§ 9. FIZIKALNO-KEMIJSKA SVOJSTVA PROTEINA

Proteini su vrlo velike molekule, po veličini mogu biti inferiorni samo pojedinačnim predstavnicima nukleinskih kiselina i polisaharida. Tablica 4 prikazuje molekularne karakteristike nekih proteina.

Tablica 4

Molekularne karakteristike nekih proteina

	Relativna molekularna težina	Broj krugova	Broj aminokiselinskih ostataka
Ribonukleaza
mioglobina
kimotripsin
Hemoglobin
Glutamat dehidrogenaza

Proteinske molekule mogu sadržavati vrlo različit broj aminokiselinskih ostataka - od 50 do nekoliko tisuća; relativne molekularne mase proteina također jako variraju - od nekoliko tisuća (inzulin, ribonukleaza) do milijun (glutamat dehidrogenaza) ili više. Broj polipeptidnih lanaca u proteinima može varirati od jednog do nekoliko desetaka ili čak tisuća. Dakle, protein virusa mozaika duhana sadrži 2120 protomera.

Poznavajući relativnu molekularnu težinu proteina, može se približno procijeniti koliko je aminokiselinskih ostataka uključeno u njegov sastav. Prosječna relativna molekularna težina aminokiselina koje tvore polipeptidni lanac je 128. Kada se formira peptidna veza, molekula vode se odvaja, stoga će prosječna relativna masa aminokiselinskog ostatka biti 128 - 18 = 110. Koristeći ove podatke, možemo izračunati da će se protein s relativnom molekularnom težinom od 100 000 sastojati od približno 909 aminokiselinskih ostataka.

Električna svojstva proteinskih molekula

Električna svojstva proteina određena su prisutnošću pozitivno i negativno nabijenih aminokiselinskih ostataka na njihovoj površini. Prisutnost nabijenih proteinskih skupina određuje ukupni naboj proteinske molekule. Ako u proteinima prevladavaju negativno nabijene aminokiseline, tada će njihova molekula u neutralnoj otopini imati negativan naboj, ako prevladavaju pozitivno nabijene aminokiseline, molekula će imati pozitivan naboj. Ukupni naboj proteinske molekule ovisi i o kiselosti (pH) medija. S povećanjem koncentracije vodikovih iona (povećanje kiselosti), disocijacija karboksilnih skupina je potisnuta:

a istovremeno se povećava broj protoniranih amino skupina;

Dakle, s povećanjem kiselosti medija smanjuje se broj negativno nabijenih skupina na površini proteinske molekule, a povećava broj pozitivno nabijenih skupina. Sasvim drugačija slika uočava se kod smanjenja koncentracije vodikovih iona i porasta koncentracije hidroksidnih iona. Povećava se broj disociranih karboksilnih skupina

a broj protoniranih amino skupina opada

Dakle, promjenom kiselosti medija može se promijeniti i naboj proteinske molekule. S povećanjem kiselosti medija u proteinskoj molekuli smanjuje se broj negativno nabijenih skupina, a povećava broj pozitivno nabijenih skupina, molekula postupno gubi negativni i dobiva pozitivan naboj. Sa smanjenjem kiselosti otopine opaža se suprotna slika. Očito, pri određenim pH vrijednostima, molekula će biti električki neutralna; broj pozitivno nabijenih skupina bit će jednak broju negativno nabijenih skupina, a ukupni naboj molekule bit će nula (slika 14).

pH vrijednost pri kojoj je ukupni naboj proteina nula naziva se izoelektrična točka i označavapi.

Riža. 14. U stanju izoelektrične točke ukupni naboj proteinske molekule je nula

Izoelektrična točka za većinu proteina je u pH rasponu od 4,5 do 6,5. Međutim, postoje iznimke. Ispod su izoelektrične točke nekih proteina:

Pri pH vrijednostima ispod izoelektrične točke, protein nosi ukupni pozitivni naboj, a iznad toga, ukupni negativni naboj.

U izoelektričnoj točki topljivost proteina je minimalna, budući da su njegove molekule u tom stanju električki neutralne i između njih ne postoje sile međusobnog odbijanja, pa se mogu “zalijepiti” zbog vodikovih i ionskih veza, hidrofobnih interakcija, van der Waalsove sile. Pri pH vrijednostima različitim od pI, proteinske molekule će nositi isti naboj - bilo pozitivan ili negativan. Kao rezultat toga, između molekula će postojati elektrostatske sile odbijanja, sprječavajući ih da se "lijepe", topljivost će biti veća.

Topivost proteina

Proteini su topljivi i netopljivi u vodi. Topivost proteina ovisi o njihovoj strukturi, pH vrijednosti, sastavu soli otopine, temperaturi i drugim čimbenicima, a određena je prirodom onih skupina koje se nalaze na površini proteinske molekule. Netopivi proteini uključuju keratin (kosa, nokti, perje), kolagen (tetive), fibroin (lužina, paučina). Mnogi drugi proteini su topljivi u vodi. Topljivost je određena prisutnošću nabijenih i polarnih skupina na njihovoj površini (-COO -, -NH 3 +, -OH, itd.). Nabijene i polarne skupine proteina privlače molekule vode, a oko njih se stvara hidratacijska ljuska (slika 15), čije postojanje određuje njihovu topljivost u vodi.

Riža. 15. Stvaranje hidratacijske ovojnice oko proteinske molekule.

Na topljivost proteina utječe prisutnost neutralnih soli (Na 2 SO 4 , (NH 4) 2 SO 4 itd.) u otopini. Pri niskim koncentracijama soli povećava se topljivost proteina (slika 16), budući da se pod takvim uvjetima povećava stupanj disocijacije polarnih skupina i nabijene skupine proteinskih molekula su zaštićene, čime se smanjuje interakcija protein-protein, što pridonosi stvaranju agregata i taloženja proteina. Pri visokim koncentracijama soli smanjuje se topljivost proteina (slika 16) zbog razaranja hidratacijske ljuske, što dovodi do agregacije proteinskih molekula.

Riža. 16. Ovisnost topljivosti proteina o koncentraciji soli

Postoje proteini koji se otapaju samo u otopinama soli, a ne otapaju se u čistoj vodi, takvi se proteini nazivaju globulini. Postoje i drugi proteini albumini, za razliku od globulina, vrlo su topljivi u čistoj vodi.
Topivost proteina također ovisi o pH otopina. Kao što smo već primijetili, proteini imaju minimalnu topljivost u izoelektričnoj točki, što se objašnjava nepostojanjem elektrostatskog odbijanja između proteinskih molekula.
Pod određenim uvjetima, proteini mogu formirati gelove. Tijekom stvaranja gela proteinske molekule tvore gustu mrežu čija je unutrašnjost ispunjena otapalom. Želatine tvore npr. želatina (ovaj protein se koristi za izradu želea) i mliječni proteini u pripremi jogurta.
Temperatura također utječe na topljivost proteina. Pod djelovanjem visoke temperature dolazi do taloženja mnogih proteina zbog narušavanja njihove strukture, no o tome će biti više riječi u sljedećem odjeljku.

Denaturacija proteina

Razmotrimo jedan dobro poznati fenomen. Zagrijavanjem bjelanjak postupno postaje mutan, a zatim nastaje čvrsti ugrušak. Zgrušani bjelanjak - albumin jajeta - nakon hlađenja je netopljiv, dok je prije zagrijavanja bjelanjak jako topiv u vodi. Isti se fenomen događa kada se gotovo svi globularni proteini zagrijavaju. Promjene koje nastaju tijekom zagrijavanja nazivaju se denaturacija. Proteini u svom prirodnom stanju nazivaju se domaći proteini, a nakon denaturacije - denaturiran.
Tijekom denaturacije dolazi do poremećaja prirodne konformacije proteina kao rezultat kidanja slabih veza (ionske, vodikove, hidrofobne interakcije). Kao rezultat ovog procesa, kvaternarne, tercijarne i sekundarne strukture proteina mogu biti uništene. Primarna struktura je sačuvana (sl. 17).

Riža. 17. Denaturacija proteina

Tijekom denaturacije na površini se pojavljuju hidrofobni radikali aminokiselina koji se nalaze u nativnim proteinima u dubini molekule, čime se stvaraju uvjeti za agregaciju. Talože se nakupine proteinskih molekula. Denaturacija je praćena gubitkom biološke funkcije proteina.

Denaturacija proteina može biti uzrokovana ne samo povišenom temperaturom, već i drugim čimbenicima. Kiseline i lužine mogu izazvati denaturaciju proteina: kao rezultat njihovog djelovanja dolazi do ponovnog punjenja ionogenih skupina, što dovodi do kidanja ionskih i vodikovih veza. Urea uništava vodikove veze, što rezultira gubitkom njihove prirodne strukture od strane proteina. Denaturirajuća sredstva su organska otapala i ioni teških metala: organska otapala uništavaju hidrofobne veze, a ioni teških metala stvaraju netopljive komplekse s proteinima.

Uz denaturaciju postoji i obrnuti proces - renaturacija. Uklanjanjem denaturirajućeg faktora moguće je vratiti izvornu nativnu strukturu. Na primjer, kada se otopina polako ohladi na sobnu temperaturu, obnavljaju se izvorna struktura i biološka funkcija tripsina.

Proteini također mogu biti denaturirani u stanici tijekom normalnih životnih procesa. Sasvim je očito da je gubitak prirodne strukture i funkcije proteina krajnje nepoželjan događaj. U tom smislu treba spomenuti posebne proteine ​​- pratioci. Ovi proteini su sposobni prepoznati djelomično denaturirane proteine ​​i, vezanjem na njih, vratiti njihovu nativnu konformaciju. Šaperoni također prepoznaju proteine ​​koji su daleko od denaturacije i transportiraju ih do lizosoma gdje se razgrađuju. Šaperoni također igraju važnu ulogu u formiranju tercijarnih i kvarternih struktura tijekom sinteze proteina.

Zanimljivo znati! Trenutno se često spominje takva bolest kao što je bolest kravljeg ludila. Ovu bolest uzrokuju prioni. Također mogu uzrokovati druge neurodegenerativne bolesti kod životinja i ljudi. Prioni su proteinski infektivni agensi. Kada prion uđe u stanicu, uzrokuje promjenu u konformaciji svog staničnog dvojnika, koji sam postaje prion. Tako nastaje bolest. Prionski protein razlikuje se od staničnih proteina po svojoj sekundarnoj strukturi. Prionski oblik proteina je uglavnomb-naborana struktura i stanična -a- spirala.

Donjecka srednja škola I - III stupnja br. 21

„Vjeverice. Dobivanje proteina reakcijom polikondenzacije aminokiselina. Primarna, sekundarna i tercijarna struktura proteina. Kemijska svojstva proteina: izgaranje, denaturacija, hidroliza i obojene reakcije. Biokemijske funkcije proteina".

Pripremljeno

profesorica kemije

učitelj – metodičar

Donjeck, 2016

“Život je način postojanja proteinskih tijela”

Tema lekcije. Vjeverice. Dobivanje proteina reakcijom polikondenzacije aminokiselina. Primarna, sekundarna i tercijarna struktura proteina. Kemijska svojstva proteina: izgaranje, denaturacija, hidroliza i obojene reakcije. Biokemijske funkcije proteina.

Ciljevi lekcije. Upoznati učenike s proteinima kao najvišim stupnjem razvoja tvari u prirodi koji je doveo do nastanka života; prikazati njihovu građu, svojstva i raznolikost bioloških funkcija; proširiti pojam reakcije polikondenzacije na primjeru dobivanja bjelančevina, informirati učenike o higijeni hrane, o očuvanju zdravlja. Razvijati logičko mišljenje kod učenika.

Reagensi i oprema. Tablica "Primarne, sekundarne i tercijarne strukture proteina". Reagensi: HNO3, NaOH, CuSO4, pileći protein, vuneni konac, kemijsko stakleno posuđe.

metoda lekcije. Informacije i razvoj.

Vrsta lekcije. Lekcija svladavanja novih znanja i vještina.

Tijekom nastave

ja Organiziranje vremena.

II. Provjera domaće zadaće, obnavljanje i ispravak temeljnog znanja.

Blitz anketa

1. Objasnite pojam "aminokiselina".

2. Navedi funkcionalne skupine koje čine aminokiseline.

3. Nomenklatura aminokiselina i njihova izomerija.

4. Zašto aminokiseline pokazuju amfoterna svojstva? Napiši jednadžbe kemijskih reakcija.

5. Zbog kojih svojstava aminokiseline tvore polipeptide. Napiši reakciju polikondenzacije aminokiselina.

III. Poruka teme, ciljevi lekcije, motivacija obrazovnih aktivnosti.

IV. Percepcija i početna svijest o novom materijalu.

Učitelj, nastavnik, profesor.

“Gdje god sretnemo život, nalazimo da je povezan s nekom vrstom proteinskog tijela”, napisao je F. Engels u svojoj knjizi “Anti-Dühring”. Nedostatak proteina u hrani dovodi do općeg slabljenja tijela, kod djece - do usporavanja mentalnog i tjelesnog razvoja. Danas više od polovice čovječanstva ne dobiva potrebnu količinu proteina iz hrane. Osoba treba 115 g proteina dnevno, proteini se ne pohranjuju u rezervi, za razliku od ugljikohidrata i masti, pa morate pratiti svoju prehranu. Poznat nam je keratin - protein koji čini kosu, nokte, perje, kožu - on ima građevnu funkciju; upoznat s proteinom pepsinom - nalazi se u želučanom soku i sposoban je uništiti druge proteine ​​tijekom probave; protein trombin sudjeluje u zgrušavanju krvi; hormon gušterače - inzulin - regulira metabolizam glukoze; hemoglobin prenosi O2 do svih stanica i tkiva u tijelu itd.

Odakle dolazi ta beskrajna raznolikost proteinskih molekula, raznolikost njihovih funkcija i njihova posebna uloga u životnim procesima? Kako bismo odgovorili na ovo pitanje, okrenimo se sastavu i strukturi proteina.

Sastoje li se proteini od atoma?

Kako bismo odgovorili na ovo pitanje, napravimo zagrijavanje. Pogodite zagonetke i objasnite značenje odgovora.

1. On je posvuda i posvuda:

U kamenu, u zraku, u vodi.

On je u jutarnjoj rosi

I plavo na nebu.

(kisik)

2. Ja sam najlakši element,

U prirodi ni koraka bez mene.

A s kisikom sam trenutno

3. U zraku, to je glavni plin,

Okružuje nas posvuda.

Život biljaka nestaje

Bez toga, bez gnojiva.

Živi u našim stanicama

4. Školarci su išli u pohod

(Ovo je pristup kemijskom problemu).

Noću je mjesec palio vatru,

Pjevale su se pjesme o svijetloj vatri.

Odbacite svoje osjećaje:

Koji su elementi izgorjeli u požaru?

(ugljik, vodik)

Da, tako je, ovo su glavni kemijski elementi koji čine protein.

Ova četiri elementa mogu se reći Schillerovim riječima: "Četiri elementa, spajajući se zajedno, daju život i grade svijet."

Proteini su prirodni polimeri koji se sastoje od ostataka α-aminokiselina povezanih peptidnim vezama.

Sastav bjelančevina uključuje 20 različitih aminokiselina, otuda velika raznolikost bjelančevina u njihovim različitim kombinacijama. U ljudskom tijelu ima do 100.000 proteina.

Referenca povijesti.

Prva hipoteza o strukturi proteinske molekule predložena je 70-ih godina prošlog stoljeća. 19. stoljeća To je bila ureidna teorija strukture proteina.

Godine 1903 Njemački znanstvenici izrazili su teoriju peptida, koja je dala ključ za tajnu strukture proteina. Fisher je sugerirao da su proteini polimeri aminokiselina povezanih peptidnim vezama.

Ideja da su proteini polimerne formacije izražena je već 70-88 godina. 19. stoljeća , ruski znanstvenici. Ova je teorija potvrđena u modernim radovima.

Čak i prvo upoznavanje s proteinima daje neku ideju o izuzetno složenoj strukturi njihovih molekula. Proteini se dobivaju reakcijom polikondenzacije aminokiselina:

https://pandia.ru/text/80/390/images/image007_47.gif" width="16" height="18">H - N - CH2 - C + H - N - CH2 - C →

https://pandia.ru/text/80/390/images/image012_41.gif" height="20">

NH2 - CH - C - N - CH - C - N - CH - C - ... + nH2O →

⸗ O ⸗ O ⸗ O

→ NH2 – CH – C + NH2 – CH – C + NH2 – CH – C + …

OH OH OH

4. Učitelj demonstrira doživljaj: spaljivanje vunenog konca; osjeća se miris spaljenog perja - tako možete razlikovati vunu od tkanina drugih vrsta.

V. Generalizacija i sistematizacija znanja.

1. Napravite osnovni sažetak proteina.

osnova života ← Proteini → polipeptidi

(C, H, O, N) ↓ ↓ ↓ \ strukture proteina

kemijske funkcije boja

koja svojstva proteinskih reakcija

2. Napišite jednadžbe reakcije za nastanak dipeptida iz glicina i valina.

VI. Sažetak lekcije, domaća zadaća.

Naučite §38 str. 178 - 184. Izvršite ispitne zadatke str. 183.

broj 1. Proteini: peptidna veza, njihova detekcija.

Proteini su makromolekule linearnih poliamida koje formiraju a-aminokiseline kao rezultat reakcije polikondenzacije u biološkim objektima.

Vjeverice su makromolekularni spojevi građeni od aminokiseline. 20 aminokiselina sudjeluje u stvaranju proteina. Oni se međusobno povezuju u duge lance koji čine okosnicu proteinske molekule velike molekularne težine.

Funkcije proteina u tijelu

Kombinacija osebujnih kemijskih i fizičkih svojstava proteina daje ovoj posebnoj klasi organskih spojeva središnju ulogu u pojavama života.

Proteini imaju sljedeća biološka svojstva, odnosno obavljaju sljedeće glavne funkcije u živim organizmima:

1. Katalitička funkcija proteina. Svi biološki katalizatori – enzimi su proteini. Do danas je okarakterizirano tisuće enzima, od kojih su mnogi izolirani u kristalnom obliku. Gotovo svi enzimi su snažni katalizatori, povećavajući stope reakcija za najmanje milijun puta. Ova funkcija proteina je jedinstvena, nije karakteristična za druge polimerne molekule.

2. Nutritivni (rezervna funkcija bjelančevina). To su prije svega proteini namijenjeni prehrani embrija u razvoju: mliječni kazein, ovalbumin jajeta, skladišni proteini biljnog sjemena. Brojni drugi proteini nedvojbeno se koriste u tijelu kao izvor aminokiselina, koje su, pak, prekursori biološki aktivnih tvari koje reguliraju metabolički proces.

3. Transportna funkcija proteina. Mnoge male molekule i ione prenose specifični proteini. Na primjer, respiratornu funkciju krvi, odnosno prijenos kisika, obavljaju molekule hemoglobina, proteina u crvenim krvnim stanicama. Serumski albumini sudjeluju u transportu lipida. Brojni drugi proteini sirutke stvaraju komplekse s mastima, bakrom, željezom, tiroksinom, vitaminom A i drugim spojevima, osiguravajući njihovu dostavu do odgovarajućih organa.

4. Zaštitna funkcija proteina. Glavnu funkciju zaštite obavlja imunološki sustav koji osigurava sintezu specifičnih zaštitnih proteina – protutijela – kao odgovor na ulazak bakterija, toksina ili virusa (antigena) u organizam. Protutijela vežu antigene, u interakciji s njima, neutraliziraju njihov biološki učinak i održavaju normalno stanje organizma. Koagulacija proteina krvne plazme - fibrinogena - i stvaranje krvnog ugruška koji štiti od gubitka krvi tijekom ozljeda još je jedan primjer zaštitne funkcije proteina.

5. Kontraktilna funkcija proteina. Mnogi proteini sudjeluju u činu kontrakcije i opuštanja mišića. Glavnu ulogu u tim procesima igraju aktin i miozin - specifični proteini mišićnog tkiva. Kontraktilna funkcija također je svojstvena proteinima subcelularnih struktura, što osigurava najfinije procese vitalne aktivnosti stanice,

6. Strukturna funkcija proteina. Proteini s ovom funkcijom zauzimaju prvo mjesto među ostalim proteinima u ljudskom tijelu. Strukturni proteini poput kolagena široko su raspoređeni u vezivnom tkivu; keratin u kosi, noktima, koži; elastin - u zidovima krvnih žila itd.

7. Hormonska (regulatorna) funkcija proteina. Metabolizam u tijelu reguliran je različitim mehanizmima. U ovoj regulaciji važno mjesto zauzimaju hormoni koje proizvode endokrine žlijezde. Brojni hormoni predstavljeni su proteinima ili polipeptidima, na primjer, hormoni hipofize, gušterače itd.

Peptidna veza

Formalno, stvaranje proteinske makromolekule može se prikazati kao reakcija polikondenzacije α-aminokiselina.

S kemijskog gledišta, proteini su visokomolekularni organski spojevi (poliamidi) koji sadrže dušik, a čije su molekule građene od ostataka aminokiselina. Proteinski monomeri su α-aminokiseline, čija je zajednička karakteristika prisutnost karboksilne skupine -COOH i amino skupine -NH 2 na drugom atomu ugljika (α-atomu ugljika):

Na temelju rezultata proučavanja produkata hidrolize proteina koje je iznio A.Ya. Ideje Danilevskog o ulozi peptidnih veza -CO-NH- u izgradnji proteinske molekule, njemački znanstvenik E. Fischer predložio je početkom 20. stoljeća peptidnu teoriju strukture proteina. Prema ovoj teoriji, proteini su linearni polimeri α-aminokiselina povezanih peptidom veza - polipeptidi:

U svakom peptidu, jedan krajnji aminokiselinski ostatak ima slobodnu α-amino skupinu (N-kraj), a drugi ima slobodnu α-karboksilnu skupinu (C-kraj). Struktura peptida obično se prikazuje počevši od N-terminalne aminokiseline. U ovom slučaju, aminokiselinski ostaci su označeni simbolima. Na primjer: Ala-Tyr-Leu-Ser-Tyr- - Cys. Ovaj unos označava peptid u kojem je N-terminalna α-aminokiselina ­ lyatsya alanin, i C-terminal - cistein. Prilikom čitanja takvog zapisa, završeci naziva svih kiselina, osim posljednjih, mijenjaju se u - "il": alanil-tirozil-leucil-seril-tirozil--cistein. Duljina peptidnog lanca u peptidima i proteinima koji se nalaze u tijelu kreće se od dvije do stotine i tisuće aminokiselinskih ostataka.

broj 2. Klasifikacija jednostavnih proteina.

Do jednostavan (proteini) uključuju proteine ​​koji hidrolizirajući daju samo aminokiseline.

Proteinoidi ____jednostavne bjelančevine životinjskog podrijetla, netopljive u vodi, otopinama soli, razrijeđenim kiselinama i lužinama. Oni obavljaju uglavnom potporne funkcije (na primjer, kolagen, keratin

protamini - pozitivno nabijeni nuklearni proteini, molekulske mase 10-12 kDa. Otprilike 80% se sastoji od alkalnih aminokiselina, što im omogućuje interakciju s nukleinskim kiselinama putem ionskih veza. Sudjeluju u regulaciji aktivnosti gena. Dobro topljiv u vodi;

histoni - nuklearni proteini koji imaju važnu ulogu u regulaciji aktivnosti gena. Nalaze se u svim eukariotskim stanicama, a podijeljeni su u 5 klasa, koje se razlikuju po molekularnoj težini i aminokiselinama. Molekulska masa histona je u rasponu od 11 do 22 kDa, a razlike u sastavu aminokiselina odnose se na lizin i arginin čiji sadržaj varira od 11 do 29%, odnosno od 2 do 14%;

prolamini - netopljiv u vodi, ali topiv u 70% alkoholu, karakteristike kemijske strukture - puno prolina, glutaminske kiseline, bez lizina ,

glutelini - topiv u lužnatim otopinama ,

globulini - proteini koji su netopljivi u vodi i poluzasićenoj otopini amonijevog sulfata, ali topljivi u vodenim otopinama soli, lužina i kiselina. Molekulska težina - 90-100 kDa;

albumini - proteini životinjskih i biljnih tkiva, topljivi u vodi i slanim otopinama. Molekularna težina je 69 kDa;

skleroproteini - proteini potpornih tkiva životinja

Primjeri jednostavnih proteina su fibroin svile, albumin iz seruma jaja, pepsin, itd.

Broj 3. Metode izolacije i taloženja (pročišćavanja) proteina.

broj 4. Proteini kao polielektroliti. Izoelektrična točka proteina.

Proteini su amfoterni polielektroliti, tj. pokazuju i kisela i bazična svojstva. To je zbog prisutnosti u proteinskim molekulama radikala aminokiselina sposobnih za ionizaciju, kao i slobodnih α-amino i α-karboksilnih skupina na krajevima peptidnih lanaca. Kisela svojstva proteina daju kisele aminokiseline (asparaginska, glutaminska), a alkalna svojstva - bazične aminokiseline (lizin, arginin, histidin).

Naboj proteinske molekule ovisi o ionizaciji kiselih i bazičnih skupina radikala aminokiselina. Ovisno o omjeru negativnih i pozitivnih skupina, proteinska molekula kao cjelina dobiva ukupni pozitivni ili negativni naboj. Kada se otopina proteina zakiseli, stupanj ionizacije anionskih skupina se smanjuje, dok se kationskih skupina povećava; kada je alkaliziran - obrnuto. Pri određenoj pH vrijednosti izjednačava se broj pozitivno i negativno nabijenih skupina i javlja se izoelektrično stanje proteina (ukupni naboj je 0). pH vrijednost pri kojoj je protein u izoelektričnom stanju naziva se izoelektrična točka i označava pI, slično aminokiselinama. Za većinu proteina, pI leži u rasponu od 5,5-7,0, što ukazuje na određenu prevlast kiselih aminokiselina u proteinima. No, postoje i alkalne bjelančevine, na primjer, salmin - glavni protein iz lososove mljevenosti (pl=12). Osim toga, postoje proteini koji imaju vrlo nisku pI vrijednost, npr. pepsin, enzim želučanog soka (pl=l). U izoelektričnoj točki, proteini su vrlo nestabilni i lako se talože, imaju najmanju topljivost.

Ako protein nije u izoelektričnom stanju, tada će se u električnom polju njegove molekule kretati prema katodi ili anodi, ovisno o predznaku ukupnog naboja i brzinom proporcionalnom njegovoj vrijednosti; to je bit metode elektroforeze. Ova metoda može odvojiti proteine ​​s različitim pI vrijednostima.

Iako proteini imaju svojstva pufera, njihov kapacitet pri fiziološkim pH vrijednostima je ograničen. Iznimka su proteini koji sadrže mnogo histidina, jer samo histidinski radikal ima svojstva pufera u pH rasponu od 6-8. Tih proteina ima jako malo. Na primjer, hemoglobin, koji sadrži gotovo 8% histidina, snažan je unutarstanični pufer u crvenim krvnim stanicama, održavajući pH krvi na konstantnoj razini.

broj 5. Fizikalno-kemijska svojstva proteina.

Proteini imaju različita kemijska, fizikalna i biološka svojstva, koja su određena aminokiselinskim sastavom i prostornom organizacijom svakog proteina. Kemijske reakcije proteina vrlo su raznolike, a rezultat su prisutnosti NH 2 -, COOH skupina i radikala različite prirode. To su reakcije nitracije, acilacije, alkilacije, esterifikacije, redoks i druge. Proteini imaju acidobazna, puferska, koloidna i osmotska svojstva.

Acidobazna svojstva proteina

Kemijska svojstva. Slabim zagrijavanjem vodenih otopina proteina dolazi do denaturacije. Ovo stvara talog.

Kada se proteini zagrijavaju s kiselinama, dolazi do hidrolize i formiranja smjese aminokiselina.

Fizikalno-kemijska svojstva proteina

Proteini imaju veliku molekulsku masu.

Naboj proteinske molekule. Svi proteini imaju najmanje jednu slobodnu -NH i -COOH skupinu.

Proteinske otopine- koloidne otopine različitih svojstava. Proteini su kiseli i bazni. Kiseli proteini sadrže puno glu i asp, koji imaju dodatne karboksilne i manje amino skupina. U alkalnim proteinima ima mnogo liza i argova. Svaka molekula proteina u vodenoj otopini okružena je hidratacijskom ljuskom, jer proteini imaju mnogo hidrofilnih skupina (-COOH, -OH, -NH 2, -SH) zbog aminokiselina. U vodenim otopinama proteinska molekula ima naboj. Naboj proteina u vodi može se mijenjati ovisno o pH.

Taloženje proteina. Proteini imaju hidratacijsku ljusku, naboj koji sprječava lijepljenje. Za taloženje je potrebno ukloniti hidratnu ljusku i naboj.

1. Hidratacija. Proces hidratacije znači vezanje vode proteinima, pri čemu oni pokazuju hidrofilna svojstva: bubre, povećavaju se njihova masa i volumen. Bubrenje proteina prati njegovo djelomično otapanje. Hidrofilnost pojedinih proteina ovisi o njihovoj strukturi. Hidrofilne amidne (–CO–NH–, peptidna veza), aminske (NH2) i karboksilne (COOH) skupine prisutne u sastavu i smještene na površini proteinske makromolekule privlače molekule vode, striktno ih usmjeravajući prema površini molekule. . Okružujući proteinske globule, hidratna (vodena) ljuska sprječava stabilnost proteinskih otopina. U izoelektričnoj točki proteini imaju najmanju sposobnost vezanja vode, hidratacijska ljuska oko proteinskih molekula je uništena, pa se one spajaju i tvore velike agregate. Do agregacije proteinskih molekula dolazi i kada se one dehidriraju nekim organskim otapalima, poput etilnog alkohola. To dovodi do taloženja proteina. Kada se pH medija promijeni, makromolekula proteina postaje nabijena i mijenja se njezin hidratacijski kapacitet.

Reakcije taloženja dijele se u dvije vrste.

Isoljavanje proteina: (NH 4)SO 4 - uklanja se samo hidratacijska ljuska, protein zadržava sve vrste svoje strukture, sve veze, zadržava svoja izvorna svojstva. Takvi se proteini zatim mogu ponovno otopiti i koristiti.

Taloženje s gubitkom svojstava prirodnih proteina nepovratan je proces. Hidracijska ljuska i naboj se uklanjaju iz proteina, različita svojstva u proteinu su narušena. Na primjer, soli bakra, žive, arsena, željeza, koncentrirane anorganske kiseline - HNO 3 , H 2 SO 4 , HCl, organske kiseline, alkaloidi - tanini, živin jodid. Dodatak organskih otapala smanjuje stupanj hidratacije i dovodi do taloženja proteina. Kao takvo otapalo koristi se aceton. Proteini se također talože uz pomoć soli, na primjer, amonijevog sulfata. Princip ove metode temelji se na činjenici da se s povećanjem koncentracije soli u otopini ionske atmosfere formirane od protuiona proteina komprimiraju, što pridonosi njihovoj konvergenciji do kritične udaljenosti, na kojoj intermolekularne sile van der Waalsova privlačnost nadmašuje Coulombove sile odbijanja protuiona. To dovodi do prianjanja proteinskih čestica i njihovog taloženja.

Prilikom vrenja, molekule proteina počinju se kretati nasumično, sudaraju se, naboj se uklanja, a hidratacijska ljuska se smanjuje.

Za otkrivanje proteina u otopini koriste se sljedeći:

reakcije boja;

reakcije taloženja.

Metode izolacije i pročišćavanja proteina.

homogenizacija- stanice se samelju do homogene mase;

ekstrakcija bjelančevina vodom ili otopinama vode i soli;

1. soljenje;

   elektroforeza;

   kromatografija: adsorpcija, cijepanje;

   ultracentrifugiranje.

Strukturna organizacija proteina.

Primarna struktura- određeno slijedom aminokiselina u peptidnom lancu, stabiliziranom kovalentnim peptidnim vezama (inzulin, pepsin, kimotripsin).

sekundarna struktura- prostorna struktura proteina. Ovo je ili spirala ili preklapanje. Stvaraju se vodikove veze.

Tercijarna struktura globularni i fibrilarni proteini. Stabiliziraju vodikove veze, elektrostatske sile (COO-, NH3+), hidrofobne sile, sulfidne mostove, određene su primarnom strukturom. Globularni proteini - svi enzimi, hemoglobin, mioglobin. Fibrilarni proteini - kolagen, miozin, aktin.

Kvartarna struktura- nalazi se samo u nekim proteinima. Takvi su proteini građeni od nekoliko peptida. Svaki peptid ima svoju primarnu, sekundarnu, tercijarnu strukturu, nazvanu protomeri. Nekoliko protomera spaja se u jednu molekulu. Jedan protomer ne funkcionira kao protein, već samo u sprezi s drugim protomerima.

Primjer: hemoglobin \u003d -globula + -globula - nosi O 2 u agregatu, a ne odvojeno.

Protein može renaturirati. To zahtijeva vrlo kratko izlaganje agensima.

6) Metode detekcije proteina.

Proteini su visokomolekularni biološki polimeri čije su strukturne (monomerne) jedinice -aminokiseline. Aminokiseline u proteinima su međusobno povezane peptidnim vezama. do čijeg nastajanja dolazi zahvaljujući karboksilnoj skupini koja stoji na -ugljikov atom jedne aminokiseline i -aminska skupina druge aminokiseline uz oslobađanje molekule vode. Monomerne jedinice proteina nazivaju se aminokiselinski ostaci.

Peptidi, polipeptidi i proteini razlikuju se ne samo po količini, sastavu, već i po redoslijedu aminokiselinskih ostataka, fizikalno-kemijskim svojstvima i funkcijama koje obavljaju u tijelu. Molekularna težina proteina varira od 6 tisuća do 1 milijun ili više. Kemijska i fizikalna svojstva proteina posljedica su kemijske prirode i fizikalno-kemijskih svojstava radikala koji čine njihove aminokiselinske ostatke. Metode detekcije i kvantifikacije proteina u biološkim objektima i hrani, kao i njihova izolacija iz tkiva i bioloških tekućina temelje se na fizikalnim i kemijskim svojstvima ovih spojeva.

Proteini u interakciji s određenim kemikalijama daju obojene spojeve. Stvaranje ovih spojeva događa se uz sudjelovanje radikala aminokiselina, njihovih specifičnih skupina ili peptidnih veza. Reakcije boja omogućuju vam postavljanje prisutnost proteina u biološkom objektu ili rješenje i dokazati prisutnost određene aminokiseline u proteinskoj molekuli. Na temelju obojenih reakcija razvijene su neke metode za kvantitativno određivanje proteina i aminokiselina.

Smatrajte univerzalnim biuretske i ninhidrinske reakcije, budući da ih svi proteini daju. Ksantoproteinska reakcija, Fohlova reakcija a drugi su specifični jer nastaju zbog radikalnih skupina određenih aminokiselina u proteinskoj molekuli.

Reakcije u boji omogućuju vam da utvrdite prisutnost proteina u materijalu koji se proučava i prisutnost određenih aminokiselina u njegovim molekulama.

Biuretska reakcija. Reakcija je zbog prisutnosti u proteinima, peptidima, polipeptidima peptidne veze, koji u alkalnom mediju tvore sa ioni bakra(II). kompleksni spojevi obojeni u ljubičasta (s crvenom ili plavom nijansom) boja. Boja je posljedica prisutnosti najmanje dvije skupine u molekuli -CO-NH- međusobno izravno povezani ili uz sudjelovanje atoma ugljika ili dušika.

Ioni bakra (II) povezani su dvjema ionskim vezama s =C─O ˉ skupinama i četirima koordinacijskim vezama s atomima dušika (=N−).

Intenzitet boje ovisi o količini proteina u otopini. To omogućuje korištenje ove reakcije za kvantitativno određivanje proteina. Boja obojenih otopina ovisi o duljini polipeptidnog lanca. Bjelančevine daju plavoljubičastu boju; produkti njihove hidrolize (poli- i oligopeptidi) su crvene ili ružičaste boje. Biuretnu reakciju daju ne samo proteini, peptidi i polipeptidi, već i biuret (NH 2 -CO-NH-CO-NH 2), oksamid (NH 2 -CO-CO-NH 2), histidin.

Kompleksni spoj bakra (II) s peptidnim skupinama formiranim u alkalnom mediju ima sljedeću strukturu:

Ninhidrinska reakcija. U ovoj reakciji otopine proteina, polipeptida, peptida i slobodnih α-aminokiselina zagrijavanjem s ninhidrinom daju plavu, plavoljubičastu ili ružičastoljubičastu boju. Boja se u ovoj reakciji razvija zbog α-amino skupine.

-aminokiseline vrlo lako reagiraju s ninhidrinom. Uz njih, Ruemanovu plavoljubičastu tvore i proteini, peptidi, primarni amini, amonijak i neki drugi spojevi. Sekundarni amini, kao što su prolin i hidroksiprolin, daju žutu boju.

Ninhidrinska reakcija naširoko se koristi za otkrivanje i kvantificiranje aminokiselina.

ksantoproteinska reakcija. Ova reakcija ukazuje na prisutnost ostataka aromatskih aminokiselina u proteinima - tirozin, fenilalanin, triptofan. Temelji se na nitriranju benzenskog prstena radikala ovih aminokiselina uz stvaranje žuto obojenih nitro spojeva (grčki "Xanthos" - žuto). Koristeći tirozin kao primjer, ova se reakcija može opisati u obliku sljedećih jednadžbi.

U alkalnoj sredini nitro derivati ​​aminokiselina tvore soli kinoidne strukture, narančasto obojene. Ksantoproteinsku reakciju daju benzen i njegovi homolozi, fenol i drugi aromatski spojevi.

Reakcije na aminokiseline koje sadrže tiolnu skupinu u reduciranom ili oksidiranom stanju (cistein, cistin).

Fohlova reakcija. Kada se kuha s alkalijom, sumpor se lako odvaja od cisteina u obliku sumporovodika, koji u alkalnom mediju tvori natrijev sulfid:

U tom smislu, reakcije za određivanje aminokiselina koje sadrže tiol u otopini podijeljene su u dvije faze:

Prijelaz sumpora iz organskog u anorgansko stanje

Detekcija sumpora u otopini

Za otkrivanje natrijevog sulfida koristi se olovni acetat, koji se u interakciji s natrijevim hidroksidom pretvara u plumbit:

Pb(CH 3 GUGUTATI) 2 + 2NaOH Pb(ONa) 2 + 2CH 3 COOH

Kao rezultat interakcije iona sumpora i olova nastaje crni ili smeđi olovni sulfid:

Na 2 S + Pb(ONA) 2 + 2 H 2 O PbS (crni talog) + 4NaOH

Da bi se odredile aminokiseline koje sadrže sumpor, ispitivanoj otopini dodaju se jednaki volumen natrijevog hidroksida i nekoliko kapi otopine olovnog acetata. Uz intenzivno kuhanje 3-5 minuta tekućina pocrni.

Prisutnost cistina može se odrediti ovom reakcijom, jer se cistin lako reducira u cistein.

Millonova reakcija:

Ovo je reakcija na aminokiselinu tirozin.

Slobodni fenolni hidroksili molekula tirozina u interakciji sa solima daju spojeve živine soli nitro derivata tirozina, obojene ružičasto crveno:

Paulijeva reakcija na histidin i tirozin . Paulijeva reakcija omogućuje otkrivanje aminokiselina histidina i tirozina u proteinu, koji tvore kompleksne spojeve boje trešnje s diazobenzensulfonskom kiselinom. Diazobenzensulfonska kiselina nastaje u reakciji diazotiranja kada sulfanilna kiselina reagira s natrijevim nitritom u kiselom mediju:

Jednaki volumen kisele otopine sulfanilne kiseline (pripremljene korištenjem klorovodične kiseline) i dvostruki volumen otopine natrijevog nitrita dodaju se ispitivanoj otopini, dobro promiješaju i odmah dodaju sodu (natrijev karbonat). Nakon miješanja smjesa postaje trešnjasto crvena, pod uvjetom da je u ispitivanoj otopini prisutan histidin ili tirozin.

Adamkevich-Hopkins-Kohl (Schulz-Raspail) reakcija na triptofan (reakcija na skupinu indola). Triptofan reagira u kiseloj sredini s aldehidima, stvarajući obojene kondenzacijske proizvode. Reakcija se odvija zahvaljujući interakciji indolnog prstena triptofana s aldehidom. Poznato je da formaldehid nastaje iz glioksilne kiseline u prisutnosti sumporne kiseline:

R
Otopine koje sadrže triptofan u prisutnosti glioksilne i sumporne kiseline daju crveno-ljubičastu boju.

Glioksilna kiselina uvijek je prisutna u malim količinama u ledenoj octenoj kiselini. Stoga se reakcija može izvesti upotrebom octene kiseline. Istodobno se ispitivanoj otopini dodaje jednaki volumen ledene (koncentrirane) octene kiseline i lagano zagrijava dok se talog ne otopi. Nakon hlađenja, volumen koncentrirane sumporne kiseline jednak je dodanom volumenu glioksilne kiseline. smjesu pažljivo duž stijenke (kako biste izbjegli miješanje tekućina). Nakon 5-10 minuta uočava se stvaranje crveno-ljubičastog prstena na granici između dva sloja. Ako pomiješate slojeve, sadržaj posude će ravnomjerno postati ljubičast.

Do

kondenzacija triptofana s formaldehidom:

Produkt kondenzacije se oksidira u bis-2-triptofanilkarbinol, koji u prisutnosti mineralnih kiselina stvara plavo-ljubičaste soli:

7) Klasifikacija proteina. Metode proučavanja sastava aminokiselina.

Još uvijek ne postoji stroga nomenklatura i klasifikacija proteina. Imena proteina daju se nasumično, najčešće uzimajući u obzir izvor izolacije proteina ili njegovu topljivost u određenim otapalima, oblik molekule i sl.

Proteini se klasificiraju prema sastavu, obliku čestica, topljivosti, sastavu aminokiselina, podrijetlu itd.

1. Sastav Proteini se dijele u dvije velike skupine: jednostavni i složeni proteini.

Jednostavni (proteini) su proteini koji hidrolizom daju samo aminokiseline (proteinoidi, protamini, histoni, prolamini, glutelini, globulini, albumini). Primjeri jednostavnih proteina su fibroin svile, albumin iz seruma jaja, pepsin, itd.

Složeni (proteidi) uključuju proteine ​​sastavljene od jednostavnog proteina i dodatne (prostetske) skupine neproteinske prirode. Skupina složenih proteina podijeljena je u nekoliko podskupina ovisno o prirodi neproteinske komponente:

Metaloproteini koji u svom sastavu sadrže metale (Fe, Cu, Mg, itd.) izravno povezane s polipeptidnim lancem;

Fosfoproteini - sadrže ostatke fosforne kiseline, koji su vezani za molekulu proteina esterskim vezama na mjestu hidroksilnih skupina serina, treonina;

Glikoproteini – njihove prostetske skupine su ugljikohidrati;

Kromoproteini – sastoje se od jednostavnog proteina i s njim povezanog obojenog neproteinskog spoja, svi kromoproteini su biološki vrlo aktivni; kao prostetske skupine mogu sadržavati derivate porfirina, izoaloksazina i karotena;

Lipoproteini - lipidi prostetičke skupine - trigliceridi (masti) i fosfatidi;

Nukleoproteini su proteini koji se sastoje od jednog proteina i nukleinske kiseline povezane s njim. Ovi proteini igraju ogromnu ulogu u životu tijela i o njima će biti riječi u nastavku. Oni su dio svake stanice, neki nukleoproteini postoje u prirodi u obliku posebnih čestica s patogenim djelovanjem (virusi).

2. Oblik čestice- proteini se dijele na fibrilarne (končaste) i globularne (sferične) (vidi str. 30).

3. Po topljivosti i karakteristikama aminokiselinskog sastava razlikuju se sljedeće skupine jednostavnih proteina:

Proteinoidi - proteini potpornih tkiva (kosti, hrskavica, ligamenti, tetive, kosa, nokti, koža itd.). To su uglavnom fibrilarni proteini velike molekulske mase (> 150 000 Da), netopivi u uobičajenim otapalima: vodi, soli i vodeno-alkoholnim smjesama. Otapaju se samo u određenim otapalima;

Protamini (najjednostavniji proteini) - proteini koji su topljivi u vodi i sadrže 80-90% arginina i ograničen skup (6-8) drugih aminokiselina, prisutni su u mlijeku raznih riba. Zbog visokog sadržaja arginina imaju bazična svojstva, njihova molekularna masa je relativno mala i iznosi približno 4000-12000 Da. Proteinska su komponenta u sastavu nukleoproteina;

Histoni su visoko topljivi u vodi i razrijeđenim otopinama kiselina (0,1 N), imaju visok sadržaj aminokiselina: arginina, lizina i histidina (najmanje 30%) te stoga imaju bazična svojstva. Ti se proteini nalaze u značajnim količinama u jezgrama stanica kao dio nukleoproteina i imaju važnu ulogu u regulaciji metabolizma nukleinskih kiselina. Molekularna težina histona je mala i iznosi 11000-24000 Da;

Globulini su proteini netopivi u vodi i slanim otopinama s koncentracijom soli većom od 7%. Globulini se potpuno istalože pri 50% zasićenju otopine amonijevim sulfatom. Ove proteine ​​karakterizira visok sadržaj glicina (3,5%), njihova molekulska masa > 100 000 Da. Globulini su slabo kiseli ili neutralni proteini (p1=6-7,3);

Albumini su proteini koji su visoko topivi u vodi i jakim slanim otopinama, a koncentracija soli (NH 4) 2 S0 4 ne smije prelaziti 50% zasićenja. Pri većim koncentracijama albumini se isoljuju. U usporedbi s globulinima, ovi proteini sadrže tri puta manje glicina i imaju molekularnu težinu od 40.000-70.000 Da. Albumini imaju višak negativnog naboja i kisela svojstva (pl=4,7) zbog visokog sadržaja glutaminske kiseline;

Prolamini su skupina biljnih proteina koji se nalaze u glutenu žitarica. Topljivi su samo u 60-80% vodenoj otopini etilnog alkohola. Prolamini imaju karakterističan aminokiselinski sastav: sadrže dosta (20-50%) glutaminske kiseline i prolina (10-15%), po čemu su i dobili naziv. Njihova molekularna težina je preko 100 000 Da;

Glutelini - biljni proteini netopljivi su u vodi, otopinama soli i etanolu, ali su topljivi u razrijeđenim (0,1 N) otopinama lužina i kiselina. Po sastavu aminokiselina i molekularnoj masi slični su prolaminima, ali sadrže više arginina, a manje prolina.

Metode proučavanja sastava aminokiselina

Proteini se razgrađuju u aminokiseline pomoću enzima u probavnim sokovima. Izvedena su dva važna zaključka: 1) proteini sadrže aminokiseline; 2) metode hidrolize mogu se koristiti za proučavanje kemijskog, posebno aminokiselinskog sastava proteina.

Za proučavanje aminokiselinskog sastava proteina koristi se kombinacija kisele (HCl), alkalne [Ba(OH) 2 ] i, rjeđe, enzimske hidrolize ili jedne od njih. Utvrđeno je da se tijekom hidrolize čistog proteina koji ne sadrži nečistoće oslobađa 20 različitih α-aminokiselina. Sve ostale aminokiseline otkrivene u tkivima životinja, biljaka i mikroorganizama (više od 300) postoje u prirodi u slobodnom stanju ili u obliku kratkih peptida ili kompleksa s drugim organskim tvarima.

Prvi korak u određivanju primarne strukture proteina je kvalitativna i kvantitativna procjena aminokiselinskog sastava pojedinog proteina. Treba imati na umu da za studiju morate imati određenu količinu čistih proteina, bez nečistoća drugih proteina ili peptida.

Kisela hidroliza proteina

Za određivanje sastava aminokiselina potrebno je uništiti sve peptidne veze u proteinu. Analizirani protein se hidrolizira u 6 mol/l HCl na temperaturi od oko 110 °C tijekom 24 sata. Kao rezultat ovog tretmana, peptidne veze u proteinu se uništavaju, au hidrolizatu su prisutne samo slobodne aminokiseline. Osim toga, glutamin i asparagin se hidroliziraju u glutaminsku i asparaginsku kiselinu (tj. amidna veza u radikalu se prekida i amino skupina se od njih odcjepljuje).

Razdvajanje aminokiselina kromatografijom ionske izmjene

Smjesa aminokiselina dobivena kiselinskom hidrolizom proteina odvaja se u koloni s kationskom izmjenjivačkom smolom. Takva sintetička smola sadrži negativno nabijene skupine (na primjer, ostatke sulfonske kiseline -SO 3 -) čvrsto povezane s njom, na koje su vezani ioni Na + (slika 1-4).

Mješavina aminokiselina uvodi se u kationski izmjenjivač u kiseloj sredini (pH 3,0), gdje su aminokiseline uglavnom kationi, tj. nose pozitivan naboj. Pozitivno nabijene aminokiseline vežu se za negativno nabijene čestice smole. Što je veći ukupni naboj aminokiseline, to je jača njena veza sa smolom. Tako se na kationski izmjenjivač najjače vežu aminokiseline lizin, arginin i histidin, a najslabije asparaginska i glutaminska kiselina.

Oslobađanje aminokiselina iz kolone provodi se eluiranjem (eluiranjem) puferskom otopinom s povećanjem ionske jakosti (tj. s porastom koncentracije NaCl) i pH. S povećanjem pH aminokiseline gube proton, zbog čega se smanjuje njihov pozitivni naboj, a time i čvrstoća veze s negativno nabijenim česticama smole.

Svaka aminokiselina izlazi iz kolone pri određenom pH i ionskoj snazi. Sakupljanjem otopine (eluata) s donjeg kraja kolone u obliku malih dijelova mogu se dobiti frakcije koje sadrže pojedinačne aminokiseline.

(za više detalja o "hidrolizi" pogledajte pitanje #10)

8) Kemijske veze u strukturi proteina.

9) Pojam hijerarhije i strukturne organizacije proteina. (vidi pitanje #12)

10) Hidroliza proteina. Reakcijska kemija (stupnjevi, katalizatori, reagensi, reakcijski uvjeti) - potpuni opis hidrolize.

11) Kemijske transformacije proteina.

Denaturacija i renaturacija

Kada se otopine proteina zagriju na 60-80% ili pod djelovanjem reagensa koji uništavaju nekovalentne veze u proteinima, uništava se tercijarna (kvaternarna) i sekundarna struktura proteinske molekule, ona poprima oblik nasumične nasumične zavojnice do većoj ili manjoj mjeri. Taj se proces naziva denaturacija. Kao reagensi za denaturaciju mogu se koristiti kiseline, lužine, alkoholi, fenoli, urea, gvanidin klorid i dr. Suština njihovog djelovanja je u tome što stvaraju vodikove veze s =NH i =CO - skupinama peptidne okosnice i s kiselim skupinama radikali aminokiselina, zamjenjujući vlastite intramolekularne vodikove veze u proteinu, uslijed čega dolazi do promjene sekundarne i tercijarne strukture. Tijekom denaturacije smanjuje se topljivost proteina, on se "zgrušava" (na primjer, kod kuhanja kokošjeg jajeta), a biološka aktivnost proteina se gubi. Na temelju toga, na primjer, korištenje vodene otopine karbolne kiseline (fenol) kao antiseptik. Pod određenim uvjetima, uz polagano hlađenje otopine denaturiranog proteina, dolazi do renaturacije - vraćanja izvorne (nativne) konformacije. Ovo potvrđuje činjenicu da je priroda savijanja peptidnog lanca određena primarnom strukturom.

Proces denaturacije pojedine molekule proteina, koji dovodi do raspada njegove "krute" trodimenzionalne strukture, ponekad se naziva i taljenje molekule. Gotovo svaka primjetna promjena u vanjskim uvjetima, kao što je zagrijavanje ili značajna promjena u pH, dovodi do dosljednog kršenja kvarterne, tercijarne i sekundarne strukture proteina. Obično je denaturacija uzrokovana povećanjem temperature, djelovanjem jakih kiselina i lužina, soli teških metala, određenih otapala (alkohol), zračenjem itd.

Denaturacija često dovodi do procesa agregacije proteinskih čestica u veće u koloidnoj otopini proteinskih molekula. Vizualno to izgleda, na primjer, kao stvaranje "proteina" prilikom prženja jaja.

Renaturacija je proces obrnut od denaturacije, u kojem se proteini vraćaju u svoju prirodnu strukturu. Treba napomenuti da nisu svi proteini sposobni renaturirati; u većini proteina denaturacija je nepovratna. Ako su tijekom denaturacije proteina fizikalno-kemijske promjene povezane s prijelazom polipeptidnog lanca iz gusto zbijenog (uređenog) stanja u neuređeno, tada se tijekom renaturacije očituje sposobnost samoorganiziranja proteina, čiji je put predodređen slijedom aminokiselina u polipeptidnom lancu, odnosno njegova primarna struktura određena nasljednom informacijom . U živim stanicama ova je informacija vjerojatno odlučujuća za transformaciju neuređenog polipeptidnog lanca tijekom ili nakon njegove biosinteze na ribosomu u strukturu nativne proteinske molekule. Kada se dvolančane molekule DNA zagriju na temperaturu od oko 100 °C, vodikove veze između baza se prekidaju, a komplementarni se lanci razdvajaju - DNA denaturira. Međutim, nakon sporog hlađenja, komplementarne niti se mogu ponovno povezati u pravilnu dvostruku spiralu. Ta se sposobnost DNA za renaturiranje koristi za proizvodnju umjetnih hibridnih molekula DNA.

Prirodna proteinska tijela obdarena su određenom, strogo definiranom prostornom konfiguracijom i imaju niz karakterističnih fizikalno-kemijskih i bioloških svojstava pri fiziološkim temperaturama i pH vrijednostima. Pod utjecajem različitih fizičkih i kemijskih čimbenika, proteini se koaguliraju i talože, gubeći svoja izvorna svojstva. Dakle, denaturaciju treba shvatiti kao kršenje općeg plana jedinstvene strukture nativne molekule proteina, uglavnom njegove tercijarne strukture, što dovodi do gubitka njegovih karakterističnih svojstava (topljivost, elektroforetska pokretljivost, biološka aktivnost itd.). Većina proteina denaturira kada se njihove otopine zagriju iznad 50-60°C.

Vanjske manifestacije denaturacije svode se na gubitak topljivosti, osobito u izoelektričnoj točki, povećanje viskoznosti proteinskih otopina, povećanje broja slobodnih funkcionalnih SH-skupina i promjenu prirode raspršenja X-zraka. . Najkarakterističniji znak denaturacije je oštro smanjenje ili potpuni gubitak biološke aktivnosti proteina (katalitičke, antigene ili hormonske). Tijekom denaturacije proteina uzrokovane 8M ureom ili drugim sredstvom, uglavnom se uništavaju nekovalentne veze (osobito hidrofobne interakcije i vodikove veze). Disulfidne veze se kidaju u prisutnosti redukcijskog sredstva merkaptoetanola, dok peptidne veze okosnice samog polipeptidnog lanca nisu pogođene. Pod tim uvjetima, globule nativnih proteinskih molekula se razvijaju i formiraju se nasumične i neuredne strukture (Sl.)

Denaturacija proteinske molekule (shema).

a - početno stanje; b - početak reverzibilnog kršenja molekularne strukture; c - nepovratno raspoređivanje polipeptidnog lanca.

Denaturacija i renaturacija ribonukleaze (prema Anfinsenu).

a - raspoređivanje (urea + merkaptoetanol); b - presavijanje.

1. Hidroliza proteina: H+

[− NH2─CH─ CO─NH─CH─CO − ]n +2nH2O → n NH2 − CH − COOH + n NH2 ─ CH ─ COOH

│ │ ‌‌│ │

Aminokiselina 1 aminokiselina 2

2. Taloženje proteina:

a) reverzibilan

Protein u otopini ↔ proteinski talog. Nastaje pod djelovanjem otopina soli Na+, K+

b) nepovratna (denaturacija)

Tijekom denaturacije pod utjecajem vanjskih čimbenika (temperatura; mehaničko djelovanje - pritisak, trljanje, trešenje, ultrazvuk; djelovanje kemijskih sredstava - kiseline, lužine i dr.) dolazi do promjene u sekundarnoj, tercijarnoj i kvaternarnoj strukturi proteina. makromolekula, tj. njezina nativna prostorna struktura. Primarna struktura, a time i kemijski sastav proteina se ne mijenja.

Tijekom denaturacije mijenjaju se fizikalna svojstva proteina: smanjuje se topljivost, gubi se biološka aktivnost. Istodobno se povećava aktivnost nekih kemijskih skupina, olakšava se učinak proteolitičkih enzima na proteine, pa se samim time lakše hidrolizira.

Na primjer, albumin - bjelanjak - na temperaturi od 60-70 ° se taloži iz otopine (koagulira), gubeći sposobnost otapanja u vodi.

Shema procesa denaturacije proteina (razaranja tercijarne i sekundarne strukture proteinskih molekula)

3. Spaljivanje proteina

Proteini izgaraju uz stvaranje dušika, ugljičnog dioksida, vode i nekih drugih tvari. Gorenje je popraćeno karakterističnim mirisom spaljenog perja.

4. Boja (kvalitativne) reakcije na proteine:

a) ksantoproteinska reakcija (za aminokiselinske ostatke koji sadrže benzenske prstenove):

Protein + HNO3 (konc.) → žuta boja

b) biuretska reakcija (za peptidne veze):

Protein + CuSO4 (zas.) + NaOH (konc.) → svijetloljubičasta boja

c) cisteinska reakcija (za aminokiselinske ostatke koji sadrže sumpor):

Protein + NaOH + Pb(CH3COO)2 → Crno bojenje

Proteini su temelj svega života na Zemlji i obavljaju različite funkcije u organizmima.

Soljenje proteina

Soljenje je postupak izolacije proteina iz vodenih otopina neutralnim otopinama koncentriranih soli alkalijskih i zemnoalkalijskih metala. Kada se u otopinu proteina dodaju visoke koncentracije soli, dolazi do dehidracije čestica proteina i uklanjanja naboja, dok se proteini talože. Stupanj taloženja proteina ovisi o ionskoj jakosti otopine taloga, veličini čestica proteinske molekule, veličini njezina naboja i hidrofilnosti. Različiti se proteini talože pri različitim koncentracijama soli. Stoga se u sedimentima dobivenim postupnim povećanjem koncentracije soli pojedini proteini nalaze u različitim frakcijama. Soljenje bjelančevina je reverzibilan proces, a nakon uklanjanja soli bjelančevina ponovno poprima svoja prirodna svojstva. Stoga se soljenje koristi u kliničkoj praksi za odvajanje proteina krvnog seruma, kao i za izolaciju i pročišćavanje različitih proteina.

Dodani anioni i kationi uništavaju hidratiziranu proteinsku ovojnicu proteina, što je jedan od faktora stabilnosti proteinskih otopina. Najčešće se koriste otopine Na i amonijevih sulfata. Mnogi se proteini razlikuju po veličini hidratacijske ljuske i veličini naboja. Svaki protein ima svoju zonu za soljenje. Nakon uklanjanja agensa za soljenje, protein zadržava svoju biološku aktivnost i fizikalno-kemijska svojstva. U kliničkoj praksi se metodom isoljavanja odvajaju globulini (s dodatkom 50% amonij sulfata (NH4)2SO4 taloži se talog) i albumini (s dodatkom 100% amonij sulfata (NH4)2SO4 taloži se talog).

Na soljenje utječu:

1) prirodu i koncentraciju soli;

2) pH okoline;

3) temperatura.

Glavnu ulogu igraju valencije iona.

12) Značajke organizacije primarne, sekundarne, tercijarne strukture proteina.

Trenutno je eksperimentalno dokazano postojanje četiri razine strukturne organizacije proteinske molekule: primarna, sekundarna, tercijarna i kvaternarna struktura.

Sastav aminokiselina i prostorna organizacija svakog proteina određuju njegova fizikalno-kemijska svojstva. Proteini imaju acidobazna, puferska, koloidna i osmotska svojstva.

Proteini kao amfoterne makromolekule

Proteini su amfoterni polielektroliti, tj. kombiniraju, poput aminokiselina, kisela i bazična svojstva. Međutim, priroda skupina koje daju amfoterna svojstva proteinima daleko je od iste kao kod aminokiselina. Kiselinsko-bazna svojstva aminokiselina prvenstveno su posljedica prisutnosti α-amino i α-karboksilnih skupina (kiselinsko-bazni par). U proteinskim molekulama ove skupine sudjeluju u stvaranju peptidnih veza, a amfoterne proteine ​​daju acidobazne skupine bočnih radikala aminokiselina koje grade protein. Naravno, u svakoj nativnoj proteinskoj molekuli (polipeptidnom lancu) postoji najmanje jedna terminalna α-amino i α-karboksilna skupina (ako protein ima samo tercijarnu strukturu). U proteinu s kvaternarnom strukturom broj krajnjih skupina -NH 2 i -COOH jednak je broju podjedinica, odnosno protomera. Međutim, tako mali broj ovih skupina ne može objasniti amfoternu prirodu proteinskih makromolekula. Budući da se većina polarnih skupina nalazi na površini globularnih proteina, one određuju acidobazna svojstva i naboj proteinske molekule. Kisela svojstva proteinu daju kisele aminokiseline (asparaginska, glutaminska i aminocitranska), a alkalna svojstva daju bazične aminokiseline (lizin, arginin, histidin). Što bjelančevina sadrži više kiselih aminokiselina, to su njena kiselinska svojstva izraženija, a što je više bazičnih aminokiselina u sastavu bjelančevine, to se njena bazična svojstva jače očituju. Slaba disocijacija SH skupine cisteina i fenolne skupine tirozina (mogu se smatrati slabim kiselinama) gotovo da nema utjecaja na amfoternost proteina.

Svojstva međuspremnika. Iako proteini imaju svojstva pufera, njihov kapacitet pri fiziološkim pH vrijednostima je ograničen. Izuzetak su proteini koji sadrže mnogo histidina, jer samo bočna skupina histidina ima svojstva pufera u pH rasponu blizu fiziološkog. Tih proteina ima jako malo. Hemoglobin je gotovo jedini protein koji sadrži do 8% histidina, koji je snažan intracelularni pufer u eritrocitima, održavajući pH krvi na konstantnoj razini.

Naboj proteinske molekule ovisi o sadržaju kiselih i bazičnih aminokiselina u njoj, odnosno o ionizaciji kiselih i bazičnih skupina bočnog radikala tih aminokiselina. Disocijacija COOH skupina kiselih aminokiselina uzrokuje pojavu negativnog naboja na površini proteina, a bočni radikali alkalnih aminokiselina nose pozitivan naboj (zbog dodavanja H + glavnim skupinama). U nativnoj proteinskoj molekuli naboji su raspoređeni asimetrično ovisno o prostornom rasporedu polipeptidnog lanca. Ako u proteinu prevladavaju kisele aminokiseline nad bazičnima, tada je općenito proteinska molekula elektronegativna, odnosno polianion, i obrnuto, ako prevladavaju bazične aminokiseline, onda je pozitivno nabijena, tj. ponaša se kao polikacija.

Ukupni naboj proteinske molekule, naravno, ovisi o pH medija: u kiselom mediju je pozitivan, u alkalnom mediju je negativan. pH vrijednost pri kojoj protein ima neto naboj jednak nuli naziva se izoelektrična točka proteina. U ovom trenutku protein nema mobilnost u električnom polju. Izoelektrična točka svakog proteina određena je omjerom kiselih i bazičnih skupina bočnih radikala aminokiselina: što je veći omjer kiselih/baznih aminokiselina u proteinu, to je niža njegova izoelektrična točka. Kiseli proteini imaju pH 1< 7, у нейтральных рН 1 около 7, а у основных рН 1 >7. Na pH vrijednostima ispod svoje izoelektrične točke, protein će nositi pozitivan naboj, a iznad - negativan naboj. Prosječna izoelektrična točka svih citoplazmatskih proteina je unutar 5,5. Stoga, pri fiziološkom pH (oko 7,0 - 7,4), stanični proteini imaju ukupni negativni naboj. Višak negativnih naboja proteina unutar stanice uravnotežen je, kao što je već spomenuto, anorganskim kationima.

Poznavanje izoelektrične točke vrlo je važno za razumijevanje stabilnosti proteina u otopinama, budući da su proteini najmanje stabilni u izoelektričnom stanju. Nenabijene čestice proteina mogu se zalijepiti i istaložiti.

Koloidna i osmotska svojstva proteina

Ponašanje proteina u otopinama ima neke osobitosti. Uobičajene koloidne otopine stabilne su samo u prisutnosti stabilizatora koji sprječava taloženje koloida na granici otopine i otapala.

Vodene otopine proteina su stabilne i uravnotežene, ne talože se (ne koaguliraju) tijekom vremena i ne zahtijevaju prisutnost stabilizatora. Proteinske otopine su homogene i, u biti, mogu se klasificirati kao prave otopine. Međutim, visoka molekularna težina proteina daje njihovim otopinama mnoga svojstva koloidnih sustava:

• karakteristična optička svojstva (opalescencija otopina i njihova sposobnost raspršivanja zraka vidljive svjetlosti) [pokazati] .

  Optička svojstva proteina. Otopine proteina, osobito one koncentrirane, imaju karakterističnu opalescenciju. Kada se otopina proteina osvijetli bočno, svjetlosne zrake u njoj postaju vidljive i tvore svjetleći stožac ili traku – Tyndallov efekt (u jako razrijeđenim otopinama proteina opalescencija nije vidljiva, a svjetleći Tyndallov stožac gotovo da i nema). Ovaj učinak raspršenja svjetlosti objašnjava se difrakcijom svjetlosnih zraka na česticama proteina u otopini. Smatra se da se u protoplazmi stanice protein nalazi u obliku koloidne otopine – sola. Sposobnost proteina i drugih bioloških molekula (nukleinskih kiselina, polisaharida itd.) da raspršuju svjetlost koristi se u mikroskopskom proučavanju staničnih struktura: u tamnom polju mikroskopa koloidne čestice vidljive su kao svijetle mrlje u citoplazmi.

  Sposobnost raspršenja svjetlosti proteina i drugih makromolekularnih tvari koristi se za njihovo kvantitativno određivanje nefelometrijom, uspoređujući intenzitet raspršenja svjetlosti na suspendiranim česticama ispitivanog i standardnog sola.

• niska brzina difuzije [pokazati] .

  Niska stopa difuzije. Difuzija je spontano kretanje molekula otopljene tvari uslijed koncentracijskog gradijenta (od područja visoke koncentracije do područja niske koncentracije). Proteini imaju ograničenu brzinu difuzije u usporedbi s običnim molekulama i ionima, koji se kreću stotinama do tisuća puta brže od proteina. Brzina difuzije proteina više ovisi o obliku njihovih molekula nego o njihovoj molekularnoj masi. Globularni proteini u vodenim otopinama pokretljiviji su od fibrilarnih proteina.

  Difuzija proteina neophodna je za normalno funkcioniranje stanice. Sinteza proteina u bilo kojem dijelu stanice (gdje se nalaze ribosomi) mogla bi, u odsutnosti difuzije, dovesti do nakupljanja proteina na mjestu njihovog nastanka. Intracelularna distribucija proteina odvija se difuzijom. Budući da je brzina difuzije proteina niska, to ograničava brzinu procesa koji ovise o funkciji proteina koji difuzira u odgovarajućem području stanice.

• nemogućnost prodiranja kroz polupropusne membrane [pokazati] .

  Osmotska svojstva proteina. Proteini zbog svoje velike molekularne mase ne mogu difundirati kroz polupropusnu membranu, dok tvari niske molekularne mase lako prolaze kroz takve membrane. Ovo svojstvo proteina koristi se u praksi za pročišćavanje njihovih otopina od niskomolekularnih nečistoća. Taj se proces naziva dijaliza.

  Nemogućnost proteina da difundiraju kroz polupropusne membrane uzrokuje pojavu osmoze, tj. kretanje molekula vode kroz polupropusne membrane u otopinu proteina. Ako je otopina proteina odvojena od vode celofanskom membranom, tada, nastojeći postići ravnotežu, molekule vode difundiraju u otopinu proteina. Međutim, kretanjem vode u prostor u kojem se protein nalazi povećava se hidrostatski tlak u njemu (pritisak vodenog stupca), što onemogućuje daljnju difuziju molekula vode do proteina.

  Tlak ili sila koja se mora primijeniti da se zaustavi osmotski tok vode naziva se osmotski tlak. Osmotski tlak u vrlo razrijeđenim otopinama proteina proporcionalan je molarnoj koncentraciji proteina i apsolutnoj temperaturi.

  Biološke membrane također su nepropusne za proteine, pa osmotski tlak koji stvara protein ovisi o njegovoj koncentraciji unutar i izvan stanice. Osmotski tlak zbog proteina naziva se i onkotski tlak.

• otopine visoke viskoznosti [pokazati] .

  Otopine proteina visoke viskoznosti. Visoka viskoznost tipična je ne samo za otopine proteina, već općenito za otopine makromolekularnih spojeva. S povećanjem koncentracije proteina, viskoznost otopine raste, jer se povećavaju adhezijske sile između proteinskih molekula. Viskoznost ovisi o obliku molekula. Otopine fibrilarnih proteina uvijek su viskoznije od otopina globularnih proteina. Na viskoznost otopina jako utječu temperatura i prisutnost elektrolita. Kako se temperatura povećava, viskoznost otopina proteina opada. Dodaci nekih soli, poput kalcija, povećavaju viskoznost promicanjem prianjanja molekula uz pomoć kalcijevih mostova. Ponekad se viskoznost proteinske otopine toliko poveća da ona gubi fluidnost i prelazi u gelasto stanje.

• sposobnost želiranja [pokazati] .

  Sposobnost proteina da formiraju gelove. Interakcija između makromolekula proteina u otopini može dovesti do stvaranja strukturnih mreža unutar kojih su zarobljene molekule vode. Takvi strukturirani sustavi nazivaju se gelovi ili želei. Vjeruje se da protein protoplazme stanice može prijeći u stanje poput gela. Tipičan primjer - tijelo meduze je poput žive mliječi, čiji sadržaj vode iznosi i do 90%.

  Geliranje se odvija lakše u otopinama fibrilarnih proteina; njihov štapićast oblik potiče bolji kontakt krajeva makromolekula. To je dobro poznato iz svakodnevne prakse. Prehrambeni želei pripremaju se od proizvoda (kosti, hrskavice, mesa) koji sadrže velike količine fibrilarnih proteina.

  U procesu života tijela, gelasto stanje proteinskih struktura od velike je fiziološke važnosti. Proteini kolagena kostiju, tetiva, hrskavice, kože itd. imaju veliku čvrstoću, čvrstoću i elastičnost jer su u gelastom stanju. Taloženje mineralnih soli tijekom starenja smanjuje njihovu čvrstoću i elastičnost. U obliku gela ili želatinoze, aktomiozin se nalazi u mišićnim stanicama, koje obavljaju kontraktilnu funkciju.

  U živoj stanici događaju se procesi koji nalikuju sol-gel prijelazu. Protoplazma stanice je viskozna tekućina nalik na sol, u kojoj se nalaze otoci gelastih struktura.

Hidratacija proteina i čimbenici koji utječu na njihovu topljivost

Proteini su hidrofilne tvari. Ako otopite suhi protein u vodi, tada on isprva, kao i svaki hidrofilni visokomolekularni spoj, nabubri, a zatim molekule proteina počinju postupno prelaziti u otopinu. Tijekom bubrenja, molekule vode prodiru u protein i vežu se na njegove polarne skupine. Gusto pakiranje polipeptidnih lanaca je olabavljeno. Nabubreni protein može se smatrati povratnom otopinom, tj. otopinom molekula vode u tvari velike molekularne težine - proteinu. Daljnjom apsorpcijom vode dolazi do izdvajanja proteinskih molekula iz ukupne mase i otapanja. Ali oticanje ne dovodi uvijek do otapanja; neki proteini, poput kolagena, ostaju natečeni nakon što upiju velike količine vode.

Otapanje je povezano s hidratacijom proteina, tj. vezanjem molekula vode na proteine. Hidratizirana voda toliko je čvrsto vezana za makromolekulu proteina da ju je teško odvojiti. To ne ukazuje na jednostavnu adsorpciju, već na elektrostatsko vezanje molekula vode s polarnim skupinama bočnih radikala kiselih aminokiselina s negativnim nabojem i bazičnih aminokiselina s pozitivnim nabojem.

Međutim, dio hidratacijske vode vezan je peptidnim skupinama, koje tvore vodikove veze s molekulama vode. Na primjer, polipeptidi s nepolarnim bočnim skupinama također bubre, tj. vežu vodu. Dakle, velika količina vode veže kolagen, iako ovaj protein sadrži pretežno nepolarne aminokiseline. Voda, vežući se za peptidne skupine, odvaja izdužene polipeptidne lance. Međutim, međulančane veze (mostovi) ne dopuštaju proteinskim molekulama da se odvoje jedna od druge i odu u otopinu. Kada se sirovine koje sadrže kolagen zagrijavaju, međulančani mostovi u kolagenim vlaknima pucaju i oslobođeni polipeptidni lanci prelaze u otopinu. Ova frakcija djelomično hidroliziranog topljivog kolagena naziva se želatina. Želatina je po kemijskom sastavu slična kolagenu, lako bubri i otapa se u vodi, stvarajući viskozne tekućine. Karakteristično svojstvo želatine je sposobnost želiranja. Vodene otopine želatine naširoko se koriste u medicinskoj praksi kao sredstvo za zamjenu plazme i hemostatsko sredstvo, a sposobnost geliranja - u proizvodnji kapsula u farmaceutskoj praksi.

Čimbenici koji utječu na topljivost proteina. Topivost različitih proteina jako varira. Određen je njihovim aminokiselinskim sastavom (polarne aminokiseline daju veću topljivost od nepolarnih), značajkama organizacije (globularni proteini obično su bolje topljivi od fibrilarnih) i svojstvima otapala. Na primjer, biljni proteini - prolamini - otapaju se u 60-80% alkoholu, albumini - u vodi i u slabim otopinama soli, a kolagen i keratini su netopljivi u većini otapala.

Proteinske otopine stabilne su zbog naboja proteinske molekule i hidratacijske ljuske. Svaka makromolekula pojedinog proteina ima ukupni naboj istog predznaka, što onemogućuje njihovo međusobno lijepljenje u otopini i taloženje. Sve što doprinosi očuvanju naboja i hidratacijske ljuske olakšava topljivost proteina i njegovu stabilnost u otopini. Postoji bliska veza između naboja proteina (ili broja polarnih aminokiselina u njemu) i hidratacije: što je više polarnih aminokiselina u proteinu, to se više vode veže (na 1 g proteina). Hidracijska ljuska proteina ponekad doseže veliku veličinu, a hidratacijska voda može biti do 1/5 njegove mase.

Istina, neki su proteini više hidratizirani i manje topljivi. Na primjer, kolagen veže vodu više od mnogih visoko topljivih globularnih proteina, ali se ne otapa. Njegovu topljivost ometaju strukturne značajke - poprečne veze između polipeptidnih lanaca. Ponekad suprotno nabijene proteinske skupine stvaraju mnogo ionskih (soli) veza unutar proteinske molekule ili između proteinskih molekula, što sprječava stvaranje veza između molekula vode i nabijenih proteinskih skupina. Opaža se paradoksalni fenomen: postoji mnogo anionskih ili kationskih skupina u proteinu, a njegova topljivost u vodi je niska. Međumolekularni mostovi soli uzrokuju lijepljenje i taloženje proteinskih molekula.

Koji čimbenici okoliša utječu na topljivost proteina i njihovu stabilnost u otopinama?

• Utjecaj neutralnih soli [pokazati] .

  Neutralne soli u malim koncentracijama povećavaju topljivost čak i onih proteina koji su netopljivi u čistoj vodi (na primjer, euglobulini). To je zbog činjenice da ioni soli, u interakciji sa suprotno nabijenim skupinama proteinskih molekula, uništavaju slane mostove između proteinskih molekula. Povećanje koncentracije soli (povećanje ionske jakosti otopine) ima suprotan učinak (vidi dolje - soljenje).

• Utjecaj pH medija [pokazati] .

  pH medija utječe na naboj proteina i, posljedično, na njegovu topljivost. Najmanje stabilan protein je u izoelektričnom stanju, tj. kada mu je ukupni naboj nula. Uklanjanje naboja omogućuje molekulama proteina da se lako približe jedna drugoj, zalijepe se i talože. To znači da će topljivost i stabilnost proteina biti minimalne pri pH koji odgovara izoelektričnoj točki proteina.

• Učinak temperature [pokazati] .

  Ne postoji strogi odnos između temperature i prirode topljivosti proteina. Neki proteini (globulini, pepsin, mišićna fosforilaza) u vodenim ili slanim otopinama bolje se otapaju s povećanjem temperature; drugi (mišićna aldolaza, hemoglobin itd.) su gori.

• Utjecaj različito nabijenog proteina [pokazati] .

  Ako se protein koji je polikation (bazični protein) doda u otopinu proteina koji je polianion (kiseli protein), tada oni stvaraju agregate. U tom slučaju gubi se stabilnost zbog neutralizacije naboja i proteini se talože. Ponekad se ova značajka koristi za izolaciju željenog proteina iz mješavine proteina.

isoljavanje

Otopine neutralnih soli naširoko se koriste ne samo za povećanje topljivosti proteina, na primjer, kada se izolira iz biološkog materijala, već i za selektivno taloženje različitih proteina, tj. njihovo frakcioniranje. Proces taloženja proteina neutralnom slanom otopinom naziva se soljenje. Karakteristična značajka proteina dobivenih soljenjem je da zadržavaju svoja izvorna biološka svojstva nakon uklanjanja soli.

Mehanizam isoljavanja sastoji se u tome da dodani anioni i kationi slane otopine uklanjaju hidratacijsku ovojnicu proteina, što je jedan od čimbenika njegove stabilnosti. Moguće je da se istodobno događa neutralizacija naboja proteina ionima soli, što također doprinosi taloženju proteina.

Sposobnost isoljavanja najizraženija je kod aniona soli. Prema jačini djelovanja isoljavanja anioni i kationi raspoređeni su u sljedeće redove:

• SO 4 2-> C 6 H 5 O 7 3-> CH 3 COO - > Cl - > NO 3 - > Br - > I - > CNS -
• Li + > Na + > K + > Pb + > Cs +

Ove serije se nazivaju liotropne.

Sulfati u ovoj seriji imaju jak učinak isoljavanja. U praksi se za soljenje proteina najčešće koriste natrijev i amonijev sulfat. Osim soli, proteini se talože organskim sredstvima za uklanjanje vode (etanol, aceton, metanol itd.). Zapravo, ovo je isto soljenje.

Soljenje se naširoko koristi za odvajanje i pročišćavanje proteina, budući da se mnogi proteini razlikuju po veličini svoje hidratacijske ljuske i veličini svojih naboja. Svaki od njih ima svoju zonu soljenja, odnosno koncentraciju soli koja omogućuje dehidraciju i taloženje proteina. Nakon uklanjanja sredstva za soljenje protein zadržava sva svoja prirodna svojstva i funkcije.

Denaturacija (denativacija) i renaturacija (renativacija)

Pod djelovanjem različitih tvari koje narušavaju najviše razine organizacije proteinske molekule (sekundarne, tercijarne, kvartarne), zadržavajući primarnu strukturu, protein gubi svoja izvorna fizikalno-kemijska i, što je najvažnije, biološka svojstva. Ova pojava se naziva denaturacija (denaturacija). Karakterističan je samo za molekule koje imaju složenu prostornu organizaciju. Sintetski i prirodni peptidi nisu sposobni za denaturaciju.

Tijekom denaturacije dolazi do kidanja veza koje stabiliziraju kvarternu, tercijarnu, pa čak i sekundarnu strukturu. Polipeptidni lanac se odvija i nalazi se u otopini ili u nesmotanom obliku ili u obliku nasumične zavojnice. U tom slučaju gubi se hidratacijska ljuska i protein se taloži. Međutim, istaloženi denaturirani protein razlikuje se od istog proteina istaloženog soljenjem, jer u prvom slučaju gubi svoja nativna svojstva, au drugom ih zadržava. To ukazuje da je mehanizam djelovanja tvari koje uzrokuju denaturaciju i isoljavanje različit. Tijekom soljenja nativna struktura proteina se čuva, a tijekom denaturacije se uništava.

Denaturirajući faktori se dijele na

• fizički [pokazati] .

  Fizikalni čimbenici su: temperatura, tlak, mehanički utjecaj, ultrazvučno i ionizirajuće zračenje.

  Toplinska denaturacija proteina je najviše proučavan proces. Smatralo se jednom od karakterističnih značajki proteina. Odavno je poznato da kod zagrijavanja protein koagulira (koagulira) i taloži se. Većina proteina je termolabilna, ali poznato je da su proteini vrlo otporni na toplinu. Na primjer, tripsin, kimotripsin, lizozim, neki biološki membranski proteini. Proteini bakterija koje žive u toplim izvorima posebno su otporni na temperaturu. Očito je da u termostabilnim proteinima toplinsko gibanje polipeptidnih lanaca uzrokovano zagrijavanjem nije dovoljno da prekine unutarnje veze proteinskih molekula. U izoelektričnoj točki, proteini se lakše denaturiraju toplinom. Ova tehnika se koristi u praktičnom radu. Neki proteini, s druge strane, denaturiraju na niskim temperaturama.

• kemijski [pokazati] .

  Kemijski čimbenici koji uzrokuju denaturaciju su: kiseline i lužine, organska otapala (alkohol, aceton), deterdženti (detergenti), neki amidi (urea, soli gvanidina itd.), alkaloidi, teški metali (soli žive, bakra, barija, cinka). , kadmij, itd.). Mehanizam denaturirajućeg djelovanja kemikalija ovisi o njihovim fizikalno-kemijskim svojstvima.

  Kiseline i lužine naširoko se koriste kao sredstva za taloženje proteina. Mnogi proteini denaturiraju pri ekstremnim pH vrijednostima ispod 2 ili iznad 10-11. Ali neki su proteini otporni na kiseline i lužine. Na primjer, histoni i protamini ne denaturiraju čak ni pri pH 2 ili pH 10. Jake otopine etanola i acetona također imaju denaturirajući učinak na proteine, iako se za neke proteine ​​ta organska otapala koriste kao sredstva za isoljavanje.

  Teški metali, alkaloidi odavno se koriste kao sredstva za taloženje; stvaraju jake veze s polarnim skupinama proteina i time prekidaju sustav vodikovih i ionskih veza.

  Posebnu pozornost treba obratiti na soli uree i gvanidina koje se u visokim koncentracijama (za ureu 8 mol/l, za gvanidin hidroklorid 2 mol/l) natječu s peptidnim skupinama za stvaranje vodikovih veza. Kao rezultat toga, u proteinima s kvaternarnom strukturom dolazi do disocijacije na podjedinice, a zatim do razmotavanja polipeptidnih lanaca. Ovo svojstvo uree toliko je upečatljivo da se naširoko koristi za dokazivanje prisutnosti kvaternarne proteinske strukture i važnosti njezine strukturne organizacije u provedbi fiziološke funkcije.

Svojstva denaturiranih proteina . Najtipičnije za denaturirane proteine ​​su sljedeće karakteristike.

• Povećanje broja reaktivnih ili funkcionalnih skupina u usporedbi s nativnom proteinskom molekulom (funkcionalne skupine su skupine bočnih radikala aminokiselina: COOH, NH 2, SH, OH). Neke od tih skupina obično se nalaze unutar proteinske molekule i ne detektiraju se posebnim reagensima. Razmotavanje polipeptidnog lanca tijekom denaturacije otkriva te dodatne ili skrivene skupine.
• Smanjena topljivost i taloženje proteina (povezano s gubitkom hidratacijske ljuske, odvijanjem proteinske molekule s "izlaganjem" hidrofobnih radikala i neutralizacijom naboja polarnih skupina).
• Promjena konfiguracije proteinske molekule.
• Gubitak biološke aktivnosti uzrokovan kršenjem izvorne strukturne organizacije molekule.
• Lakše cijepanje proteolitičkim enzimima u usporedbi s nativnim proteinom, prijelaz kompaktne nativne strukture u rasklopljenu labavu formu olakšava pristup enzima peptidnim vezama proteina koje oni uništavaju.

Posljednja kvaliteta denaturiranog proteina nadaleko je poznata. Toplinska ili druga obrada proizvoda koji sadrže bjelančevine (uglavnom mesa) pridonosi njihovoj boljoj probavi uz pomoć proteolitičkih enzima gastrointestinalnog trakta. U želucu ljudi i životinja stvara se prirodni denaturator - klorovodična kiselina, koja denaturirajući bjelančevine pomaže enzimima u njihovoj razgradnji. Međutim, prisutnost klorovodične kiseline i proteolitičkih enzima ne dopušta korištenje proteinskih lijekova kroz usta, jer su denaturirani i odmah podijeljeni, gubeći svoju biološku aktivnost.

Također napominjemo da se denaturirajuće tvari koje talože proteine ​​u biokemijskoj praksi koriste u druge svrhe osim onih za soljenje. Isoljavanje kao tehnika koristi se za izolaciju određenog proteina ili skupine proteina, a denaturacija se koristi za oslobađanje mješavine bilo koje tvari iz proteina. Uklanjanjem proteina može se dobiti otopina bez proteina ili se može eliminirati učinak ovog proteina.

Dugo se vjerovalo da je denaturacija nepovratna. Međutim, u nekim slučajevima, uklanjanje denaturirajućeg agensa (takvi eksperimenti su napravljeni s ureom) vraća biološku aktivnost proteina. Proces vraćanja fizikalno-kemijskih i bioloških svojstava denaturiranog proteina naziva se renaturacija ili renativacija. Ako se denaturirani protein (nakon uklanjanja denaturirajućih tvari) ponovno organizira u izvornu strukturu, tada se obnavlja njegova biološka aktivnost.

Stranica 4

ukupno stranica: 7

Oblik proteinske molekule. Istraživanja prirodne konformacije proteinskih molekula pokazala su da te čestice u većini slučajeva imaju više ili manje asimetričan oblik. Ovisno o stupnju asimetrije, odnosno omjeru duge (b) i kratke (a) osi proteinske molekule, razlikuju se globularni (sferični) i fibrilarni (filamentni) proteini.

Globularne su proteinske molekule kod kojih je presavijanje polipeptidnih lanaca dovelo do stvaranja kuglaste strukture. Među njima postoje strogo sferni, eliptični i štapićasti. Razlikuju se u stupnju asimetrije. Na primjer, albumin iz jaja ima b/a = 3, gliadin pšenice ima 11, a zein kukuruza ima 20. Mnogi proteini u prirodi su globularni.

Fibrilarni proteini tvore duge, vrlo asimetrične filamente. Mnogi od njih imaju strukturnu ili mehaničku funkciju. To su kolagen (b/a - 200), keratini, fibroin.

Proteini svake skupine imaju svoja karakteristična svojstva. Mnogi globularni proteini topljivi su u vodi i razrijeđenim slanim otopinama. Topljive fibrilarne proteine ​​karakteriziraju vrlo viskozne otopine. Globularni proteini, u pravilu, imaju dobru biološku vrijednost – apsorbiraju se tijekom probave, dok mnogi fibrilarni proteini to nisu.

Ne postoji jasna granica između globularnih i fibrilarnih proteina. Brojni proteini zauzimaju srednji položaj i kombiniraju svojstva globularnih i fibrilarnih. Takvi proteini uključuju, na primjer, miozin mišića (b/a = 75) i fibrinogen krvi (b/a = 18). Miozin ima štapićast oblik, sličan obliku fibrilarnih proteina, međutim, kao i globularni proteini, topiv je u slanim otopinama. Otopine miozina i fibrinogena su viskozne. Ti se proteini apsorbiraju tijekom probave. U isto vrijeme, aktin, globularni mišićni protein, se ne apsorbira.

Denaturacija proteina. Nativna konformacija proteinskih molekula nije kruta, već je prilično labilna (lat. "labilis" - klizanje) i može biti ozbiljno poremećena pod nizom utjecaja. Kršenje prirodne konformacije proteina, popraćeno promjenom njegovih prirodnih svojstava bez prekidanja peptidnih veza, naziva se denaturacija (latinski "denaturare" - lišiti prirodnih svojstava) proteina.

Denaturacija proteina može biti uzrokovana različitim razlozima koji dovode do poremećaja slabih interakcija, kao i do kidanja disulfidnih veza koje stabiliziraju njihovu nativnu strukturu.

Zagrijavanje većine proteina na temperature iznad 50°C, kao i ultraljubičasto i druge vrste visokoenergetskog zračenja, povećavaju vibracije atoma polipeptidnog lanca, što dovodi do prekida različitih veza u njima. Čak i mehaničko mućkanje može uzrokovati denaturaciju proteina.

Do denaturacije proteina dolazi i zbog kemijskog napada. Jake kiseline ili lužine utječu na ionizaciju kiselih i bazičnih skupina, uzrokujući prekid ionskih i nekih vodikovih veza u proteinskim molekulama. Urea (H 2 N-CO-NH 2) i organska otapala - alkoholi, fenoli itd. - razbijaju sustav vodikovih veza i slabe hidrofobne interakcije u proteinskim molekulama (urea - zbog kršenja strukture vode, organska otapala - zbog uspostavljanja kontakata s nepolarnim radikalima aminokiselina). Merkaptoetanol uništava disulfidne veze u proteinima. Ioni teških metala ometaju slabe interakcije.

Tijekom denaturacije dolazi do promjene svojstava proteina i prije svega do smanjenja njegove topljivosti. Na primjer, kada se kuhaju, proteini se zgrušaju i talože iz otopina u obliku ugrušaka (kao kod kuhanja kokošjeg jajeta). Taloženje proteina iz otopina događa se i pod utjecajem proteinskih taloga, koji se koriste kao trikloroctena kiselina, Barnsteinov reagens (mješavina natrijevog hidroksida s bakrenim sulfatom), otopina tanina itd.

Tijekom denaturacije smanjuje se sposobnost proteina da upija vodu, tj. njegova sposobnost bubrenja; mogu se pojaviti nove kemijske skupine npr.: pri izlaganju mjerama kaptoetanola – SH-skupine. Kao rezultat denaturacije, protein gubi svoju biološku aktivnost.

Iako denaturacija ne utječe na primarnu strukturu proteina, promjene su nepovratne. Međutim, na primjer, s postupnim uklanjanjem uree dijalizom iz otopine denaturiranog proteina, dolazi do njegove renaturacije: obnavlja se izvorna struktura proteina, a zajedno s njom, u jednom ili drugom stupnju, njegova izvorna svojstva. Takva se denaturacija naziva reverzibilnom.

Tijekom starenja organizma dolazi do nepovratne denaturacije proteina. Stoga, primjerice, sjeme biljaka, čak i pod optimalnim uvjetima skladištenja, postupno gubi sposobnost klijavosti.

Do denaturacije bjelančevina dolazi prilikom pečenja kruha, sušenja tjestenine, povrća, tijekom kuhanja itd. Time se povećava biološka vrijednost ovih bjelančevina, jer se denaturirane (djelomično uništene) bjelančevine lakše apsorbiraju tijekom probave.

Izoelektrična točka proteina. Proteini sadrže različite bazične i kisele skupine koje imaju sposobnost ionizacije. U jako kiselom mediju se aktivno protoniraju glavne skupine (aminoskupine i dr.) te proteinske molekule dobivaju ukupni pozitivni naboj, a u jako alkalnom mediju karboksilne skupine lako disociraju, a proteinske molekule dobivaju ukupni negativni naboj.

Izvori pozitivnog naboja u proteinima su bočni radikali rezidua lizina, arginina i histidina, te a-amino skupina N-terminalnog aminokiselinskog ostatka. Izvori negativnog naboja su bočni radikali ostataka asparaginske i glutaminske kiseline, te α-karboksilna skupina C-terminalnog aminokiselinskog ostatka.

Pri određenoj pH vrijednosti medija postoji jednakost pozitivnih i negativnih naboja na površini proteinske molekule, tj. njegov ukupni električni naboj je jednak nuli. Ta pH vrijednost otopine, pri kojoj je proteinska molekula električki neutralna, naziva se izoelektrična točka proteina (pi).

Izoelektrične točke su karakteristične konstante proteina. Određeni su svojim aminokiselinskim sastavom i strukturom: brojem i rasporedom kiselih i bazičnih aminokiselinskih ostataka u polipeptidnim lancima. Izoelektrične točke proteina, u kojima prevladavaju kiseli aminokiselinski ostaci, nalaze se u području pH.<7, а белков, в которых преобладают остатки основных аминокислот - в области рН>7. Izoelektrične točke većine proteina su u blago kiselom okruženju.

U izoelektričnom stanju otopine proteina imaju minimalnu viskoznost. To je zbog promjene oblika proteinske molekule. U izoelektričnoj točki suprotno nabijene skupine se privlače jedna drugu, a proteini se uvijaju u kuglice. Kada se pH pomakne od izoelektrične točke, jednako nabijene skupine se međusobno odbijaju, a molekule proteina se razmotaju. U rasklopljenom stanju, proteinske molekule daju otopini veću viskoznost nego smotane u kuglice.

U izoelektričnoj točki proteini imaju minimalnu topljivost i mogu se lako taložiti.

Međutim, još uvijek ne dolazi do taloženja proteina u izoelektričnoj točki. To sprječavaju strukturirane molekule vode koje zadržavaju značajan dio hidrofobnih aminokiselinskih radikala na površini proteinskih globula.

Proteini se mogu taložiti organskim otapalima (alkohol, aceton), koja remete sustav hidrofobnih kontakata u proteinskim molekulama, kao i visokim koncentracijama soli (salting out), što smanjuje hidrataciju proteinskih globula. U potonjem slučaju, dio vode odlazi na otapanje soli i prestaje sudjelovati u otapanju proteina. Takva otopina, zbog nedostatka otapala, postaje prezasićena, što povlači za sobom taloženje njenog dijela u talog. Proteinske molekule počinju se lijepiti i, tvoreći sve veće čestice, postupno se talože iz otopine.

Optička svojstva proteina. Otopine proteina imaju optičku aktivnost, tj. sposobnost rotacije ravnine polarizacije svjetlosti. Ovo svojstvo proteina posljedica je prisutnosti asimetričnih elemenata u njihovim molekulama - asimetričnih ugljikovih atoma i desne a-spirale.

Kada se protein denaturira, mijenjaju se njegova optička svojstva, što je povezano s razaranjem a-heliksa. Optička svojstva potpuno denaturiranih proteina ovise samo o prisutnosti asimetričnih ugljikovih atoma u njima.

Po razlici u manifestaciji optičkih svojstava proteina prije i poslije denaturacije, može se odrediti stupanj njegove spiralizacije.

Kvalitativne reakcije na proteine. Za proteine ​​je karakteristična reakcija boja zbog prisutnosti određenih kemijskih skupina u njima. Ove se reakcije često koriste za otkrivanje proteina.

Kada se otopini proteina dodaju bakar sulfat i lužina, pojavljuje se lila boja, povezana s stvaranjem kompleksa bakrenih iona s peptidnim skupinama proteina. Budući da ova reakcija daje biuret (H 2 N-CO-NH-CO-NH 2), naziva se biuret. Često se koristi za kvantitativno određivanje proteina, uz I. Kjeldahl metodu, budući da je intenzitet dobivene boje proporcionalan koncentraciji proteina u otopini.

Kada se otopine proteina zagrijavaju s koncentriranom dušičnom kiselinom, pojavljuje se žuta boja zbog stvaranja nitro derivata aromatskih aminokiselina. Ova reakcija se zove ksantoprotein(grčki "xanthos" - žuto).

Mnoge otopine proteina, kada se zagrijavaju, reagiraju s otopinom živinog nitrata, pri čemu nastaju grimizni kompleksni spojevi s fenolima i njihovim derivatima. Ovo je kvalitativni Millonov test za tirozin.

Kao rezultat zagrijavanja većine otopina proteina s olovnim acetatom u lužnatom mediju, taloži se crni talog olovnog sulfida. Ova se reakcija koristi za otkrivanje aminokiselina koje sadrže sumpor i naziva se Fohlova reakcija.