Ensümaatilise aktiivsuse mõõtmine. Ainevahetus ja ensüümid

Ensüümide mõiste

Ensüümid (ensüümid) on lahustuvad või membraaniga seotud valgud, millel on katalüütiline aktiivsus. ( Lisaks valkudele võivad mõned RNA-d (ribosüümid) ja antikehad (absüümid) avaldada kehas katalüütilist aktiivsust, kuid need on tuhandeid kordi vähem tõhusad kui ensüümid.) Need nimetused pärinevad ladinakeelsest sõnast "fermentatio" - fermentatsioon ja kreeka " en zym” - juuretise sees . Need meenutavad esimesi ensüümide allikaid. Biokeemiat, mis uurib ensüüme, nimetatakse ensümoloogia. Diagrammides ja reaktsioonivõrrandites on ensüümi molekulid tähistatud - E. Nimetatakse aineid, mille muundumisi katalüüsivad ensüümid substraadid (S). Tooted ensümaatiline reaktsioon tähendab - R. Kuna ensüümid on valgud, saadakse need homogeensel kujul, kasutades samu meetodeid nagu teised valgud. Ensüüme iseloomustavad valkudele omased füüsikalis-keemilised omadused.

Ensüümide ja anorgaaniliste katalüsaatorite erinevus:

a) kiirendada reaktsioone palju tõhusamalt;

b) millel on kõrge tegevuse spetsiifilisus;

c) alluvad füsioloogilistes tingimustes reguleerimisele;

d) töötada kergetes tingimustes.

Ensüümide struktuur

Ensüümid võivad olla nii lihtsad kui ka komplekssed (konjugeeritud) valgud, mis võivad sisaldada lipiide, süsivesikuid, metalliioone, lämmastiku aluseid ja vitamiinide derivaate. Organismis võivad ensüümid toimida nii lahustuvas olekus kui ka lahustumatute komplekside kujul või olla osa bioloogilistest membraanidest.

Ensüümide eripäraks on nende olemasolu aktiivne keskus. Aktiivne keskus - See on ainulaadne ruumis lähedal asuvate aminohappejääkide kombinatsioon, mis annab:

a) substraadi molekuli äratundmine,

b) substraadi seondumine ensüümiga,

c) katalüütilise transformatsiooni läbiviimine (kompleksensüümi puhul osaleb katalüüsiaktis ka aktiivtsentri osaks olev koensüüm).

Aktiivne koht tekib siis, kui valk voldib ja omandab oma natiivse (aktiivse) konformatsiooni. Aktiivse keskuse struktuur võib substraadiga suhtlemisel muutuda. D. Koshlandi kujundliku väljendi kohaselt läheneb substraat aktiivsele keskusele nagu käsi kindale.

Üks ensüümi molekul, eriti kui see koosneb mitmest subühikust, võib sisaldada rohkem kui ühte aktiivset saiti.

Aktiivses keskuses on kaks piirkonda. Esimene piirkond vastutab substraadi äratundmise ja sidumise eest. Seda nimetatakse substraadi sidumiskohaks või ankurduskohaks. Teist sektsiooni nimetatakse katalüütiliseks sektsiooniks, see sisaldab aminohappejääke, mis osalevad katalüüsis.

Ensüümid on valgud, mille molekulmass ja struktuurne keerukus on väga erinev. Väikese molekuliga ensüümi näide on ribonukleaas, mis koosneb ühest subühikust molekulmassiga 13 700 Da. (Ribonukleaasi aminohappejärjestus on määratud. 1969. aastal sünteesiti ribonukleaas B. Merrifieldi laboris New Yorgis.) Paljud ensüümid koosnevad mitmest allüksusest, näiteks laktaatdehüdrogenaas koosneb neljast kahte tüüpi alaühikust. Praeguseks on teada mitmeid multiensüümide komplekse, mis koosnevad kümnetest erinevatest subühikutest ja mitut tüüpi koensüümidest. Näiteks püruvaadi dehüdrogenaasi kompleks koosneb 60 kolme tüüpi subühikust ja viit tüüpi kofaktorist. Sellise kompleksi molekulmass on olenevalt ensüümi allikast 2,3 * 10 6 - 10 * 10 6 Da. Ensüümi molekul võib olla väiksem kui substraadi molekul. Näiteks: ensüümide amülaas ja ribonukleaas molekulid on väiksemad kui nende substraatide – tärklise ja RNA – molekulid.

Komplekssete ensüümide valguosa on katalüütiliselt inaktiivne ja seda nimetatakse apoensüüm. Apoensüümi seondumine mittevalgulise komponendiga viib katalüütiliselt aktiivse ensüümi (holoensüümi) moodustumiseni:

Paljud ensüümid sisaldavad metalliioone, mis võivad täita erinevaid funktsioone:

a) osaleda substraadi sidumises ja selle katalüütilise muundamise protsessis;

b) soodustab koensüümi kinnitumist ensüümi molekuliga;

c) stabiliseerida ensüümi tertsiaarset struktuuri (näiteks Ca 2+ amülaasis);

d) substraadiga seondudes, moodustades tõelise substraadi, millel ensüüm toimib.

Paljud koensüümid on vitamiinide derivaadid, seega on vitamiinipuudusest tingitud ainevahetushäired põhjustatud teatud ensüümide aktiivsuse vähenemisest.

Mõned ensüümid sisaldavad koos aktiivse keskusega allosteeriline (regulatiivne) keskus - valgugloobuli piirkond, mis asub väljaspool aktiivset keskust, kuhu võivad seonduda ensümaatilist aktiivsust reguleerivad ained. Neid aineid nimetatakse allosteerilisteks efektorid (allosteerilised aktivaatorid või inhibiitorid). Efektori seondumise tulemusena allosteerilise tsentriga toimub muutus valgu struktuuris, mis viib aminohappejääkide ruumilise paigutuse muutumiseni aktiivses keskuses ja lõpuks ensümaatilise aktiivsuse muutumiseni. .

Ensüüme, mida leidub samas organismis ja mis katalüüsivad sama keemilist reaktsiooni, kuid millel on erinev primaarne valgu struktuur, nimetatakse isoensüümideks. Isoensüümid erinevad üksteisest selliste füüsikalis-keemiliste omaduste poolest nagu molekulmass, termiline stabiilsus, substraadi spetsiifilisus ja elektroforeetiline liikuvus. Isoensüümide välimus on varieeruv, kuid enamasti tuleneb erinevusi neid isoensüüme või nende subühikuid kodeerivate geenide struktuuris. Näiteks ensüümil laktaatdehüdrogenaas (LDH), mis katalüüsib laktaadi oksüdatsiooni pöörduvat reaktsiooni püruvaadiks, sisaldab kahte tüüpi M ja H neli subühikut; nende subühikute kombinatsioon on aluseks viie LDH isoensüümi moodustumisele (joonis 1). Südame- ja maksahaiguste diagnoosimiseks on vaja uurida LDH isoensüümi spektrit vereseerumis, kuna LDH 1 ja LDH 2 on aktiivsed südamelihases ja neerudes ning LDH 4 ja LDH 5 skeletilihastes. ja maksa.

Joonis 1. Erinevate LDH isoensüümide struktuur.

Ensüümide aktiivsuse mõõtmine

Ensüümi aktiivsus määratakse katalüüsitud reaktsioonide kiiruse mõõtmise teel. Ensümaatiliste reaktsioonide kiirust mõõdetakse substraadi kontsentratsiooni vähenemise või toote kontsentratsiooni suurenemisega ajaühikus:

v = -ΔС S /Δτ, v = ΔC P /Δτ,

Kus ΔС S– substraadi molaarse kontsentratsiooni muutus (mol/l),

ΔC P- reaktsioonisaaduse molaarse kontsentratsiooni muutus (mol/l),

Δτ - aja muutus (min, sek).

Soovitatav on läbi viia kineetilised uuringud substraadi küllastuskontsentratsioonidel, vastasel juhul ei suuda ensüüm maksimaalset aktiivsust avaldada.

Ensüümi aktiivsuse ühikud:

Rahvusvaheline ensüümiühik (U)- see on ensüümi kogus, mis temperatuuril 25 o C ja keskkonna optimaalse pH juures katalüüsib 1 µmol substraadi muundumist 1 minuti jooksul.

Ensüümi SI ühik on rullitud (kat)– see on ensüümi kogus, mis katalüüsib ühe mooli substraadi muundamise 1 sekundi jooksul. Seda on lihtne arvutada:

1 U = (1 * 10 -6 M) / 60 s = 1,67 * 10 -8 M s-1 = 1,67 * 10 -8 kat = 16,7 kat.

Sageli määratletud konkreetne tegevus ensüümpreparaadid, jagades ensüümpreparaadi proovi (U) aktiivsuse proovi massiga milligrammides:

Löök = U / ravimi kaal (mg)

Ensüümide puhastamisel suureneb spetsiifiline aktiivsus. Spetsiifilist aktiivsust suurendades saab hinnata puhastamisetappide tõhusust ja ensüümpreparaadi puhtust.

Kõrge puhtusega homogeensete ensüümpreparaatide aktiivsuse hindamiseks jagatakse ensüümi rahvusvaheliste ühikute (U) arv proovis ensüümaine kogusega (μmol) selles proovis, mis on arvutatud. molaarne aktiivsus(kiirus). Füüsikalises mõttes on molaarne aktiivsus substraadi molekulide arv, mis läbivad transformatsiooni ühel ensüümi molekulil 1 minuti või 1 sekundi jooksul. Näiteks: ureaasi puhul, mis kiirendab uurea hüdrolüüsi, on molaarne aktiivsus 30 000, trüpsiin - 102, glükoosoksüdaas - 17 000 tsüklit sekundis.

Ensüümide omadused

4.1. Toimemehhanism. Ensüümid ei nihuta katalüüsitud reaktsioonide tasakaalu produktide tekke suunas, seega jääb reaktsiooni tasakaalukonstant konstantseks. Nagu kõik katalüsaatorid, vähendavad ensüümid ainult selle tasakaalu saavutamiseks kuluvat aega. Enamikul juhtudel kiirendavad ensüümid reaktsioone 10 7 - 10 14 korda. Ensümaatilise katalüüsi efektiivsus põhineb reaktsiooni aktiveerimisenergia tugeval vähenemisel, mis on tingitud substraadi muundumisest tooteks üleminekuolekute kaudu.

4.2. Tegevuse spetsiifilisus. Substraadiga seondumise spetsiifilisuse ja ensümaatilise reaktsiooni tee määrab apoensüüm. Ensüümide toime spetsiifilisus määrab suunalise ainevahetuse organismis.

Väidetavalt on ensüümidel kitsas substraadi spetsiifilisus, kui need toimivad väga väikesel hulgal substraatidel. Mõnikord saame rääkida substraadi absoluutne spetsiifilisus, Näiteks katalaas katalüüsib ainult ühte reaktsiooni - vesinikperoksiidi lagunemist:

Enamikule ensüümidele on iseloomulik suhteline (lai, rühm) substraadi spetsiifilisus kui need katalüüsivad sarnaste reaktsioonide rühma. Näiteks alkoholdehüdrogenaas katalüüsib alkoholide muundumist aldehüüdideks ning substraatidena võivad toimida metanool, etanool, propanool ja teised alkoholid. Huvitav fakt on see, et alkoholdehüdrogenaas võib oksüdeerida mittelineaarseid alkohole, aga ka alkoholirühma, mis on osa keerulistest molekulidest; eelkõige võib see ensüüm katalüüsida retinooli muundumist võrkkestaks. Loomulikult katalüüsivad laia substraadi spetsiifilisusega ensüümid erineva efektiivsusega substraatide transformatsiooni.

Ensüüme antakse ka stereokeemiline spetsiifilisus: nende aktiivne kese tunneb ruumilise konfiguratsiooni järgi ära substraadi molekulid. Näiteks L-aminohapete oksüdaasid on aktiivsed ainult L-aminohapete vastu ja ei mõjuta nende D-analooge üldse. D-aminohapete oksüdatiivseks deamineerimiseks on elusorganismidel D-aminohapete oksüdaasid, mis ei toimi L-aminohapetele. See on aktiivse tsentri võime seonduda substraadi teatud stereoisomeeridega, mis on ensüümide, näiteks ratsemaaside, funktsioneerimise aluseks, mis muudavad mõned stereoisomeerid teisteks.

Transformatsiooniradade spetsiifilisus seisneb selles, et üks substraat võib erinevate ensüümide toimel muutuda toodeteks, mis erinevad oma struktuurilt ja rollilt ainevahetuses.

Siin on näide: L-aminohappe oksüdaas toimivad L-aminohapetele, muutes need alfa-ketohapeteks koos ammoniaagi ja vesinikperoksiidi moodustumisega.

L-aminohappe dekarboksülaas seonduvad samade substraatidega, kuid katalüüsivad teistsugust reaktsiooni: dekarboksüülimist koos biogeensete amiinide moodustumisega ja süsinikdioksiidi vabanemisega.

Teine näide on võimalus muundada glükoos-6 fosfaati erinevate ensüümide toimel mööda ühte võimalikest metaboolsetest radadest:

4.3. Termiline labiilsus .

Nagu paljud valgud, läbivad ensüümid temperatuuri tõustes termilise denaturatsiooni, mis põhjustab ensüümi natiivse konformatsiooni katkemise ja aktiivse keskuse struktuuri muutumise. Imetajate ensüümid hakkavad märgatavalt denatureerima temperatuuril üle 40 °C.

Seoses eelnevaga on soovitav ensüümpreparaate säilitada madalal temperatuuril. Üks parimaid viise ensüümide säilitamiseks on lüofiliseerida (kuivatada temperatuuril alla -70 o C vaakumis), viia ammooniumisoolade abil osaliselt denatureeritud olekusse ja panna külmkappi.

4.4. Reaktsioonikiiruse sõltuvus temperatuurist. Ensümaatiliste reaktsioonide kiirus, nagu kõik keemilised reaktsioonid, sõltub temperatuurist. Kui temperatuur tõuseb 10 o C võrra, suureneb reaktsioonikiirus vastavalt Van't Hoffi reeglile 2-4 korda. Temperatuuridel üle 40 o C muutub aga oluliseks ensüümide denaturatsioon, mis viib koguaktiivsuse vähenemiseni (joonis 2):

Riis. 2. Ensümaatilise reaktsiooni kiiruse sõltuvus temperatuurist.

4.5. Reaktsioonikiiruse sõltuvus pH-st. Ensümaatilise reaktsiooni kiiruse sõltuvus pH-st on kellukakujuline (joonis 3). PH väärtusi, mille juures täheldatakse ensümaatilise reaktsiooni suurimat kiirust, nimetatakse optimaalseks (pH-optimaalne). Kõverate olemus ja pH optimumi väärtus sõltuvad substraadi laetud rühmade ja ensüümi laetud rühmade olemusest (eriti aktiivses keskuses sisalduvatest). Enamiku ensüümide optimaalne pH on vahemikus 6,0 kuni 8,0 (joonis 3).

Riis. 3. Ensümaatilise reaktsiooni kiiruse sõltuvus pH-st.

Siiski on ka erandeid, näiteks pepsiin on kõige aktiivsem pH 1,5 - 2,0 ja aluseline fosfataas pH 10,0 - 10,5 juures (joonis 4)

Riis. 4. Ensümaatilise reaktsiooni kiiruse (v) sõltuvus söötme pH-st.

Äärmuslike (väga madala või väga kõrge) pH väärtuste korral on ensüümi molekuli tertsiaarne struktuur häiritud, mis viib ensümaatilise aktiivsuse kadumiseni.

Seotud Informatsioon.

Ensüümide aktiivsuse mõiste

Igapäevases biokeemilises praktikas ensüümi kogust praktiliselt ei hinnata, vaid ainult selle aktiivsust. Aktiivsus on laiem mõiste kui kvantiteet. See tähendab ennekõike reaktsiooni tulemust, nimelt substraadi kadumist või toote kuhjumist. Loomulikult ei saa eirata ensüümi tööaega ja ensüümi molekulide arvu. Kuid kuna ensüümi molekulide arvu pole tavaliselt võimalik arvutada, kasutatakse ensüümi sisaldava bioloogilise materjali kogust (maht või mass).

Seega tuleb ensüümi aktiivsuse määramisel arvestada korraga kolme muutujaga:

saadud toote või kadunud substraadi mass;
reaktsioonile kulunud aeg;
ensüümi kogus, vaid tegelikult ensüümi sisaldava bioloogilise materjali mass või maht.

Nende tegurite vaheliste seoste mõistmiseks võib selge ja lihtsa näitena tuua kahe hoone ehitamise. Võrdleme hooned reaktsiooniproduktiga, töötajad on ensüümid ja meeskond vastaku bioloogilise materjali mahule. Niisiis, probleemid 3. klassist:

Ühe hoone ehitamisel töötas 10-liikmeline meeskond ja teise sarnase hoone kallal 5-liikmeline meeskond. Ehitus viidi lõpule üheaegselt ja täies mahus. Kus on töötajate aktiivsus suurem?
Ühe 3-korruselise hoone ehitamisel töötas 10-liikmeline meeskond ja teise 12-korruselise hoone ehitamisel 10-liikmeline meeskond. Ehitus viidi lõpule üheaegselt ja täies mahus. Kus on töötajate aktiivsus suurem?
Ühe 5-korruselise hoone ehitamisel töötas 10-liikmeline meeskond ja teise sarnase hoone kallal 10-liikmeline meeskond. Esimese hoone ehitus kestis 20 päeva, teine ehitati 10 päevaga. Kus on töötajate aktiivsus suurem?

Ensüümi aktiivsuse kvantifitseerimise alused

1. Ensüümi aktiivsust väljendatakse toote akumuleerumiskiiruses või substraadi kadumise kiiruses ensüümi sisaldava materjali koguses.

Praktikas kasutavad nad tavaliselt:

aine koguse ühikud - mool (ja selle derivaadid mmol, µmol), gramm (kg, mg),
ajaühikud - minut, tund, sekund,
massi- või mahuühikud - gramm (kg, mg), liiter (ml).

Aktiivselt kasutatakse ka teisi derivaate - katal (mol/s), rahvusvaheline aktiivsusühik (IU, Unit) vastab µmol/min.

Seega saab ensüümi aktiivsust väljendada näiteks mmol/s×l, g/h×l, IU/l, cat/ml jne.

Näiteks on teada

2. Standardtingimuste loomine, et saaks võrrelda erinevates laborites saadud tulemusi - optimaalne pH ja fikseeritud temperatuur, näiteks 25°C või 37°C, jälgides substraadi inkubatsiooniaega ensüümiga.

Ensüümide aktiivsus. Under ensüümi aktiivsus mõista selle kogust, mis katalüüsib teatud hulga substraadi muundumist ajaühikus. Ensüümpreparaatide aktiivsuse väljendamiseks kasutatakse kahte alternatiivset ühikut: rahvusvaheline (IU) ja katal (kat). Taga rahvusvaheline tegevusüksus Võetud ensüümi kogus on selline, et see katalüüsib standardtingimustes (tavaliselt optimaalsetes) 1 µmol substraadi muundumist tooteks 1 minuti jooksul. Üks uisutas tähistab ensüümi kogust, mis katalüüsib 1 mooli substraadi konversiooni 1 sekundi jooksul (1 kat = 6 ∙ 10 7 IU). Bimolekulaarses reaktsioonis A + B = C + D võetakse ensüümi aktiivsuse ühikuks kogus, mis katalüüsib 1 µmol A või B või 2 µmol A (kui B = A) konversiooni 1 minuti jooksul. .

Sageli iseloomustab ensüümipreparaate spetsiifiline aktiivsus, mis peegeldab ensüümi puhastusastet. Konkreetne tegevus on ensüümi aktiivsuse ühikute arv 1 mg valgu kohta.

Molekulaarne aktiivsus (ensüümi ringluse arv) - substraadi molekulide arv, mis muundub ühe ensüümi molekuli poolt 1 minuti jooksul, kui ensüüm on substraadiga täielikult küllastunud. See võrdub ensüümi aktiivsuse ühikute arvuga, mis on jagatud mikromoolides väljendatud ensüümi kogusega. Molekulaarse aktiivsuse mõiste on rakendatav ainult puhaste ensüümide puhul.

Kui on teada aktiivsete tsentrite arv ensüümi molekulis, võetakse kasutusele kontseptsioon katalüütilise keskuse aktiivsus . Seda iseloomustab substraadimolekulide arv, mis läbivad transformatsiooni 1 minuti jooksul aktiivse keskuse kohta.

Ensüümide aktiivsus sõltub suuresti välistingimustest, mille hulgas on esmatähtsad keskkonna temperatuur ja pH. Temperatuuri tõus vahemikus 0–50 °C põhjustab tavaliselt ensümaatilise aktiivsuse sujuva tõusu, mis on seotud ensüümi-substraadi kompleksi moodustumise kiirenemisega ja kõigi järgnevate katalüütiliste sündmustega. Iga 10°C temperatuuritõusu korral reaktsioonikiirus ligikaudu kahekordistub (van't Hoffi reegel). Temperatuuri edasise tõusuga (>50°C) kaasneb aga inaktiveeritud ensüümi hulga suurenemine selle valguosa denatureerumise tõttu, mis väljendub aktiivsuse vähenemises. Iga ensüümi iseloomustatakse temperatuuri optimaalne– temperatuuri väärtus, mille juures registreeritakse selle suurim aktiivsus.

Ensüümide aktiivsuse sõltuvus söötme pH väärtusest on keeruline. Iga ensüümi iseloomustatakse optimaalne pH keskkond, kus see näitab maksimaalset aktiivsust. Sellest väärtusest ühes või teises suunas eemaldudes ensümaatiline aktiivsus väheneb. Seda seletatakse ensüümi aktiivse tsentri oleku muutusega (funktsionaalsete rühmade ionisatsiooni vähenemine või suurenemine), samuti kogu valgu molekuli tertsiaarstruktuuriga, mis sõltub katioonsete ja anioonsete ainete suhtest. keskused selles. Enamikul ensüümidel on pH optimum neutraalses vahemikus. Siiski on ensüüme, mille maksimaalne aktiivsus on pH 1,5 (pepsiin) või 9,5 (arginaas) juures. Ensüümidega töötamisel on vaja pH-d hoida sobiva puhverlahuse abil.

Ensüümi aktiivsus võib sõltuvalt kokkupuutest oluliselt kõikuda inhibiitorid( ained, mis osaliselt või täielikult vähendavad aktiivsust) ja aktivaatorid( aktiivsust suurendavad ained). Nende rolli mängivad metallikatioonid, mõned anioonid, fosfaatrühmade kandjad, redutseerivad ekvivalendid, spetsiifilised valgud, ainevahetuse vahe- ja lõppsaadused jne.

Ensümaatilise kineetika põhimõtted. Kineetiliste uuringute põhiolemus on määrata ensümaatilise reaktsiooni maksimaalne kiirus ( V max) ja Michaelise konstandid K M. Ensüümikineetika uurib ensüümide toimel mõnede ainete kvantitatiivsete muundumiste kiirust teisteks. Ensümaatilise reaktsiooni kiirust mõõdetakse substraadi kadumise või saadud produkti suurenemise järgi ajaühiku kohta või ühe külgneva koensüümi vormi kontsentratsiooni muutumisega.

Mõjutamine ensüümi kontsentratsioon Reaktsioonikiirust väljendatakse järgmiselt: kui substraadi kontsentratsioon on konstantne (eeldusel, et substraati on liiga palju), siis on reaktsiooni kiirus võrdeline ensüümi kontsentratsiooniga. Kineetiliste uuringute jaoks kasutatakse ensüümi kontsentratsiooni 10–8 M aktiivsetes kohtades. Ensüümi kontsentratsiooni optimaalne väärtus määratakse ensüümi aktiivsuse sõltuvuse graafikust selle kontsentratsioonist. Optimaalseks väärtuseks peetakse saadud graafiku platool ensüümi aktiivsuse väärtuste vahemikus, mis sõltuvad veidi selle kontsentratsioonist (joonis 4.3).

Riis. 4.3. Ensümaatilise reaktsiooni kiiruse sõltuvus

ensüümi kontsentratsiooni kohta

Mõju uurimiseks substraadi kontsentratsioon ensümaatilise reaktsiooni kiiruse määramiseks koostage esmalt kineetiline kõver, mis peegeldab substraadi (S 1) või produkti (P 1) kontsentratsiooni muutumist ajas (joonis 4.4) ja mõõtke algkiirus ( V 1) reaktsioonid kui kõvera puutuja kaldenurga puutuja nullpunktis.

Riis. 4.4. Ensümaatilise reaktsiooni kineetilised kõverad

Konstrueerides antud substraadi (S 2, S 3, S 4 jne) või toote (P 2, P 3, P 4 jne) muude kontsentratsioonide jaoks kineetilised kõverad ja määrates kindlaks algkiirused ( V 2, V 3 , V 4 jne) reaktsioonid, koostage graafik ensümaatilise reaktsiooni algkiiruse sõltuvusest substraadi kontsentratsioonist (ensüümi konstantsel kontsentratsioonil), millel on hüperbooli kuju (joonis 4.5).

Riis. 4.5. Ensümaatilise reaktsiooni algkiiruse sõltuvus

substraadi kontsentratsiooni kohta

Paljude ensümaatiliste reaktsioonide kineetikat kirjeldab Michaelise-Menteni võrrand. Konstantsel ensüümi kontsentratsioonil ja substraadi madalad kontsentratsioonid[S] algreaktsiooni kiirus on otseselt võrdeline [S]-ga (joonis 4.5). Sel juhul räägime ensüümi poolküllastumisest substraadiga, kui pooled ensüümi molekulid on ensüümi-substraadi kompleksi kujul ja reaktsioonikiirus V = 1/2V max. Substraadi suhtes on reaktsioon 1. järku (reaktsiooni kiirus on otseselt võrdeline ühe reagendi kontsentratsiooniga) või 2. järku (reaktsiooni kiirus on võrdeline kahe reagendi kontsentratsioonide korrutisega).

Kell kõrged väärtused substraadi kontsentratsioon[S] reaktsioonikiirus on [S]-st peaaegu sõltumatu: [S] edasisel suurenemisel kasvab reaktsioonikiirus üha aeglasemalt ja muutub lõpuks konstantseks (maksimaalseks) (joonis 4.5). Sel juhul saavutatakse ensüümi täielik küllastumine substraadiga, kui kõik ensüümi molekulid on ensüümi-substraadi kompleksi kujul ja V = V max. Substraadi suhtes on reaktsioon 0-ndat järku (reaktsiooni kiirus ei sõltu reagentide kontsentratsioonist).

1913. aastal pakkusid L. Michaelis ja M. Menten sellise kineetika selgitamiseks välja lihtsa mudeli. Selle mudeli kohaselt on spetsiifilise ensüümi-substraadi kompleksi moodustumine katalüüsi vajalik vaheetapp.

k 1 k 3

E + S ⇄ ES → E + P

Ensüüm E ühineb substraadiga S, moodustades ES kompleksi. Selle protsessi kiiruskonstant on k 1 . ES-kompleksi saatus on kahekordne: see võib kiiruskonstandiga dissotsieeruda ensüümiks E ja substraadiks S k 2 või läbivad edasise transformatsiooni, moodustades produkti P ja vaba ensüümi E kiiruskonstandiga k 3. Eeldatakse, et reaktsiooniprodukt ei muutu algseks substraadiks. See tingimus on täidetud reaktsiooni algfaasis, samas kui toote kontsentratsioon on madal.

Katalüüsi kiirus määratakse kindlaks statsionaarsed seisundid, kui vahesaaduste kontsentratsioon jääb konstantseks, samas kui lähteainete ja lõppsaaduste kontsentratsioon varieerub. See juhtub siis, kui ES-kompleksi moodustumise kiirus on võrdne selle lagunemise kiirusega.

Saate kasutusele võtta uue konstandi K M - Michaelis konstantne(mol/l), mis on võrdne

Michaelise-Menteni võrrand, mis väljendab kvantitatiivset seost ensümaatilise reaktsiooni kiiruse ja substraadi kontsentratsiooni vahel, on kujul

(4.2)

See võrrand vastab reaktsioonikiiruse ja substraadi kontsentratsiooni graafikule. Kell substraadi madalad kontsentratsioonid, kui [S] on palju madalam kui K M, V = V max [S] / K M, st reaktsioonikiirus on otseselt proportsionaalne substraadi kontsentratsiooniga. Kell kõrge substraadi kontsentratsioon, kui [S] on palju suurem kui K M, V = V max, st reaktsioonikiirus on maksimaalne ja ei sõltu substraadi kontsentratsioonist.

Kui [S] = K M, siis V = V max/2.

Seega K M võrdne substraadi kontsentratsiooniga, mille juures reaktsioonikiirus on pool maksimumist.

Michaelise konstant (K M) ja maksimaalne reaktsioonikiirus ( V max) on olulised kiirusomadused erinevatel substraadikontsentratsioonidel. V max – iga ensüümi konstantne väärtus võimaldab hinnata selle toime tõhusust.

Michaelise konstant näitab substraadi afiinsust ensüümi suhtes (juhul, kui k 2 >> k 3): mida väiksem KM, seda suurem on afiinsus ja suurem reaktsioonikiirus ning vastupidi. Iga substraati iseloomustab antud ensüümi jaoks oma KM väärtus ja nende väärtusi saab kasutada ensüümi substraadi spetsiifilisuse hindamiseks. Michaelise konstant sõltub substraadi olemusest, temperatuurist, pH-st, lahuse ioontugevusest ja inhibiitorite olemasolust.

Tulenevalt asjaolust, et määratlus V Max ja K M otse graafilisest Michaelise-Menteni seosest (joonis 4.5) on mitmetähenduslikud, nad kasutavad selle võrrandi lineariseerimist. Selleks teisendatakse see sellisele kujule, et seda saab graafiliselt väljendada sirgjoonena. On mitmeid lineariseerimismeetodeid, mille hulgas kasutatakse kõige sagedamini Lineweaver-Burki ja Edy-Hofstee meetodeid.

Teisendamine Lineweaver-Burk paistab nagu

(4.3)

Koostage sõltuvusgraafik 1/ V = f(1/[S]) ja saada sirge, mille lõikumine y-teljega annab väärtuse 1/ V max ; abstsisstelje sirgjoonega ära lõigatud segment annab väärtuse –1/K M ja sirge kaldenurga puutuja abstsisstelje suhtes on võrdne K M / V max (joonis 4.6). See graafik võimaldab teil täpsemalt määrata V max. Nagu allpool näeme, saab sellelt graafikult koguda väärtuslikku teavet ensüümi aktiivsuse pärssimise kohta.

Riis. 4.6. Michaelise-Menteni võrrandi lineariseerimismeetod

(Lineweaveri - Burke'i järgi)

meetod Edie-Hofstee põhineb Michaelise-Menteni võrrandi teisendamisel, korrutades mõlemad pooled V max:

(4.4)

Graafik koordinaatides V Ja V/[S] on sirge, mille lõikumine y-teljega annab väärtuse V max ja abstsisstellje sirgjoonega lõigatud segment on väärtus V max /K M (joonis 4.7). Selle abil on väga lihtne määrata K M ja V max ja tuvastada ka võimalikud kõrvalekalded lineaarsusest, mida eelmisel graafikul ei tuvastatud.

Riis. 4.7. Michaelise-Menteni võrrandi lineariseerimismeetod

(Edi järgi – Hofstee)

Ensüümide aktiivsuse pärssimine. Teatud kemikaalid võivad ensüümide toimet täielikult või osaliselt pärssida - inhibiitorid . Sõltuvalt toime olemusest jagatakse inhibiitorid pöörduvateks ja pöördumatuteks. See jaotus põhineb inhibiitori ensüümiga seondumise tugevusel.

Pöörduvad inhibiitorid - need on ühendid, mis interakteeruvad ensüümiga mittekovalentselt ja nende eemaldamisel ensüümi aktiivsus taastub. Pööratav pärssimine võib olla konkureeriv, mittekonkureeriv või mittekonkureeriv.

Näide konkurentsi pärssimine on substraadi struktuursete analoogide toime, mis võivad seonduda ensüümi aktiivse keskmega sarnaselt substraadiga, muutumata siiski produktiks ja takistamata ensüümi interaktsiooni tõelise substraadiga, st tekib konkurents. substraadi ja inhibiitori vahel seondumiseks ensüümi aktiivse keskusega. Ensüüm-inhibiitori (EI) komplekside moodustumise tulemusena väheneb ES komplekside kontsentratsioon ja selle tulemusena väheneb reaktsioonikiirus. Teisisõnu, konkureeriv inhibiitor vähendab katalüüsi kiirust, vähendades substraati siduvate ensüümmolekulide osakaalu.

Reaktsioonikiiruste mõõtmine erinevatel substraadikontsentratsioonidel võimaldab eristada konkureerivat ja mittekonkureerivat inhibeerimist. Konkurentsi inhibeerimisega sõltuvusgraafikul 1/ V=f(1/[S]) sirged lõikuvad ordinaattelje ühes punktis 1/ V max sõltumata inhibiitori olemasolust, kuid inhibiitori olemasolul suureneb sirge kaldenurga puutuja abstsisstelje suhtes, s.o. V max ei muutu, kuid KM suureneb, mis näitab substraadi afiinsuse vähenemist ensüümi suhtes inhibiitori juuresolekul (joon. 4.8). Järelikult saab substraadi piisavalt kõrge kontsentratsiooni korral konkurentsi tingimustes ensüümi aktiivse saidi pärast, kui substraat tõrjub inhibiitori aktiivsest saidist välja, inhibeerimise elimineerida ja katalüüsitud reaktsiooni kiirust taastada. Sel juhul on Michaelise-Menteni võrrandil vorm

(4.5)

kus [I] on inhibiitori kontsentratsioon; K i - inhibeerimise konstant.

Inhibeerimiskonstant iseloomustab ensüümi afiinsust inhibiitori suhtes ja on EI kompleksi dissotsiatsioonikonstant:

(4.6)

Konkureeriva inhibiitori juuresolekul suureneb sirge kaldenurga puutuja x-telje suhtes summaga (1 + [I]/ K i).

Riis. 4.8. Konkurentsi pärssimine:

a – diagramm; b – graafiline väljendus Lineweaveri - Burke'i järgi

Kell mittekonkureeriv pärssimine inhibiitor erineb struktuurilt substraadist ja seondub mitte aktiivse, vaid ensüümi allosteerilise tsentriga. See viib ensüümi aktiivse tsentri konformatsiooni muutumiseni, millega kaasneb ensüümi katalüütilise aktiivsuse vähenemine. Lisaks võib inhibiitor seonduda mitte ainult vaba ensüümiga (E + I → EI), vaid ka ensüümi-substraadi kompleksiga (ES + I → ESI). Mõlemad vormid EI ja ESI on passiivsed. Substraat ja inhibiitor võivad olla samaaegselt seotud ensüümi molekuliga, kuid nende seondumiskohad ei kattu. Mittekonkureeriva inhibiitori toime eesmärk on vähendada ensüümide ringluse arvu, mitte aga substraati siduvate ensüümi molekulide osakaalu. Inhibiitor ei takista ES-komplekside teket, vaid pärsib substraadi muundumist tooteks. Järelikult V max väheneb, st inhibiitori juuresolekul tekib sirge ja ordinaattelje lõikepunkt kõrgemas punktis (joon. 4.9). Sirge kaldenurga puutuja abstsisstelje suhtes suureneb samal määral, mis on võrdne K M / V maxI. K M erinevalt V max ei muutu, seega ei saa substraadi kontsentratsiooni suurendamisega mittekonkureerivat inhibeerimist kõrvaldada.

Riis. 4.9. Mittekonkureeriv pärssimine:

a – diagramm; b – graafiline väljendus Lineweaveri – Burke’i järgi

Maksimaalne reaktsioonikiirus V max I mittekonkureeriva inhibiitori juuresolekul kirjeldatakse võrrandiga

(4.7)

Erijuhtumil mittekonkureeriv pärssimine, kui inhibiitor seondub ainult ES kompleksiga ja ei seondu vaba ensüümiga, sõltuvusgraafikus 1/ V = f(1/[S]) sirgjooned on üksteisega paralleelsed ja lõikuvad erinevates punktides ordinaat- ja abstsisstelljed (joonis 4.10).

Riis. 4.10. Mittekonkureeriv pärssimine:

a – diagramm; b – graafiline väljendus Lineweaveri – Burke’i järgi

Pöördumatud inhibiitorid on erineva keemilise olemusega väga reaktiivsed ühendid, mis võivad interakteeruda aktiivse tsentri funktsionaalselt oluliste rühmadega, moodustades tugevaid kovalentseid sidemeid. See toob kaasa ensüümi aktiivsuse pöördumatu kadumise. Sellega seoses ei ole Michaelise-Menteni teooria, mis põhineb eeldusel, et inhibiitori lisamine ensüümile on pöörduv, antud juhul kohaldatav.

Pöördumatu pärssimise näide on ensüümide interaktsioon raskmetalliioonidega, mis kinnituvad ensüümi tsüsteiinijääkide sulfhüdrüülrühmadele ja moodustavad merkaptiide - praktiliselt mittedissotsieeruvaid ühendeid või ensüümi kovalentset modifitseerimist alküülimise mõjul. agendid.

(aktivaatorid - suurenemine, inhibiitorid - vähenemine) Valguensüümid sünteesitakse ribosoomidel ja RNA - tuumas.

Mõisteid “ensüüm” ja “ensüüm” on pikka aega kasutatud sünonüümidena (esimene peamiselt vene ja saksa teaduskirjanduses, teine inglise ja prantsuse keeles).
Ensüümide teadust nimetatakse ensümoloogia, mitte ensümoloogia (et mitte segada ladina ja kreeka keele sõnade juuri).

Uuringu ajalugu

Tähtaeg ensüüm pakkus 17. sajandil välja keemik van Helmont seedimise mehhanisme käsitledes.

In con. XVIII - varajane XIX sajandil juba oli teada, et liha seedib maomahl ja tärklis muutub sülje toimel suhkruks. Nende nähtuste mehhanism oli aga teadmata

Ensüüme kasutatakse laialdaselt rahvamajanduses – toiduainetööstuses, tekstiilitööstuses ja farmakoloogias.

Ensüümide klassifikatsioon

Vastavalt nende poolt katalüüsitavate reaktsioonide tüübile jagatakse ensüümid 6 klassi vastavalt ensüümide hierarhilisele klassifikatsioonile (CF, - Enzyme Commission code). Klassifikatsiooni pakkus välja Rahvusvaheline Biokeemia ja Molekulaarbioloogia Liit. Iga klass sisaldab alamklasse, nii et ensüümi kirjeldatakse nelja numbriga, mis on eraldatud punktidega. Näiteks pepsiini EL-i nimi on 3.4.23.1. Esimene number kirjeldab ligikaudu ensüümi poolt katalüüsitud reaktsiooni mehhanismi:

CF 1: Oksüdoreduktaasid, katalüüsides oksüdatsiooni või redutseerimist. Näide: katalaas, alkoholdehüdrogenaas
CF 2: Transferaasid, katalüüsides keemiliste rühmade ülekandumist ühelt substraadi molekulilt teisele. Transferaaside hulgas eristuvad eriti kinaasid, mis kannavad üle fosfaatrühma, tavaliselt ATP molekulist.
CF 3: Hüdrolaasid, mis katalüüsib keemiliste sidemete hüdrolüüsi. Näide: esteraas, pepsiin, trüpsiin, amülaas, lipoproteiini lipaas
CF 4: Lyaasid, mis katalüüsib keemiliste sidemete katkemist ilma hüdrolüüsita koos kaksiksideme moodustumisega ühes tootes.
CF 5: Isomeraasid, katalüüsides substraadi molekulis struktuurseid või geomeetrilisi muutusi.
CF 6: Ligaasid, katalüüsides ATP hüdrolüüsi tõttu substraatide vahel keemiliste sidemete teket. Näide: DNA polümeraas

Kineetilised uuringud

Keemilise reaktsiooni küllastuskõver, mis illustreerib seost substraadi kontsentratsiooni [S] ja reaktsioonikiiruse v vahel

Ühe substraadi ensümaatiliste reaktsioonide kineetika lihtsaim kirjeldus on Michaelis-Menteni võrrand (vt joonist). Praeguseks on kirjeldatud mitmeid ensüümi toimemehhanisme. Näiteks kirjeldab paljude ensüümide toimet pingpongi mehhanism.

Ensüümide struktuur ja toimemehhanism

Ensüümide aktiivsuse määrab nende kolmemõõtmeline struktuur.

Nagu kõik valgud, sünteesitakse ensüümid lineaarse aminohapete ahela kujul, mis teatud viisil voltib. Iga aminohapete järjestus voldib erilisel viisil ja saadud molekulil (valgugloobulil) on ainulaadsed omadused. Valgukompleksi moodustamiseks saab kombineerida mitut valguahelat. Valkude tertsiaarne struktuur hävib kuumuse või teatud kemikaalidega kokkupuutel.

Reaktsiooni katalüüsimiseks peab ensüüm seonduma ühe või mitme substraadiga. Ensüümi valguahel voldib kokku nii, et kerakese pinnale tekib tühimik ehk lohk, kus substraadid seonduvad. Seda piirkonda nimetatakse substraadi sidumissaidiks. Tavaliselt langeb see kokku ensüümi aktiivse saidiga või on selle lähedal. Mõned ensüümid sisaldavad ka kofaktorite või metalliioonide sidumissaite.

Mõnel ensüümil on väikesed molekuli sidumissaidid ja need võivad olla substraadid või saadused metaboolsest rajast, kuhu ensüüm siseneb. Need vähendavad või suurendavad ensüümi aktiivsust, mis loob võimaluse tagasiside saamiseks.

Mõnede ensüümide aktiivseid keskusi iseloomustab kooperatiivsuse nähtus.

Spetsiifilisus

Ensüümidel on oma substraatide suhtes üldiselt kõrge spetsiifilisus. See saavutatakse substraadi molekuli kuju, laengujaotuse ja hüdrofoobsete piirkondade ning ensüümi substraadi sidumissaidi osalise komplementaarsuse kaudu. Ensüümidel on kõrge stereospetsiifilisus, regioselektiivsus ja kemoselektiivsus.

Võtmelukuga mudel

Koshlandi indutseeritud kirjavahetuse oletus

Reaalsem olukord on indutseeritud kirjavahetuse puhul. Valed aluspinnad – liiga suured või liiga väikesed – ei sobi aktiivsesse kohta

1890. aastal tegi Emil Fischer ettepaneku, et ensüümide spetsiifilisuse määrab ensüümi kuju ja substraadi täpne sobivus. Seda eeldust nimetatakse võtmeluku mudeliks. Ensüüm ühineb substraadiga, moodustades lühiajalise ensüümi-substraadi kompleksi. Kuigi see mudel selgitab ensüümide kõrget spetsiifilisust, ei selgita see praktikas täheldatavat üleminekuoleku stabiliseerumise nähtust.

Indutseeritud kirjavahetuse mudel

1958. aastal pakkus Daniel Koshland välja võtmeluku mudeli modifikatsiooni. Ensüümid ei ole üldiselt jäigad, vaid paindlikud molekulid. Ensüümi aktiivne sait võib substraadi seondumisel muuta konformatsiooni. Aktiivse saidi aminohapete kõrvalrühmad võtavad positsiooni, mis võimaldab ensüümil täita oma katalüütilist funktsiooni. Mõnel juhul muudab substraadi molekul ka konformatsiooni pärast aktiivse saidiga seondumist. Erinevalt klahviluku mudelist selgitab indutseeritud sobivusmudel mitte ainult ensüümide spetsiifilisust, vaid ka üleminekuoleku stabiliseerumist.

Modifikatsioonid

Paljud ensüümid läbivad pärast valguahela sünteesi modifikatsioone, ilma milleta ei avalda ensüüm täielikult oma aktiivsust. Selliseid modifikatsioone nimetatakse translatsioonijärgseteks modifikatsioonideks (töötluseks). Üks levinumaid modifikatsioonitüüpe on keemiliste rühmade lisamine polüpeptiidahela külgjääkidele. Näiteks fosforhappejäägi lisamist nimetatakse fosforüülimiseks ja seda katalüüsib ensüüm kinaas. Paljud eukarüootsed ensüümid on glükosüülitud, st modifitseeritud süsivesikute oligomeeridega.

Teine levinud translatsioonijärgse modifikatsiooni tüüp on polüpeptiidahela lõhustamine. Näiteks kümotrüpsiini (proteaas, mis osaleb seedimises) saadakse polüpeptiidi piirkonna lõikamisel kümotrüpsinogeenist. Kümotrüpsinogeen on kümotrüpsiini inaktiivne eelkäija ja sünteesitakse kõhunäärmes. Mitteaktiivne vorm transporditakse makku, kus see muundatakse kümotrüpsiiniks. See mehhanism on vajalik selleks, et vältida kõhunäärme ja teiste kudede lõhenemist enne ensüümi makku sisenemist. Mitteaktiivset ensüümi prekursorit nimetatakse ka "zymogeeniks".

Ensüümi kofaktorid

Mõned ensüümid täidavad katalüütilist funktsiooni iseseisvalt, ilma lisakomponentideta. Siiski on ensüüme, mis vajavad katalüüsi läbiviimiseks mittevalgulisi komponente. Kofaktorid võivad olla kas anorgaanilised molekulid (metalliioonid, raud-väävli klastrid jne) või orgaanilised (näiteks

1. Ensümaatiliste reaktsioonide tunnused

2. Temperatuuri mõju ensüümi aktiivsusele

3. pH mõju ensüümi aktiivsusele

4. Ensüümi aktivaatorid ja inhibiitorid

I. Kõigil ensümaatilistel reaktsioonidel on 4 tunnust

· Kõrge ensüümi aktiivsus;

· Ensüümide toime pöörduvus;

· Ensüümide toime spetsiifilisus;

· Labilsus (tundlikkus).

Kõrge ensüümi aktiivsus. Ensüümid põhjustavad ensümaatilise reaktsiooni suurt kiirust, mida iseloomustab ensüümide ringluse arv – see on substraadi molekulide arv, mis ühe ensüümi molekuli toimel ajaühikus muutuvad reaktsiooniproduktideks. Näiteks alkoholdehüdrogenaasi aktiivsus on 4700 ühikut, fosforülaasi - 50 000 ühikut, a-amülaasi - 16 000 ühikut.

Ensüümide toime pöörduvus asutas Danilevski. Ensüümide toime pöörduvus viitab ES kompleksi tekkele ja selle lagunemisele, s.o. ensüümi hõlmavad reaktsioonid võivad kulgeda nii ühes suunas (biosüntees) kui ka vastupidises suunas (lagunemine).

Ensüümi toime spetsiifilisus- iga ensüüm toimib ainult oma kindlale substraadile või seotud substraatide rühmale. Näiteks invertaas toimib sahharoosile; a-amülaas – ainult tärklise ja dekstriinide jaoks; proteaasid - valkudeks.

Ensüümi toime spetsiifilisust selgitavad kaks seisukohta. E. Fischeri kujundliku idee kohaselt “läheneb ensüüm substraadile nagu luku võti”, s.o. Ensüümi aktiivse saidi topograafia pole mitte ainult väga korrastatud, vaid ka jäigalt fikseeritud. Ensüümi aktiivne sait vastab ainult ühe substraadi topograafiale. Teine D. Koshlandi pakutud seisukoht on ensüümi ja substraadi indutseeritud vastavuse teooria: ensüümi konformatsioon, eriti selle aktiivne keskus, on võimeline teatud modifikatsioonideks. Sõltuvalt aktiivse saidi konformatsioonilisest liikuvusest on ensüüm võimeline interakteeruma kas väheste või paljude substraatidega. Ehk siis ES kompleksi moodustumise hetkel toimuvad muutused nii ensüümi kui substraadi struktuuris. Selle tulemusena kohanevad nad üksteisega.

Ensüümide spetsiifilisus mängib olulist rolli elusorganismis toimuvas ainevahetusprotsessis. (Kui ensüümil ei oleks ainulaadseid omadusi, siis elusorganismis ainevahetust ei toimuks)

Spetsiifilisuse põhjal jagatakse ensüümid kahte rühma:

· Absoluutne spetsiifilisus – ensüüm toimib ainult ühele üksikule ainele või katalüüsib ainult selle aine teatud transformatsiooni;

· Suhteline või rühmaspetsiifilisus – ensüümid toimivad samaaegselt paljudel substraatidel, millel on mitmeid ühiseid struktuurseid omadusi.

Labilsus (tundlikkus) - kõik ensüümid on tundlikud kõrgendatud temperatuuri ja madalate pH väärtuste suhtes, mille juures ensüümi aktiivsus kaob.

II. Kõige olulisem tegur, millest ensüümi aktiivsus sõltub, on temperatuur.

Graafiliselt on ensümaatilise reaktsiooni kiiruse sõltuvus temperatuurist järgmine:

Temperatuuril 0 °C ja veelgi enam temperatuuril alla 0 °C lakkab enamiku ensüümide toime. Temperatuuri tõus (kõver 1) üle 0°C soodustab ensüümi aktiivsuse suurenemist (reageerivate ainete kokkupõrgete arv suureneb). Teatud temperatuuril avaldab ensüüm maksimaalset aktiivsust. Enamiku ensüümide puhul on optimaalne töötemperatuur 40-50°C. Temperatuuri edasine tõus põhjustab ensüümide inaktiveerumist (aktiivsuse vähenemine) valgu molekuli termilise denaturatsiooni tõttu (kõver 2).

Reaktsioonikiiruse muutust iga 10°C temperatuuri tõusuga väljendatakse temperatuurikoefitsiendiga Q 10 . Temperatuurikoefitsient on reaktsioonikiiruse suhe antud temperatuuril v t +10 reaktsioonikiirusesse temperatuuril 10 °C sellest madalamal:

Q 10 väärtus keemiliste reaktsioonide puhul jääb vahemikku 2-4, ensümaatilise reaktsiooni puhul 1 kuni 2; Ensümaatiliste reaktsioonide Q10 väheneb temperatuuri tõustes märgatavalt.

III. Iga ensüüm avaldab oma toimet üsna kitsas pH-tsoonis. Ensüümide aktiivsuse graafiline sõltuvus pH-st on järgmine:

Happelises keskkonnas, madalate pH väärtuste korral, on see kujul EH 2 +, sellisel kujul on see inaktiivne. Optimaalse pH korral on ensüümil maksimaalne aktiivsus ja see on EH-vormis; Söötme leelistamisel omandab ensüüm E-vormi.

Optimaalne aktiivsus vastab teatud pH piirkonnale ja igal ensüümil on oma optimaalne pH väärtus toimimiseks (näiteks bakteriaalse a-amülaasi pH optimaalne on 6 ja mikroskoopilise seente a-amülaasi pH optimum on 4,7). Optimaalne pH väärtus on seotud ensüümide aminohappelise koostisega.

Kõvera kellukesekujuline kuju on seletatav ensüümide amfoteerse olemusega; selle kõvera tõusvad ja kahanevad harud on tüüpilised tiitrimiskõverad ja need on määratud ensüümide aktiivses kohas paiknevate ioonrühmade pK väärtustega.

Ensüümi aktiivtsentris sisalduvate funktsionaalrühmade määramiseks on vaja määrata selle ensüümi aktiivsuse sõltuvus pH-st erinevatel temperatuuridel ja määrata pK väärtus. Teades v = f(pH) sõltuvuse happeliste ja aluseliste harude ΔpK väärtusi, leitakse sellele väärtusele vastavad funktsionaalrühmad.

IV. Kõik reaktsiooni käigus ensüümiga kaasnevad ained võib jagada aktivaatoriteks, inhibiitoriteks ja neutraalseteks ühenditeks.

Aktivaatorid– keemilised ühendid, mis suurendavad ensüümide toimet (näiteks glutatioon aktiveerib proteaaside toimet, NaCl suurendab amülaaside aktiivsust); inhibiitorid– ühendid, mis pärsivad nende aktiivsust (näiteks –CN rühm pärsib tsütokroomsüsteemis paiknevate hingamisteede ensüümide aktiivsust) ja neutraalsed ühendid ei mõjuta ensüüme.

Inhibeerimisprotsess võib olla pööratav Ja pöördumatu.

Pöörduvad inhibiitorid on:

· Konkureeriv toime – inhibiitor interakteerub ensüümide aktiivse saidi funktsionaalrühmadega. Inhibeerimine sõltub sel juhul substraadi kontsentratsioonist: kui [S] on kõrge, siis ei pruugi inhibiitori [I] mõju avalduda; kui [S] on väike, siis võib inhibiitor substraadi tõrjuda ühendusest ensüümiga, mille toime on pärsitud. ESI kolmekomponentne kompleks ei moodustu kunagi konkureeriva inhibeerimise ajal.

· Mittekonkureerivat inhibeerimist täheldatakse siis, kui inhibiitor ei suuda ensüümiga kinnituda, kuid ei saa seonduda ensüümi-substraadi kompleksiga, muutes selle mitteaktiivseks.

· Segainhibeerimise korral toimib inhibiitor nii ensüümi ES sidumissaidile kui ka katalüütilisele saidile.