4.4)

Γράφημα σε συντεταγμένες VΚαι VΗ /[S] είναι μια ευθεία γραμμή, η τομή της οποίας με τον άξονα y δίνει την τιμή V max και το τμήμα που αποκόπτεται από την ευθεία στον άξονα της τετμημένης είναι η τιμή V max /K M (Εικ. 4.7). Καθιστά πολύ εύκολο τον προσδιορισμό του K M και V max και επίσης να προσδιορίσει πιθανές αποκλίσεις από τη γραμμικότητα που δεν εντοπίστηκαν στο προηγούμενο γράφημα.

Ρύζι. 4.7. Μέθοδος γραμμικοποίησης για την εξίσωση Michaelis–Menten

(σύμφωνα με τον Edi – Hofstee)

Αναστολή της ενζυμικής δραστηριότητας.Η δράση των ενζύμων μπορεί να ανασταλεί πλήρως ή μερικώς από ορισμένες χημικές ουσίες - αναστολείς . Με βάση τη φύση της δράσης τους, οι αναστολείς χωρίζονται σε αναστρέψιμους και μη αναστρέψιμους. Αυτή η διαίρεση βασίζεται στην ισχύ δέσμευσης του αναστολέα με το ένζυμο.

Αναστρέψιμοι αναστολείς - πρόκειται για ενώσεις που αλληλεπιδρούν μη ομοιοπολικά με το ένζυμο και όταν αφαιρεθούν, η ενζυμική δραστηριότητα αποκαθίσταται. Η αναστρέψιμη αναστολή μπορεί να είναι ανταγωνιστική, μη ανταγωνιστική ή μη ανταγωνιστική.

Παράδειγμα ανταγωνιστική αναστολήείναι η επίδραση δομικών αναλόγων του υποστρώματος, τα οποία μπορούν να συνδεθούν στο ενεργό κέντρο του ενζύμου με παρόμοιο τρόπο όπως το υπόστρωμα, χωρίς ωστόσο να μετατραπούν σε προϊόν και να εμποδίσουν την αλληλεπίδραση του ενζύμου με το αληθινό υπόστρωμα, δηλαδή υπάρχει ανταγωνισμός μεταξύ του υποστρώματος και του αναστολέα για δέσμευση στο ενεργό κέντρο του ενζύμου. Ως αποτέλεσμα του σχηματισμού συμπλοκών ενζύμου-αναστολέα (EI), η συγκέντρωση των συμπλοκών ES μειώνεται και, ως αποτέλεσμα, μειώνεται ο ρυθμός αντίδρασης. Με άλλα λόγια, ένας ανταγωνιστικός αναστολέας μειώνει τον ρυθμό κατάλυσης μειώνοντας την αναλογία των μορίων ενζύμου που δεσμεύουν το υπόστρωμα.

Η μέτρηση των ρυθμών αντίδρασης σε διαφορετικές συγκεντρώσεις υποστρώματος επιτρέπει σε κάποιον να διακρίνει την ανταγωνιστική από τη μη ανταγωνιστική αναστολή. Με ανταγωνιστική αναστολή στο γράφημα εξάρτησης 1/ V=φά(1/[S]) ευθείες τέμνουν τον άξονα τεταγμένων σε ένα σημείο 1/ V max ανεξάρτητα από την παρουσία αναστολέα, αλλά παρουσία αναστολέα αυξάνεται η εφαπτομένη της γωνίας κλίσης της ευθείας στον άξονα της τετμημένης, δηλ. VΤο max δεν αλλάζει, αλλά το KM αυξάνεται, υποδηλώνοντας μείωση της συγγένειας του υποστρώματος για το ένζυμο παρουσία ενός αναστολέα (Εικ. 4.8). Συνεπώς, σε επαρκώς υψηλή συγκέντρωση του υποστρώματος υπό συνθήκες ανταγωνισμού για την ενεργό θέση του ενζύμου, όταν το υπόστρωμα εκτοπίζει τον αναστολέα από τη δραστική θέση, η αναστολή μπορεί να εξαλειφθεί και ο ρυθμός της καταλυόμενης αντίδρασης αποκαθίσταται. Σε αυτή την περίπτωση, η εξίσωση Michaelis–Menten έχει τη μορφή

(4.5)

όπου [I] είναι η συγκέντρωση του αναστολέα. κ Εγώ – σταθερά αναστολής.

Η σταθερά αναστολής χαρακτηρίζει τη συγγένεια του ενζύμου για τον αναστολέα και είναι η σταθερά διάστασης του συμπλόκου ΕΙ:

(4.6)

Με την παρουσία ενός ανταγωνιστικού αναστολέα, η εφαπτομένη της γωνίας κλίσης της ευθείας στον άξονα x αυξάνεται κατά το ποσό (1 + [I]/ κ Εγώ).

Ρύζι. 4.8. Ανταγωνιστική αναστολή:

α – διάγραμμα· β – γραφική έκφραση σύμφωνα με το Lineweaver - Burke

Στο μη ανταγωνιστική αναστολήο αναστολέας διαφέρει στη δομή από το υπόστρωμα και δεν συνδέεται με το ενεργό, αλλά με το αλλοστερικό κέντρο του ενζύμου. Αυτό οδηγεί σε αλλαγή της διαμόρφωσης του ενεργού κέντρου του ενζύμου, η οποία συνοδεύεται από μείωση της καταλυτικής δραστηριότητας του ενζύμου. Επιπλέον, ο αναστολέας μπορεί να συνδεθεί όχι μόνο στο ελεύθερο ένζυμο (E + I → EI), αλλά και στο σύμπλεγμα ενζύμου-υποστρώματος (ES + I → ESI). Και οι δύο μορφές EI και ESI είναι ανενεργές. Το υπόστρωμα και ο αναστολέας μπορούν να συνδεθούν ταυτόχρονα από το μόριο του ενζύμου, αλλά οι θέσεις δέσμευσής τους δεν επικαλύπτονται. Το αποτέλεσμα ενός μη ανταγωνιστικού αναστολέα είναι να μειώνει τον αριθμό των ενζυμικών ανατροπών και όχι να μειώνει την αναλογία των μορίων ενζύμου που δεσμεύουν το υπόστρωμα. Ο αναστολέας δεν εμποδίζει το σχηματισμό συμπλόκων ES, αλλά αναστέλλει τη μετατροπή του υποστρώματος στο προϊόν. συνεπώς VΤο max μειώνεται, δηλαδή, παρουσία ενός αναστολέα, η τομή της ευθείας με τον άξονα τεταγμένων θα συμβεί σε υψηλότερο σημείο (Εικ. 4.9). Η εφαπτομένη της γωνίας κλίσης της ευθείας στον άξονα της τετμημένης αυξάνεται στον ίδιο βαθμό, ίση με K M / Vμάξι φόρεμα. Κ Μ σε αντίθεση με VΤο max δεν αλλάζει, επομένως η μη ανταγωνιστική αναστολή δεν μπορεί να εξαλειφθεί αυξάνοντας τη συγκέντρωση του υποστρώματος.

Ρύζι. 4.9. Μη ανταγωνιστική αναστολή:

α – διάγραμμα· β – γραφική έκφραση κατά Lineweaver – Burke

Μέγιστη ταχύτητα αντίδρασης VΤο max I παρουσία ενός μη ανταγωνιστικού αναστολέα περιγράφεται από την εξίσωση

(4.7)

Σε ειδική περίπτωση μη ανταγωνιστική αναστολή, όταν ο αναστολέας συνδέεται μόνο με το σύμπλεγμα ES και δεν συνδέεται με το ελεύθερο ένζυμο, στο γράφημα εξάρτησης 1/ V = φάΟι ευθείες (1/[S]) είναι παράλληλες μεταξύ τους και τέμνουν τους άξονες τεταγμένων και τετμημένης σε διαφορετικά σημεία (Εικ. 4.10).

Ρύζι. 4.10. Μη ανταγωνιστική αναστολή:

α – διάγραμμα· β – γραφική έκφραση κατά Lineweaver – Burke

Μη αναστρέψιμοι αναστολείς είναι εξαιρετικά αντιδραστικές ενώσεις διαφόρων χημικών φύσεων που μπορούν να αλληλεπιδράσουν με λειτουργικά σημαντικές ομάδες του ενεργού κέντρου, σχηματίζοντας ισχυρούς ομοιοπολικούς δεσμούς. Αυτό οδηγεί σε μη αναστρέψιμη απώλεια της ενζυμικής δραστηριότητας. Από αυτή την άποψη, η θεωρία Michaelis-Menten, που βασίζεται στην υπόθεση ότι η προσθήκη ενός αναστολέα στο ένζυμο είναι αναστρέψιμη, δεν είναι εφαρμόσιμη σε αυτή την περίπτωση.

Παράδειγμα μη αναστρέψιμης αναστολής είναι η αλληλεπίδραση ενζύμων με ιόντα βαρέων μετάλλων, τα οποία προσκολλώνται στις σουλφυδρυλικές ομάδες υπολειμμάτων κυστεΐνης του ενζύμου και σχηματίζουν μερκαπτίδια - πρακτικά μη διαχωριστικές ενώσεις ή ομοιοπολική τροποποίηση του ενζύμου υπό την επίδραση της αλκυλίωσης πράκτορες.

(ενεργοποιητές - αύξηση, αναστολείς - μείωση) Τα πρωτεϊνικά ένζυμα συντίθενται στα ριβοσώματα και το RNA - στον πυρήνα.

Οι όροι «ένζυμο» και «ένζυμο» χρησιμοποιούνται εδώ και καιρό ως συνώνυμα (ο πρώτος κυρίως στη ρωσική και γερμανική επιστημονική βιβλιογραφία, ο δεύτερος στα αγγλικά και στα γαλλικά).
Η επιστήμη των ενζύμων ονομάζεται ενζυμολογία, και όχι ενζυμολογία (για να μην ανακατεύονται οι ρίζες των λέξεων στα λατινικά και στα ελληνικά).

Ιστορικό της μελέτης

Ορος ένζυμοπου προτάθηκε τον 17ο αιώνα από τον χημικό van Helmont όταν συζητούσε τους μηχανισμούς της πέψης.

Σε συν. XVIII - νωρίς XIX αιώνες ήταν ήδη γνωστό ότι το κρέας αφομοιώνεται από το γαστρικό υγρό και το άμυλο μετατρέπεται σε ζάχαρη υπό τη δράση του σάλιου. Ωστόσο, ο μηχανισμός αυτών των φαινομένων ήταν άγνωστος

Τα ένζυμα χρησιμοποιούνται ευρέως στην εθνική οικονομία - βιομηχανίες τροφίμων, κλωστοϋφαντουργίας και στη φαρμακολογία.

Ταξινόμηση ενζύμων

Με βάση τον τύπο των αντιδράσεων που καταλύουν, τα ένζυμα χωρίζονται σε 6 κατηγορίες σύμφωνα με την ιεραρχική ταξινόμηση των ενζύμων (CF, Enzyme Commission code). Η ταξινόμηση προτάθηκε από τη Διεθνή Ένωση Βιοχημείας και Μοριακής Βιολογίας. Κάθε κατηγορία περιέχει υποκατηγορίες, έτσι ώστε το ένζυμο να περιγράφεται από ένα σύνολο τεσσάρων αριθμών που χωρίζονται με τελείες. Για παράδειγμα, η πεψίνη έχει την ονομασία ΕΕ 3.4.23.1. Ο πρώτος αριθμός περιγράφει χονδρικά τον μηχανισμό της αντίδρασης που καταλύεται από το ένζυμο:

CF 1: Οξειδορεδουκτάσες, καταλύοντας οξείδωση ή αναγωγή. Παράδειγμα: καταλάση, αλκοολική αφυδρογονάση
CF 2: Μεταγραφές, καταλύοντας τη μεταφορά χημικών ομάδων από ένα μόριο υποστρώματος σε ένα άλλο. Μεταξύ των τρανσφερασών, διακρίνονται ιδιαίτερα οι κινάσες που μεταφέρουν μια φωσφορική ομάδα, συνήθως από ένα μόριο ΑΤΡ.
CF 3: Υδρολάσες, καταλύοντας την υδρόλυση των χημικών δεσμών. Παράδειγμα: εστεράση, πεψίνη, θρυψίνη, αμυλάση, λιποπρωτεϊνική λιπάση
CF 4: Λυάσες, καταλύοντας τη διάσπαση χημικών δεσμών χωρίς υδρόλυση με το σχηματισμό διπλού δεσμού σε ένα από τα προϊόντα.
CF 5: Ισομεράσες, καταλύοντας δομικές ή γεωμετρικές αλλαγές στο μόριο του υποστρώματος.
CF 6: Λιγκάσες, καταλύοντας το σχηματισμό χημικών δεσμών μεταξύ των υποστρωμάτων λόγω της υδρόλυσης ATP. Παράδειγμα: DNA πολυμεράση

Κινητικές μελέτες

Καμπύλη κορεσμού μιας χημικής αντίδρασης που απεικονίζει τη σχέση μεταξύ συγκέντρωσης υποστρώματος [S] και ταχύτητας αντίδρασης v

Η απλούστερη περιγραφή της κινητικής των ενζυματικών αντιδράσεων ενός υποστρώματος είναι η εξίσωση Michaelis-Menten (βλ. σχήμα). Μέχρι σήμερα, έχουν περιγραφεί αρκετοί μηχανισμοί ενζυμικής δράσης. Για παράδειγμα, η δράση πολλών ενζύμων περιγράφεται από τον μηχανισμό του πινγκ-πονγκ.

Δομή και μηχανισμός δράσης των ενζύμων

Η δραστηριότητα των ενζύμων καθορίζεται από την τρισδιάστατη δομή τους.

Όπως όλες οι πρωτεΐνες, τα ένζυμα συντίθενται με τη μορφή μιας γραμμικής αλυσίδας αμινοξέων, η οποία αναδιπλώνεται με συγκεκριμένο τρόπο. Κάθε αλληλουχία αμινοξέων αναδιπλώνεται με έναν ειδικό τρόπο και το μόριο που προκύπτει (σφαιρίδιο πρωτεΐνης) έχει μοναδικές ιδιότητες. Πολλές αλυσίδες πρωτεΐνης μπορούν να συνδυαστούν για να σχηματίσουν ένα πρωτεϊνικό σύμπλεγμα. Η τριτογενής δομή των πρωτεϊνών καταστρέφεται από τη θερμότητα ή την έκθεση σε ορισμένες χημικές ουσίες.

Για να καταλύσει μια αντίδραση, ένα ένζυμο πρέπει να συνδεθεί σε ένα ή περισσότερα υποστρώματα. Η πρωτεϊνική αλυσίδα του ενζύμου αναδιπλώνεται με τέτοιο τρόπο ώστε να σχηματίζεται ένα κενό ή βαθούλωμα στην επιφάνεια του σφαιριδίου όπου συνδέονται τα υποστρώματα. Αυτή η περιοχή ονομάζεται θέση δέσμευσης υποστρώματος. Συνήθως συμπίπτει ή βρίσκεται κοντά στην ενεργό θέση του ενζύμου. Ορισμένα ένζυμα περιέχουν επίσης θέσεις δέσμευσης για συμπαράγοντες ή μεταλλικά ιόντα.

Ορισμένα ένζυμα έχουν μικρές θέσεις δέσμευσης μορίων και μπορεί να είναι υποστρώματα ή προϊόντα της μεταβολικής οδού στην οποία εισέρχεται το ένζυμο. Μειώνουν ή αυξάνουν τη δραστηριότητα του ενζύμου, γεγονός που δημιουργεί την ευκαιρία για ανατροφοδότηση.

Τα ενεργά κέντρα ορισμένων ενζύμων χαρακτηρίζονται από το φαινόμενο της συνεργατικότητας.

Ιδιαιτερότητα

Τα ένζυμα γενικά παρουσιάζουν υψηλή ειδικότητα για τα υποστρώματά τους. Αυτό επιτυγχάνεται με μερική συμπληρωματικότητα μεταξύ του σχήματος, της κατανομής φορτίου και των υδρόφοβων περιοχών στο μόριο του υποστρώματος και της θέσης δέσμευσης του υποστρώματος στο ένζυμο. Τα ένζυμα παρουσιάζουν υψηλά επίπεδα στερεοειδικότητας, τοποεπιλεκτικότητας και χημειοεκλεκτικότητας.

Μοντέλο κλειδαριάς

Εικασία επαγόμενης αλληλογραφίας του Koshland

Μια πιο ρεαλιστική κατάσταση είναι στην περίπτωση της επαγόμενης αλληλογραφίας. Λανθασμένα υποστρώματα - πολύ μεγάλα ή πολύ μικρά - δεν ταιριάζουν στην ενεργή περιοχή

Το 1890, ο Emil Fischer πρότεινε ότι η ειδικότητα των ενζύμων καθορίζεται από την ακριβή αντιστοίχιση μεταξύ του σχήματος του ενζύμου και του υποστρώματος. Αυτή η υπόθεση ονομάζεται μοντέλο κλειδώματος κλειδιού. Το ένζυμο συνδυάζεται με το υπόστρωμα για να σχηματίσει ένα βραχύβιο σύμπλοκο ενζύμου-υποστρώματος. Ωστόσο, αν και αυτό το μοντέλο εξηγεί την υψηλή ειδικότητα των ενζύμων, δεν εξηγεί το φαινόμενο της σταθεροποίησης της μεταβατικής κατάστασης που παρατηρείται στην πράξη.

Μοντέλο επαγόμενης αλληλογραφίας

Το 1958, ο Daniel Koshland πρότεινε μια τροποποίηση του μοντέλου κλειδαριάς. Τα ένζυμα γενικά δεν είναι άκαμπτα, αλλά εύκαμπτα μόρια. Η ενεργή θέση ενός ενζύμου μπορεί να αλλάξει τη διαμόρφωση κατά τη δέσμευση ενός υποστρώματος. Οι πλευρικές ομάδες αμινοξέων της ενεργού θέσης λαμβάνουν μια θέση που επιτρέπει στο ένζυμο να εκτελέσει την καταλυτική του λειτουργία. Σε ορισμένες περιπτώσεις, το μόριο του υποστρώματος αλλάζει επίσης τη διαμόρφωση μετά τη δέσμευση στο ενεργό σημείο. Σε αντίθεση με το μοντέλο κλειδώματος κλειδιού, το μοντέλο επαγόμενης προσαρμογής εξηγεί όχι μόνο την ειδικότητα των ενζύμων, αλλά και τη σταθεροποίηση της μεταβατικής κατάστασης.

Τροποποιήσεις

Πολλά ένζυμα υφίστανται τροποποιήσεις μετά τη σύνθεση της πρωτεϊνικής αλυσίδας, χωρίς τις οποίες το ένζυμο δεν εμφανίζει πλήρως τη δραστηριότητά του. Τέτοιες τροποποιήσεις ονομάζονται μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις (επεξεργασία). Ένας από τους πιο συνηθισμένους τύπους τροποποίησης είναι η προσθήκη χημικών ομάδων σε πλευρικά υπολείμματα της πολυπεπτιδικής αλυσίδας. Για παράδειγμα, η προσθήκη ενός υπολείμματος φωσφορικού οξέος ονομάζεται φωσφορυλίωση και καταλύεται από το ένζυμο κινάση. Πολλά ευκαρυωτικά ένζυμα είναι γλυκοζυλιωμένα, δηλαδή τροποποιημένα από ολιγομερή υδατανθρακικής φύσης.

Ένας άλλος κοινός τύπος μετα-μεταφραστικής τροποποίησης είναι η διάσπαση της πολυπεπτιδικής αλυσίδας. Για παράδειγμα, η χυμοθρυψίνη (μια πρωτεάση που εμπλέκεται στην πέψη) λαμβάνεται με διάσπαση μιας πολυπεπτιδικής περιοχής από το χυμοθρυψινογόνο. Το χυμοθρυψινογόνο είναι ένας ανενεργός πρόδρομος της χυμοθρυψίνης και συντίθεται στο πάγκρεας. Η ανενεργή μορφή μεταφέρεται στο στομάχι, όπου μετατρέπεται σε χυμοθρυψίνη. Αυτός ο μηχανισμός είναι απαραίτητος προκειμένου να αποφευχθεί η διάσπαση του παγκρέατος και άλλων ιστών πριν το ένζυμο εισέλθει στο στομάχι. Ο ανενεργός πρόδρομος του ενζύμου ονομάζεται επίσης "ζυμογόνο".

Ενζυμικοί συμπαράγοντες

Ορισμένα ένζυμα εκτελούν την καταλυτική λειτουργία μόνα τους, χωρίς πρόσθετα συστατικά. Ωστόσο, υπάρχουν ένζυμα που απαιτούν μη πρωτεϊνικά συστατικά για να πραγματοποιήσουν την κατάλυση. Οι συμπαράγοντες μπορεί να είναι είτε ανόργανα μόρια (ιόντα μετάλλων, συστάδες σιδήρου-θείου κ.λπ.) είτε οργανικοί (για παράδειγμα,

1. Χαρακτηριστικά των ενζυματικών αντιδράσεων

2. Επίδραση της θερμοκρασίας στην ενζυμική δραστηριότητα

3. Επίδραση του pH στην ενζυμική δραστηριότητα

4. Ενεργοποιητές και αναστολείς ενζύμων

Εγώ. Όλες οι ενζυματικές αντιδράσεις έχουν 4 χαρακτηριστικά

· Υψηλή ενζυμική δραστηριότητα.

· Αναστρεψιμότητα της ενζυμικής δράσης.

· Ειδικότητα της ενζυμικής δράσης.

· Αστάθεια (ευαισθησία).

Υψηλή ενζυμική δραστηριότητα.Τα ένζυμα προκαλούν υψηλό ρυθμό ενζυματικής αντίδρασης, ο οποίος χαρακτηρίζεται από τον αριθμό των ενζυμικών ανατροπών - αυτός είναι ο αριθμός των μορίων του υποστρώματος που μετατρέπονται σε προϊόντα αντίδρασης υπό τη δράση ενός μορίου ενζύμου ανά μονάδα χρόνου. Για παράδειγμα, η αλκοολική αφυδρογονάση έχει δραστηριότητα 4700 μονάδων, η φωσφορυλάση - 50.000 μονάδες, η α-αμυλάση - 16.000 μονάδες.

Αναστρεψιμότητα της ενζυμικής δράσηςπου ιδρύθηκε από τον Danilevsky. Η αναστρεψιμότητα της δράσης του ενζύμου αναφέρεται στον σχηματισμό του συμπλόκου ES και στη διάσπασή του, δηλ. Οι αντιδράσεις που περιλαμβάνουν ένα ένζυμο μπορούν να πάνε τόσο προς μία κατεύθυνση (βιοσύνθεση) όσο και προς την αντίθετη κατεύθυνση (αποσύνθεση).

Ειδικότητα ενζυμικής δράσης- κάθε ένζυμο δρα μόνο στο συγκεκριμένο υπόστρωμα ή ομάδα σχετικών υποστρωμάτων του. Για παράδειγμα, η ινβερτάση δρα στη σακχαρόζη. α-αμυλάση – μόνο για άμυλο και δεξτρίνες. πρωτεάσες - σε πρωτεΐνες.

Υπάρχουν δύο απόψεις που εξηγούν την ειδικότητα της δράσης του ενζύμου. Σύμφωνα με την εικονιστική ιδέα του E. Fischer, «ένα ένζυμο πλησιάζει το υπόστρωμα σαν ένα κλειδί σε μια κλειδαριά», δηλ. Η τοπογραφία της ενεργού θέσης του ενζύμου δεν είναι μόνο πολύ διατεταγμένη, αλλά και σταθερά σταθερή. Η ενεργή θέση ενός ενζύμου αντιστοιχεί στην τοπογραφία ενός μόνο υποστρώματος. Η δεύτερη άποψη, που προτείνεται από τον D. Koshland, είναι η θεωρία της επαγόμενης αντιστοιχίας μεταξύ ενζύμου και υποστρώματος: η διαμόρφωση του ενζύμου, ειδικά το ενεργό κέντρο του, είναι ικανή για ορισμένες τροποποιήσεις. Ανάλογα με τη διαμορφωτική κινητικότητα της ενεργού θέσης, το ένζυμο είναι σε θέση να αλληλεπιδράσει είτε με λίγα είτε με μεγάλη ποικιλία υποστρωμάτων. Με άλλα λόγια, τη στιγμή του σχηματισμού του συμπλέγματος ES, συμβαίνουν αλλαγές στη δομή τόσο του ενζύμου όσο και του υποστρώματος. Ως αποτέλεσμα, προσαρμόζονται μεταξύ τους.

Η ειδικότητα των ενζύμων παίζει σημαντικό ρόλο στη μεταβολική διαδικασία σε έναν ζωντανό οργανισμό. (Εάν το ένζυμο δεν είχε μοναδικές ιδιότητες, τότε δεν θα υπήρχε μεταβολισμός σε έναν ζωντανό οργανισμό)

Με βάση την εξειδίκευση, τα ένζυμα χωρίζονται σε 2 ομάδες:

· Απόλυτη εξειδίκευση - το ένζυμο δρα μόνο σε μια μεμονωμένη ουσία ή καταλύει μόνο έναν συγκεκριμένο μετασχηματισμό αυτής της ουσίας.

· Σχετική ή ομαδική εξειδίκευση - τα ένζυμα δρουν ταυτόχρονα σε πολλά υποστρώματα που έχουν μια σειρά από κοινές δομικές ιδιότητες.

Αστάθεια (ευαισθησία) –Όλα τα ένζυμα είναι ευαίσθητα σε αυξημένη θερμοκρασία και χαμηλές τιμές pH, στις οποίες συμβαίνει απώλεια της ενζυμικής δραστηριότητας.

II. Ο πιο σημαντικός παράγοντας από τον οποίο εξαρτάται η δραστηριότητα του ενζύμου είναι η θερμοκρασία.

Γραφικά, η εξάρτηση του ρυθμού μιας ενζυμικής αντίδρασης από τη θερμοκρασία είναι η εξής:

Στους 0°C, και ακόμη περισσότερο σε θερμοκρασίες κάτω από 0°C, η δράση των περισσότερων ενζύμων σταματά. Μια αύξηση της θερμοκρασίας (καμπύλη 1) πάνω από 0°C προάγει την αύξηση της ενζυμικής δραστηριότητας (αυξάνεται ο αριθμός των συγκρούσεων των ουσιών που αντιδρούν). Σε μια ορισμένη θερμοκρασία το ένζυμο παρουσιάζει μέγιστη δραστηριότητα. Για τα περισσότερα ένζυμα, η βέλτιστη θερμοκρασία λειτουργίας είναι 40-50°C. Μια περαιτέρω αύξηση της θερμοκρασίας οδηγεί σε αδρανοποίηση των ενζύμων (μειωμένη δραστηριότητα) λόγω θερμικής μετουσίωσης του μορίου πρωτεΐνης (καμπύλη 2).

Η μεταβολή του ρυθμού αντίδρασης με κάθε 10°C αύξηση της θερμοκρασίας εκφράζεται με τον συντελεστή θερμοκρασίας Q10. Ο συντελεστής θερμοκρασίας είναι ο λόγος του ρυθμού αντίδρασης σε μια δεδομένη θερμοκρασία v t +10 προς τον ρυθμό αντίδρασης σε θερμοκρασία 10 ° C κάτω από αυτό:

Η τιμή του Q 10 για χημικές αντιδράσεις βρίσκεται στις περιοχές 2-4, για μια ενζυματική αντίδραση - μεταξύ 1 και 2. Το Q 10 των ενζυματικών αντιδράσεων μειώνεται σημαντικά με την αύξηση της θερμοκρασίας.

III. Κάθε ένζυμο ασκεί τη δράση του μέσα σε μια αρκετά στενή ζώνη pH. Η γραφική εξάρτηση της ενζυμικής δραστηριότητας από το pH έχει τη μορφή:

Σε όξινο περιβάλλον, σε χαμηλές τιμές pH, έχει τη μορφή EH 2 +, σε αυτή τη μορφή είναι ανενεργό. Στο βέλτιστο pH, το ένζυμο έχει μέγιστη δραστικότητα και είναι σε μορφή EH. Όταν το μέσο αλκαλοποιείται, το ένζυμο παίρνει τη μορφή Ε.

Η βέλτιστη δραστηριότητα αντιστοιχεί σε μια συγκεκριμένη περιοχή pH και κάθε ένζυμο έχει τη δική του βέλτιστη τιμή pH για δράση (για παράδειγμα, η βακτηριακή α-αμυλάση έχει βέλτιστο pH στο 6 και η μικροσκοπική μυκητιακή α-αμυλάση έχει βέλτιστο pH 4,7). Η βέλτιστη τιμή pH σχετίζεται με τη σύνθεση αμινοξέων των ενζύμων.

Το σχήμα καμπάνας της καμπύλης μπορεί να εξηγηθεί από την αμφοτερική φύση των ενζύμων. οι αύξοντες και φθίνοντες κλάδοι αυτής της καμπύλης είναι τυπικές καμπύλες τιτλοδότησης και καθορίζονται από τις τιμές pK των ιοντικών ομάδων που βρίσκονται στην ενεργό θέση των ενζύμων.

Για τον προσδιορισμό των λειτουργικών ομάδων που περιλαμβάνονται στο ενεργό κέντρο ενός ενζύμου, είναι απαραίτητο να προσδιοριστεί η εξάρτηση της δραστηριότητας αυτού του ενζύμου από το pH σε διαφορετικές θερμοκρασίες και να προσδιοριστεί η τιμή pK. Γνωρίζοντας τις τιμές ΔpK για τους όξινους και αλκαλικούς κλάδους της σχέσης v = f(pH), βρίσκονται λειτουργικές ομάδες που αντιστοιχούν σε αυτήν την τιμή.

IV. Όλες οι ουσίες που συνοδεύουν το ένζυμο κατά τη διάρκεια της αντίδρασης μπορούν να χωριστούν σε ενεργοποιητές, αναστολείς και ουδέτερες ενώσεις.

Ενεργοποιητές– χημικές ενώσεις που αυξάνουν τη δράση των ενζύμων (για παράδειγμα, η γλουταθειόνη ενεργοποιεί τη δράση των πρωτεασών, το NaCl αυξάνει τη δραστηριότητα των αμυλασών). αναστολείς– ενώσεις που καταστέλλουν τη δραστηριότητά τους (για παράδειγμα, η ομάδα –CN καταστέλλει τη δραστηριότητα των αναπνευστικών ενζύμων που βρίσκονται στο σύστημα του κυτοχρώματος) και ουδέτερες ενώσειςδεν έχουν καμία επίδραση στα ένζυμα.

Η διαδικασία αναστολής μπορεί να είναι αναστρεπτόςΚαι μη αναστρεψιμο.

Οι αναστρέψιμοι αναστολείς είναι:

· Ανταγωνιστική δράση - ο αναστολέας αλληλεπιδρά με τις λειτουργικές ομάδες της ενεργού θέσης των ενζύμων. Η αναστολή σε αυτή την περίπτωση εξαρτάται από τη συγκέντρωση του υποστρώματος: εάν το [S] είναι υψηλό, τότε η επίδραση του αναστολέα [I] μπορεί να μην εμφανίζεται. εάν το [S] είναι μικρό, τότε ο αναστολέας μπορεί να εκτοπίσει το υπόστρωμα από τη σύνδεση με το ένζυμο, η δράση του οποίου αναστέλλεται. Το τριμερές σύμπλεγμα ESI δεν σχηματίζεται ποτέ κατά τη διάρκεια της ανταγωνιστικής αναστολής.

· Μη ανταγωνιστική αναστολή παρατηρείται όταν ο αναστολέας δεν είναι σε θέση να προσκολληθεί στο ένζυμο, αλλά δεν μπορεί να συνδεθεί με το σύμπλεγμα ενζύμου-υποστρώματος, μετατρέποντάς το σε ανενεργή μορφή.

· Σε μικτή αναστολή, ο αναστολέας δρα τόσο στη θέση δέσμευσης ES όσο και στην καταλυτική θέση του ενζύμου.