Måling av enzymatisk aktivitet. Metabolisme og enzymer

Konseptet med enzymer

enzymer (enzymer) kalt løselige eller membranbundne proteiner utstyrt med katalytisk aktivitet. ( I tillegg til proteiner kan noen RNA (ribozymer) og antistoffer (abzymer) vise katalytisk aktivitet i kroppen, men de er tusenvis av ganger mindre effektive enn enzymer.) Disse navnene kommer fra det latinske "fermentatio" - fermentering og det greske " en zym” - inne i starteren . De minner om de første kildene til enzymer. Biokjemi, som studerer enzymer, kalles enzymologi. I diagrammene og i reaksjonsligningene er enzymmolekyler betegnet med - E. Stoffer som er katalysert av enzymer kalles underlag (S). Produkter enzymatisk reaksjon angir - R. Siden enzymer er proteiner, oppnås de i en homogen form på samme måte som andre proteiner. Enzymer er preget av de fysisk-kjemiske egenskapene som ligger i proteiner.

Forskjellen mellom enzymer og uorganiske katalysatorer:

a) akselerere reaksjoner mye mer effektivt;

b) utstyrt med høy spesifisitet av handling;

c) er regulert under fysiologiske forhold;

d) operere under milde forhold.

Strukturen til enzymer

Enzymer kan være både enkle og komplekse (konjugerte) proteiner, som kan inkludere lipider, karbohydrater, metallioner, nitrogenholdige baser, vitaminderivater. I kroppen kan enzymer fungere både i løselig tilstand og i form av uløselige komplekser eller være en del av biologiske membraner.

Det som kjennetegner enzymer er tilstedeværelsen aktivt senter. Aktivt senter - det er en unik kombinasjon av romsammenhengende aminosyrerester som gir:

a) gjenkjennelse av substratmolekylet,

b) binding av substratet til enzymet,

c) implementering av den katalytiske transformasjonen (i tilfelle av et komplekst enzym, deltar også koenzymet, som er en del av det aktive senteret, i katalysehandlingen).

Et aktivt sted oppstår når et protein folder seg og antar sin naturlige (aktive) konformasjon. Strukturen til det aktive senteret kan endres ved interaksjon med substratet. I følge det figurative uttrykket til D. Koshland, nærmer substratet seg det aktive senteret som en hånd mot en hanske.

Ett enzymmolekyl, spesielt hvis det består av flere underenheter, kan inneholde mer enn ett aktivt sted.

Det er to steder i det aktive senteret. Det første stedet er ansvarlig for gjenkjennelsen og bindingen av underlaget. Det kalles substratbindingsstedet eller forankringsområdet. Den andre delen kalles katalytisk, den består av aminosyrerester som deltar i katalysehandlingen.

Enzymer er proteiner som varierer mye i molekylvekt og strukturell kompleksitet. Et eksempel på et lite molekyl enzym er ribonuklease, som består av en enkelt underenhet med en molekylvekt på 13 700 Da. (Aminosyresekvensen til ribonuklease er bestemt. I 1969 ble ribonuklease syntetisert i laboratoriet til B. Merrifield i New York.) Mange enzymer består av flere underenheter, for eksempel består laktatdehydrogenase av fire underenheter av to typer. Til dags dato er flere multienzymkomplekser kjent, bestående av dusinvis av forskjellige underenheter og flere typer koenzymer. For eksempel består pyruvatdehydrogenasekomplekset av 60 underenheter av tre typer og fem typer kofaktorer. Molekylvekten til et slikt kompleks er 2,3 * 10 6 - 10 * 10 6 Da, avhengig av kilden til enzymet. Enzymmolekylet kan være mindre enn substratmolekylet. For eksempel: molekylene til enzymene amylase og ribonuklease er mindre enn molekylene til deres substrater - stivelse og RNA.

Proteindelen av komplekse enzymer er katalytisk inaktiv og kalles apoenzym. Bindingen av et apoenzym til en ikke-proteinkomponent fører til dannelsen av et katalytisk aktivt enzym (holoenzym):

Mange enzymer inneholder et metallion i sammensetningen, som kan utføre forskjellige funksjoner:

a) delta i bindingen av substratet og prosessen med dets katalytiske omdannelse;

b) fremme bindingen av koenzymet til enzymmolekylet;

c) stabilisere den tertiære strukturen til enzymet (f.eks. Ca 2+ i amylase);

d) ved å binde seg til substratet, danne et ekte substrat, som enzymet virker på.

Mange koenzymer er derivater av vitaminer, så metabolske forstyrrelser i vitaminmangel skyldes en reduksjon i aktiviteten til visse enzymer.

Noen enzymer, i tillegg til det aktive stedet, inneholder allosterisk (regulatorisk) senter - et område av en proteinkule, utenfor det aktive senteret, hvor stoffer som regulerer enzymatisk aktivitet kan binde seg. Disse stoffene kalles allosteriske effektorer (allosteriske aktivatorer eller inhibitorer). Som et resultat av bindingen av effektoren til det allosteriske senteret, oppstår en endring i proteinstrukturen, noe som fører til en endring i det romlige arrangementet av aminosyrerester i det aktive senteret og som et resultat til en endring i det enzymatiske aktivitet.

Enzymer som forekommer i samme organisme og katalyserer den samme kjemiske reaksjonen, men med en annen primær proteinstruktur, kalles isoenzymer. Isoenzymer skiller seg fra hverandre i slike fysisk-kjemiske egenskaper som molekylvekt, termisk stabilitet, substratspesifisitet, elektroforetisk mobilitet. Naturen til utseendet til isoenzymer er mangfoldig, men oftest på grunn av forskjeller i strukturen til genene som koder for disse isoenzymene eller deres underenheter. For eksempel har enzymet laktatdehydrogenase (LDH), som katalyserer den reversible oksidasjonen av laktat til pyruvat, fire underenheter av to typer M og H, kombinasjonen av disse underenhetene ligger til grunn for dannelsen av fem LDH-isoenzymer (fig. 1). For å diagnostisere sykdommer i hjerte og lever er det nødvendig å studere isoenzymspekteret til LDH i blodserumet, siden LDH 1 og LDH 2 er aktive i hjertemuskelen og nyrene, og LDH 4 og LDH 5 er aktive i skjelettmuskulaturen. og lever.

Fig.1 Strukturen til ulike LDH-isoenzymer.

Måling av enzymatisk aktivitet

Bestemmelse av enzymaktivitet utføres ved å måle hastigheten på katalyserte reaksjoner. Hastigheten av enzymatiske reaksjoner måles ved reduksjonen i konsentrasjonen av substratet eller økningen i konsentrasjonen av produktet per tidsenhet:

v = -ΔС S /Δτ, v = ΔC P /Δτ,

hvor ∆С S er endringen i substratets molare konsentrasjon (mol/l),

∆C P- endring i den molare konsentrasjonen av reaksjonsproduktet (mol / l),

Δτ - tidsendring (min, sek).

Det er ønskelig å utføre kinetiske studier ved en mettende konsentrasjon av substratet, ellers vil enzymet ikke være i stand til å utvise maksimal aktivitet.

Enheter for enzymaktivitet:

Enzym internasjonal enhet (U)- dette er mengden enzym som katalyserer omdannelsen av 1 μmol av substratet på 1 minutt ved en temperatur på 25 ° C og den optimale pH-verdien til mediet.

I SI-systemet er enheten til et enzym rullet (kat)- dette er mengden enzym som katalyserer transformasjonen av ett mol av substratet på 1 sekund. Det er lett å regne ut at:

1 U \u003d (1 * 10 -6 M) / 60 s \u003d 1,67 * 10 -8 M s-1 \u003d 1,67 * 10 -8 kat \u003d 16,7 ncat.

Ofte definert spesifikk aktivitet enzympreparater ved å dele aktiviteten til delen av enzympreparatet, uttrykt i (U), med vekten av delen i milligram:

Og slår \u003d U / massen av stoffet (mg)

Når enzymer renses, øker den spesifikke aktiviteten. Ved å øke den spesifikke aktiviteten kan man bedømme effektiviteten av rensetrinnene og renheten til enzympreparatet.

For å vurdere aktiviteten til høyt rensede, homogene enzympreparater ved å dele antall internasjonale enheter (U) av enzymet i prøven med mengden enzymstoff (µmol) i denne prøven, beregne molar aktivitet(hastighet). I fysiske termer er molar aktivitet antall substratmolekyler som gjennomgår transformasjon på ett enzymmolekyl i løpet av 1 minutt eller 1 sekund. For eksempel: for urease, som akselererer hydrolysen av urea, er den molare aktiviteten 30 000, for trypsin - 102, for glukoseoksidase - 17 000 sykluser per sekund.

Enzymegenskaper

4.1. Virkningsmekanismen. Enzymer forskyver ikke likevekten til de katalyserte reaksjonene mot dannelsen av produkter, og dermed forblir likevektskonstanten for reaksjonen konstant. Som alle katalysatorer reduserer enzymer bare tiden det tar å nå denne likevekten. I de fleste tilfeller fremskynder enzymer reaksjonene med 10 7 - 10 14 ganger. Effektiviteten til enzymatisk katalyse er basert på en sterk reduksjon i aktiveringsenergien til reaksjonen på grunn av transformasjonen av substratet til produktet gjennom overgangstilstander.

4.2. Spesifisitet av handling. Spesifisiteten til binding til underlaget og veiene for den enzymatiske reaksjonen bestemmes av apoenzymet. Spesifisiteten til virkningen av enzymer bestemmer den rettet metabolisme i kroppen.

Enzymer sies å ha smal substratspesifisitet hvis de virker på et svært lite utvalg av underlag. Noen ganger kan man snakke om absolutt substratspesifisitet, for eksempel katalyserer katalase bare én reaksjon - nedbrytningen av hydrogenperoksid:

For de fleste enzymer, relativ (bred, gruppe) substratspesifisitet når de katalyserer en gruppe lignende reaksjoner. For eksempel katalyserer alkoholdehydrogenase omdannelsen av alkoholer til aldehyder, og metanol, etanol, propanol og andre alkoholer kan fungere som substrater. Det er interessant at alkoholdehydrogenase også kan oksidere ikke-lineære alkoholer, så vel som en alkoholgruppe som er en del av komplekse molekyler; spesielt kan dette enzymet katalysere omdannelsen av retinol til retinal. Naturligvis katalyserer enzymer utstyrt med bred substratspesifisitet substrattransformasjoner med varierende effektivitet.

Enzymer er også utstyrt stereokjemisk spesifisitet: deres aktive sete gjenkjenner substratmolekyler ved deres romlige konfigurasjon. For eksempel er L-aminosyreoksidaser bare aktive på L-aminosyrer og har absolutt ingen effekt på deres D-analoger. For oksidativ deaminering av D-aminosyrer i levende organismer finnes det D-aminosyreoksidaser som ikke virker på L-aminosyrer. Det er evnen til det aktive stedet til å binde seg til visse stereoisomerer av substratet som ligger til grunn for funksjonen til slike enzymer som racemaser, som omdanner en stereoisomer til en annen.

Spesifisitet av transformasjonsveier er at ett substrat under påvirkning av forskjellige enzymer kan omdannes til produkter som er forskjellige i struktur og rolle i metabolismen.

Her er et eksempel: L-aminosyreoksidaser virker på L-aminosyrer, omdanner dem til alfa-ketosyrer med dannelse av ammoniakk og hydrogenperoksid.

L-aminosyredekarboksylaser binder seg til de samme substratene, men katalyserer en annen reaksjon: dekarboksylering med dannelse av biogene aminer og frigjøring av karbondioksid.

Et annet eksempel er muligheten for å omdanne glukose-6-fosfat under påvirkning av forskjellige enzymer, langs en av de mulige metabolske veiene:

4.3. Termolabilitet .

Som mange proteiner gjennomgår enzymer termisk denaturering med økende temperatur, noe som fører til et brudd på den opprinnelige konformasjonen til enzymet og en endring i strukturen til det aktive senteret. Pattedyrenzymer begynner å merkbart denaturere ved temperaturer over 40 °C.

I forbindelse med det foregående er det ønskelig å lagre enzympreparater ved lave temperaturer. En av de beste måtene å bevare enzymer på er å lyofilisere dem (tørke ved temperaturer under -70° C. under vakuum), delvis denaturere dem med ammoniumsalter og plassere dem i kjøleskap.

4.4. Reaksjonshastighetens avhengighet av temperatur. Hastigheten av enzymatiske reaksjoner, som alle kjemiske reaksjoner, avhenger av temperaturen. Når temperaturen stiger med 10 o C, øker reaksjonshastigheten med 2-4 ganger i henhold til van't Hoff-regelen. Ved temperaturer over 40°C blir imidlertid denatureringen av enzymer betydelig, noe som fører til en reduksjon i den totale aktiviteten (fig. 2):

Ris. 2. Avhengighet av den enzymatiske reaksjonshastigheten av temperatur.

4.5. Reaksjonshastighetens avhengighet av pH. Den enzymatiske reaksjonshastighetens avhengighet av pH har en klokkeformet form (fig. 3). pH-verdiene der den høyeste hastigheten av den enzymatiske reaksjonen observeres kalles optimal (pH-optimum). Naturen til kurvene og verdien av pH-optimumet avhenger av naturen til de ladede gruppene i substratet og de ladede gruppene til enzymet (spesielt de som inngår i det aktive setet). pH-optimumet for de fleste enzymer ligger i området fra 6,0 til 8,0 (fig. 3).

Ris. 3. Avhengighet av den enzymatiske reaksjonshastigheten av pH.

Imidlertid er det unntak, for eksempel er pepsin mest aktivt ved pH 1,5 - 2,0, og alkalisk fosfatase ved pH 10,0 - 10,5 (fig. 4).

Ris. 4. Avhengighet av den enzymatiske reaksjonshastigheten (v) av pH i mediet.

Ved ekstreme (svært lave eller svært høye) pH-verdier blir den tertiære strukturen til enzymmolekylet forstyrret, noe som fører til tap av enzymatisk aktivitet.

Lignende informasjon.

Konseptet med enzymaktivitet

I daglig biokjemisk praksis er mengden av enzymet praktisk talt ikke estimert, men bare dets aktivitet. Aktivitet er et bredere begrep enn kvantitet. Det innebærer først og fremst resultatet av reaksjonen, nemlig tap av substratet eller akkumulering av produktet. Naturligvis kan man ikke se bort fra tiden enzymet har virket og antall enzymmolekyler. Men siden det vanligvis er urealistisk å beregne antall enzymmolekyler, brukes mengden biologisk materiale som inneholder enzymet (volum eller masse).

Når du bestemmer aktiviteten til enzymer, må tre variabler tas i betraktning samtidig:

massen av det oppnådde produktet eller det forsvunne substratet;
tid brukt på reaksjon;
mengden enzym, men faktisk massen eller volumet av biologisk materiale som inneholder enzymet.

For å forstå sammenhengen mellom disse faktorene kan et klart og enkelt eksempel være bygging av to bygninger. Bygninger er likestilt med produktet av reaksjonen, arbeidere er enzymer, la teamet tilsvare volumet av biologisk materiale. Så, oppgaver fra 3. klasse:

Et team på 10 personer jobbet med byggingen av ett bygg, et team på 5 personer jobbet på et annet bygg av samme type. Byggingen ble fullført samtidig og i sin helhet. Hvor er aktiviteten til arbeidere høyere?
Et team på 10 personer jobbet med byggingen av en bygning på 3 etasjer, en annen bygning på 12 etasjer - et team på 10 personer. Byggingen ble fullført samtidig og i sin helhet. Hvor er aktiviteten til arbeidere høyere?
På byggingen av en bygning på 5 etasjer jobbet et team på 10 personer, en annen i samme bygning - et team på 10 personer. Byggingen av den første bygningen tok 20 dager, den andre ble fullført på 10 dager. Hvor er aktiviteten til arbeidere høyere?

Grunnleggende om kvantifisering av enzymaktivitet

1. Enzymaktivitet uttrykkes som akkumuleringshastigheten av produktet eller hastigheten på tapet av substratet i form av mengden materiale som inneholder enzymet.

I praksis bruker de vanligvis:

mengdeenheter av et stoff - mol (og dets derivater mmol, µmol), gram (kg, mg),
tidsenheter - minutt, time, sekund,
enheter av masse eller volum - gram (kg, mg), liter (ml).

Andre derivater brukes også aktivt - katal (mol / s), den internasjonale aktivitetsenheten (IE, Enhet) tilsvarer μmol / min.

Enzymaktivitet kan således uttrykkes for eksempel i mmol/s×l, g/h×l, IU/l, cat/ml, etc.

For eksempel er det kjent

2. Oppretting av standardbetingelser for å kunne sammenligne resultatene oppnådd i ulike laboratorier - optimal pH og fast temperatur, for eksempel 25°C eller 37°C, adherens til substratets inkubasjonstid med enzymet.

Enzymaktivitet. Under enzymaktivitet forstå mengden, som katalyserer transformasjonen av en viss mengde substrat per tidsenhet. For å uttrykke aktiviteten til enzympreparater brukes to alternative enheter: internasjonal (IE) og katal (kat). Per internasjonal aktivitetsenhet mengden enzym som tas er slik at den katalyserer omdannelsen av 1 µmol av substratet til produktet på 1 min under standardbetingelser (vanligvis optimalt). En rullet angir mengden enzym som katalyserer omdannelsen av 1 mol substrat på 1 s (1 kat = 6 ∙ 10 7 IE). I den bimolekylære reaksjonen A + B = C + D, blir mengden enzymaktivitet som katalyserer omdannelsen av 1 µmol A eller B, eller 2 µmol A (hvis B = A) på 1 min tatt som en enhet for enzymaktivitet.

Ofte er enzympreparater preget av spesifikk aktivitet, som gjenspeiler graden av rensing av enzymet. Spesifikk aktivitet er antall enheter enzymaktivitet per 1 mg protein.

Molekylær aktivitet (antall enzymomsetninger) er antall substratmolekyler omdannet av ett enzymmolekyl på 1 min når enzymet er fullstendig mettet med substratet. Det er lik antall enheter enzymaktivitet delt på mengden enzym, uttrykt i mikromol. Konseptet med molekylær aktivitet gjelder bare for rene enzymer.

Når antall aktive sentre i et enzymmolekyl er kjent, introduseres konseptet katalytisk stedaktivitet . Det er preget av antall substratmolekyler som gjennomgår transformasjon på 1 min per ett aktivt senter.

Aktiviteten til enzymer avhenger sterkt av ytre forhold, blant hvilke temperaturen og pH i mediet er av største betydning. En økning i temperatur i området 0–50 ° С fører vanligvis til en gradvis økning i enzymaktivitet, som er assosiert med en akselerasjon av prosessene for dannelse av enzym-substratkomplekset og alle påfølgende hendelser av katalyse. For hver 10°C økning i temperatur dobles reaksjonshastigheten omtrent (van't Hoffs regel). En ytterligere temperaturøkning (>50°C) er imidlertid ledsaget av en økning i mengden inaktivert enzym på grunn av denatureringen av proteindelen, som uttrykkes i en reduksjon i aktivitet. Hvert enzym er karakterisert temperatur optimal– temperaturverdien der dens største aktivitet er registrert.

Avhengigheten av enzymaktivitet på pH-verdien til mediet er kompleks. Hvert enzym har sitt eget optimal pH miljøer der den er mest aktiv. Når du beveger deg bort fra denne verdien i en eller annen retning, avtar den enzymatiske aktiviteten. Dette skyldes en endring i tilstanden til det aktive senteret av enzymet (reduksjon eller økning i ionisering av funksjonelle grupper), samt den tertiære strukturen til hele proteinmolekylet, som avhenger av forholdet mellom kationiske og anioniske sentre i det. De fleste enzymer har en optimal pH i det nøytrale området. Imidlertid er det enzymer som viser maksimal aktivitet ved pH 1,5 (pepsin) eller 9,5 (arginase). Ved arbeid med enzymer må pH-verdien opprettholdes med en passende bufferløsning.

Enzymaktivitet er utsatt for betydelige svingninger avhengig av eksponering inhibitorer(stoffer som helt eller delvis reduserer aktiviteten) og aktivatorer(stoffer som øker aktiviteten). Deres rolle spilles av metallkationer, noen anioner, bærere av fosfatgrupper, reduserende ekvivalenter, spesifikke proteiner, mellom- og sluttprodukter av metabolisme, etc.

Prinsipper for enzymatisk kinetikk. Essensen av kinetiske studier er å bestemme den maksimale hastigheten for den enzymatiske reaksjonen ( V max) og Michaelis konstant K M. Enzymatisk kinetikk studerer hastigheten for kvantitative transformasjoner av noen stoffer til andre under påvirkning av enzymer. Hastigheten til en enzymatisk reaksjon måles ved tap av substratet eller økningen i det resulterende produktet per tidsenhet, eller ved endringen i konsentrasjonen av en av de tilstøtende formene av koenzymet.

Innflytelse enzymkonsentrasjon på reaksjonshastigheten uttrykkes som følger: hvis konsentrasjonen av substratet er konstant (forutsatt et overskudd av substratet), så er reaksjonshastigheten proporsjonal med konsentrasjonen av enzymet. For kinetiske studier brukes en enzymkonsentrasjon på 10–8 M aktive sentre. Den optimale verdien av enzymkonsentrasjonen bestemmes fra grafen over enzymaktivitetens avhengighet av konsentrasjonen. Den optimale verdien anses å ligge på platået til den oppnådde grafen i området av enzymaktivitetsverdier som avhenger lite av konsentrasjonen (fig. 4.3).

Ris. 4.3. Avhengigheten av hastigheten på den enzymatiske reaksjonen

på enzymkonsentrasjon

For å studere påvirkningen substratkonsentrasjon på hastigheten til den enzymatiske reaksjonen, bygg først en kinetisk kurve som reflekterer endringen i konsentrasjonen av substratet (S 1) eller produktet (P 1) over tid (fig. 4.4) og mål starthastigheten ( V 1) reaksjoner som tangenten til hellingen av tangenten til kurven ved nullpunktet.

Ris. 4.4. Kinetiske kurver for den enzymatiske reaksjonen

Ved å konstruere kinetiske kurver for andre konsentrasjoner av et gitt substrat (S 2 , S 3 , S 4 , etc.) eller produkt (P 2 , P 3 , P 4 , etc.) og bestemme starthastighetene ( V 2, V 3 , V 4, etc.) av reaksjonen, bygg en graf over avhengigheten av starthastigheten til den enzymatiske reaksjonen av konsentrasjonen av substratet (ved en konstant konsentrasjon av enzymet), som har form av en hyperbel (fig. 4.5) ).

Ris. 4.5. Avhengighet av starthastigheten til den enzymatiske reaksjonen

fra substratkonsentrasjon

Kinetikken til mange enzymatiske reaksjoner er beskrevet av Michaelis-Menten-ligningen. Ved konstant enzymkonsentrasjon og lave substratkonsentrasjoner[S] startreaksjonshastigheten er direkte proporsjonal med [S] (fig. 4.5). I dette tilfellet snakker vi om halvmetning av enzymet med substratet, når halvparten av enzymmolekylene er i form av et enzym-substratkompleks og reaksjonshastigheten V = 1/2V maks. I forhold til substratet har reaksjonen 1. orden (reaksjonshastigheten er direkte proporsjonal med konsentrasjonen av en reaktant) eller 2. orden (reaksjonshastigheten er proporsjonal med produktet av konsentrasjonene til de to reaktantene).

På høye verdier substratkonsentrasjon[S] reaksjonshastigheten er nesten uavhengig av [S]: med ytterligere økning i [S] vokser reaksjonshastigheten langsommere og blir til slutt konstant (maksimum) (fig. 4.5). I dette tilfellet oppnås fullstendig metning av enzymet med substratet når alle enzymmolekyler er i form av et enzym-substratkompleks og V = V maks. Med hensyn til substratet har reaksjonen 0. orden (reaksjonshastigheten er ikke avhengig av konsentrasjonen av reaktantene).

I 1913 foreslo L. Michaelis og M. Menten en enkel modell for å forklare slik kinetikk. I følge denne modellen er dannelsen av et spesifikt enzym-substratkompleks et nødvendig mellomtrinn i katalyse.

k 1 k 3

E + S ⇄ ES → E + P

Enzym E kombineres med substrat S for å danne et ES-kompleks. Hastighetskonstanten for denne prosessen k en . Skjebnen til ES-komplekset er todelt: det kan enten dissosiere til enzym E og substrat S med en hastighetskonstant k 2, eller gjennomgår ytterligere transformasjon, og danner produkt P og fritt enzym E, med en hastighetskonstant k 3 . Det postuleres at reaksjonsproduktet ikke omdannes til det opprinnelige substratet. Denne tilstanden observeres i det innledende trinnet av reaksjonen, mens konsentrasjonen av produktet er lav.

Katalysehastigheten bestemmes i stasjonære forhold, når konsentrasjonen av mellomprodukter forblir konstant, mens konsentrasjonen av utgangsmaterialer og sluttprodukter endres. Dette skjer når dannelseshastigheten til ES-komplekset er lik hastigheten på dets forfall.

Du kan introdusere en ny konstant K M - Michael er konstant(mol/l), som er lik

Michaelis–Menten-ligningen, som uttrykker det kvantitative forholdet mellom hastigheten på den enzymatiske reaksjonen og konsentrasjonen av substratet, har formen

(4.2)

Denne ligningen tilsvarer et plott av reaksjonshastighet mot substratkonsentrasjon. På lave substratkonsentrasjoner når [S] er mye lavere enn K M, V = V maks [S] / K M, dvs. reaksjonshastigheten er direkte proporsjonal med konsentrasjonen av substratet. På høye substratkonsentrasjoner når [S] er mye høyere enn K M, V = V max, dvs. reaksjonshastigheten er maksimal og avhenger ikke av konsentrasjonen av substratet.

Hvis [S] = K M, da V = V maks /2.

Dermed K M lik substratkonsentrasjonen der reaksjonshastigheten er halvparten av maksimum.

Michaelis konstant (KM) og maksimal reaksjonshastighet ( V max) er viktige hastighetsegenskaper ved forskjellige substratkonsentrasjoner. V max er en konstant verdi for hvert enzym, noe som gjør det mulig å evaluere effektiviteten av dets virkning.

Michaelis-konstanten viser affiniteten til substratet for enzymet (i tilfelle når k 2 >> k 3): jo lavere K M, jo større affinitet og høyere reaksjonshastighet, og omvendt. Hvert substrat er karakterisert ved sin KM-verdi for et gitt enzym, og verdiene deres kan brukes til å bedømme substratspesifisiteten til enzymet. Michaelis-konstanten avhenger av substratets natur, temperatur, pH, ionestyrken til løsningen og tilstedeværelsen av inhibitorer.

På grunn av det faktum at definisjonen V max og K M direkte fra den grafiske avhengigheten til Michaelis - Menten (Fig. 4.5) er tvetydig, de tyr til lineariseringen av denne ligningen. For å gjøre dette konverteres den til en slik form at den uttrykkes grafisk som en rett linje. Det er flere lineariseringsmetoder, blant dem er Lineweaver-Burk- og Edie-Hofstee-metodene mest brukt.

transformasjon Lineweaver-Burke har formen

(4.3)

Lag en avhengighetsgraf 1/ V = f(1/[S]) og få en rett linje, hvis skjæringspunkt med y-aksen gir verdien 1/ V maks ; segmentet avskåret av en rett linje på abscisseaksen gir verdien −1 / K M, og tangenten til helningsvinkelen til den rette linjen til abscisseaksen er K M / V maks (fig. 4.6). Denne grafen lar deg bestemme mer nøyaktig V maks. Som vi vil se nedenfor, kan verdifull informasjon angående hemming av enzymaktivitet også trekkes ut fra dette plottet.

Ris. 4.6. Metode for å linearisere Michaelis–Menten-ligningen

(ifølge Lineweaver-Burke)

Metode Edie – Hofsty er basert på å transformere Michaelis–Menten-ligningen ved å multiplisere begge sider med V maks:

(4.4)

Tegn graf i koordinater V og V/[S] er en rett linje, hvis skjæringspunkt med y-aksen gir verdien V maks, og segmentet avskåret av en rett linje på abscisseaksen er verdien V max / K M (Fig. 4.7). Det gjør det veldig enkelt å bestemme K M og V max , samt oppdage mulige avvik fra linearitet som ikke ble oppdaget i forrige graf.

Ris. 4.7. Metode for å linearisere Michaelis–Menten-ligningen

(ifølge Edie-Hofsty)

Hemming av enzymaktivitet. Virkningen av enzymer kan undertrykkes helt eller delvis av visse kjemikalier - inhibitorer . Av arten av deres virkning er inhibitorer delt inn i reversible og irreversible. Denne inndelingen er basert på bindingsstyrken til inhibitoren til enzymet.

Reversible inhibitorer – Dette er forbindelser som interagerer ikke-kovalent med enzymet og når de fjernes gjenopprettes aktiviteten til enzymet. Reversibel hemming kan være konkurransedyktig, ikke-konkurransedyktig og ikke-konkurransedyktig.

Et eksempel konkurransehemming er virkningen av strukturelle analoger av substratet, som kan binde seg til det aktive stedet til enzymet på lignende måte som substratet, men uten å bli til et produkt og forhindre interaksjonen mellom enzymet og det sanne substratet, dvs. det er konkurranse. mellom substratet og inhibitoren for binding til enzymets aktive sete. Som et resultat av dannelsen av enzym-inhibitor (EI) komplekser, synker konsentrasjonen av ES-komplekser, og som et resultat avtar reaksjonshastigheten. Med andre ord, en konkurrerende inhibitor reduserer katalysehastigheten ved å redusere andelen enzymmolekyler som binder substratet.

Måling av reaksjonshastigheter ved forskjellige substratkonsentrasjoner gjør det mulig å skille konkurrerende inhibering fra ikke-konkurrerende inhibering. Med konkurrerende hemming på grafen for avhengighet 1/ V=f(1/[S]) linjer skjærer y-aksen i ett punkt 1/ V maks uavhengig av tilstedeværelsen av en inhibitor, men i nærvær av en inhibitor øker tangenten til helningen til den rette linjen til abscisseaksen, dvs. V max endres ikke, mens KM øker, noe som indikerer en reduksjon i affiniteten til substratet for enzymet i nærvær av en inhibitor (fig. 4.8). Derfor, ved en tilstrekkelig høy konsentrasjon av substratet under konkurransebetingelser for det aktive setet til enzymet, når substratet fortrenger inhibitoren fra det aktive setet, kan inhibering elimineres og hastigheten på den katalyserte reaksjonen gjenopprettes. I dette tilfellet har Michaelis − Menten-ligningen formen

(4.5)

hvor [I] er inhibitorkonsentrasjonen; K Jeg er inhiberingskonstanten.

Inhiberingskonstanten karakteriserer affiniteten til enzymet for inhibitoren og er dissosiasjonskonstanten til EI-komplekset:

(4.6)

I nærvær av en konkurrerende inhibitor, øker helningen til den rette linjen til x-aksen med (1 + [I]/ K Jeg).

Ris. 4.8. Konkurransehemming:

a - ordning; b - grafisk uttrykk i henhold til Lineweaver - Burke

På ikke-konkurrerende hemming inhibitoren skiller seg i struktur fra substratet og binder seg ikke til det aktive, men til det allosteriske stedet til enzymet. Dette fører til en endring i konformasjonen av det aktive stedet til enzymet, som er ledsaget av en reduksjon i den katalytiske aktiviteten til enzymet. Dessuten kan inhibitoren binde seg ikke bare til det frie enzymet (E + I → EI), men også til enzym-substratkomplekset (ES + I → ESI). Begge skjemaene EI og ESI er ikke aktive. Substratet og inhibitoren kan bindes samtidig av enzymmolekylet, men deres bindingssteder overlapper ikke. Virkningen til en ikke-konkurrerende inhibitor er å redusere antall enzymomsetninger, og ikke å redusere andelen substratbundne enzymmolekyler. Inhibitoren forhindrer ikke dannelsen av ES-komplekser, men hemmer omdannelsen av substratet til produktet. Derved V max synker, dvs. i nærvær av en inhibitor, vil skjæringen av den rette linjen med y-aksen skje på et høyere punkt (fig. 4.9). I samme grad, tangenten til helningsvinkelen til den rette linjen til abscisseaksen, lik K M / V maks jeg. K M i motsetning til V max endres ikke, så ikke-konkurrerende hemming kan ikke elimineres ved å øke substratkonsentrasjonen.

Ris. 4.9. Ikke-konkurrerende hemming:

a - ordning; b - grafisk uttrykk i henhold til Lineweaver - Burke

Maksimal reaksjonshastighet V max I i nærvær av en ikke-konkurrerende inhibitor er beskrevet av ligningen

(4.7)

I et spesielt tilfelle ukonkurransedyktig hemning, når inhibitoren bare binder seg til ES-komplekset og ikke binder seg til det frie enzymet, på avhengighetsgrafen 1/ V = f(1/[S]) linjer er parallelle med hverandre og skjærer ordinat- og abscisseaksene på forskjellige punkter (fig. 4.10).

Ris. 4.10. Ukonkurrerende hemming:

a - ordning; b - grafisk uttrykk i henhold til Lineweaver - Burke

irreversible inhibitorer - Dette er svært reaktive forbindelser av forskjellig kjemisk natur, som kan samhandle med funksjonelt viktige grupper i det aktive senteret, og danner sterke kovalente bindinger. Dette fører til et irreversibelt tap av enzymaktivitet. I denne forbindelse er Michaelis-Menten-teorien, basert på antakelsen om at bindingen av en inhibitor til et enzym er reversibel, ikke aktuelt i dette tilfellet.

Et eksempel på irreversibel hemming er interaksjonen av enzymer med tungmetallioner, som er festet til sulfhydrylgruppene av cysteinrester av enzymet og danner merkaptider, som praktisk talt er ikke-dissosierende forbindelser, eller kovalent modifisering av enzymet under virkning av alkyleringsmidler.

(aktivatorer - økning, hemmere - reduksjon) Proteinenzymer syntetiseres på ribosomer, og RNA - i kjernen.

Begrepene "enzym" og "enzym" har lenge blitt brukt som synonymer (den første er hovedsakelig i russisk og tysk vitenskapelig litteratur, den andre - på engelsk og fransk).
Vitenskapen om enzymer kalles enzymologi, og ikke fermentologi (for ikke å blande røttene til ordene på latin og gresk).

Studiehistorie

Begrep enzym foreslått på 1600-tallet av kjemikeren van Helmont da han diskuterte fordøyelsesmekanismene.

I kon. XVIII - tidlig. 1800-tallet det var allerede kjent at kjøtt fordøyes av magesaft, og stivelse omdannes til sukker ved virkningen av spytt. Mekanismen til disse fenomenene var imidlertid ukjent.

Enzymer er mye brukt i den nasjonale økonomien - mat, tekstilindustri, i farmakologi.

Enzymklassifisering

I henhold til typen katalyserte reaksjoner er enzymer delt inn i 6 klasser i henhold til den hierarkiske klassifiseringen av enzymer (KF, - Enzyme Commission-kode). Klassifiseringen ble foreslått av International Union of Biochemistry and Molecular Biology (International Union of Biochemistry and Molecular Biology). Hver klasse inneholder underklasser, så et enzym er beskrevet av et sett med fire tall atskilt med prikker. For eksempel har pepsin navnet EC 3.4.23.1. Det første tallet beskriver grovt sett mekanismen for reaksjonen katalysert av enzymet:

CF 1: Oksidoreduktase som katalyserer oksidasjon eller reduksjon. Eksempel: katalase, alkoholdehydrogenase
CF 2: Overføringer som katalyserer overføringen av kjemiske grupper fra ett substratmolekyl til et annet. Blant transferasene er kinaser spesielt utmerkede, som som regel overfører en fosfatgruppe fra et ATP-molekyl.
CF 3: Hydrolaser som katalyserer hydrolyse av kjemiske bindinger. Eksempel: esteraser, pepsin, trypsin, amylase, lipoproteinlipase
CF 4: Liase, som katalyserer brudd av kjemiske bindinger uten hydrolyse med dannelse av en dobbeltbinding i ett av produktene.
CF 5: Isomeraser, som katalyserer strukturelle eller geometriske endringer i substratmolekylet.
CF 6: Ligaser, som katalyserer dannelsen av kjemiske bindinger mellom substrater på grunn av hydrolysen av ATP. Eksempel: DNA-polymerase

Kinetisk forskning

Kjemisk reaksjonsmetningskurve som illustrerer forholdet mellom substratkonsentrasjon [S] og reaksjonshastighet v

Den enkleste beskrivelsen av kinetikken til enzymatiske reaksjoner med ett substrat er Michaelis-Menten-ligningen (se fig.). Til dags dato har flere mekanismer for enzymvirkning blitt beskrevet. For eksempel er virkningen av mange enzymer beskrevet av ordningen med "ping-pong"-mekanismen.

Struktur og virkningsmekanisme til enzymer

Aktiviteten til enzymer bestemmes av deres tredimensjonale struktur.

Som alle proteiner, syntetiseres enzymer som en lineær kjede av aminosyrer som folder seg på en bestemt måte. Hver aminosyresekvens folder seg på en bestemt måte, og det resulterende molekylet (proteinkule) har unike egenskaper. Flere proteinkjeder kan kombineres til et proteinkompleks. Den tertiære strukturen til proteiner ødelegges når de varmes opp eller utsettes for visse kjemikalier.

For å katalysere en reaksjon må et enzym binde seg til ett eller flere substrater. Proteinkjeden til enzymet er foldet på en slik måte at det dannes et gap, eller depresjon, på overflaten av kulen, der substratene binder seg. Denne regionen kalles substratbindingsstedet. Vanligvis faller det sammen med det aktive stedet for enzymet eller ligger i nærheten av det. Noen enzymer inneholder også bindingssteder for kofaktorer eller metallioner.

Noen enzymer har små molekylbindingssteder og kan være substrater eller produkter av den metabolske veien som enzymet kommer inn i. De reduserer eller øker aktiviteten til enzymet, noe som skaper en mulighet for tilbakemelding.

De aktive sentrene til noen enzymer er preget av fenomenet kooperativitet.

Spesifisitet

Enzymer viser vanligvis høy spesifisitet for deres substrater. Dette oppnås ved delvis komplementaritet av formen, ladningsfordelingen og hydrofobe områdene på substratmolekylet og ved substratbindingsstedet på enzymet. Enzymene viser et høyt nivå av stereospesifisitet, regioselektivitet og kjemoselektivitet.

Modell med nøkkellås

Koshlands induserte anfallsformodning

En mer realistisk situasjon er i tilfelle indusert matching. Feil underlag - for stort eller for lite - passer ikke til det aktive stedet

I 1890 foreslo Emil Fischer at spesifisiteten til enzymer bestemmes av nøyaktig samsvar mellom enzymets form og substratet. Denne antagelsen kalles lås-og-nøkkel-modellen. Enzymet binder seg til substratet for å danne et kortvarig enzym-substratkompleks. Men selv om denne modellen forklarer den høye spesifisiteten til enzymer, forklarer den ikke fenomenet stabilisering av overgangstilstand som observeres i praksis.

Modell med indusert passform

I 1958 foreslo Daniel Koshland en modifikasjon av nøkkellåsmodellen. Enzymer er generelt ikke stive, men fleksible molekyler. Det aktive stedet til enzymet kan endre konformasjon etter binding av substratet. Sidegruppene til aminosyrene til det aktive stedet inntar en posisjon som lar enzymet utføre sin katalytiske funksjon. I noen tilfeller endrer substratmolekylet også konformasjon etter binding til det aktive stedet. I motsetning til nøkkellås-modellen, forklarer den induserte tilpasningsmodellen ikke bare spesifisiteten til enzymer, men også stabiliseringen av overgangstilstanden.

Modifikasjoner

Mange enzymer gjennomgår modifikasjoner etter syntesen av proteinkjeden, uten hvilke enzymet ikke viser sin aktivitet i full utstrekning. Slike modifikasjoner kalles post-translasjonelle modifikasjoner (behandling). En av de vanligste modifikasjonstypene er tilsetning av kjemiske grupper til siderestene i polypeptidkjeden. For eksempel kalles tilsetningen av en fosforsyrerest fosforylering og katalyseres av enzymet kinase. Mange eukaryote enzymer er glykosylerte, dvs. modifisert med karbohydratoligomerer.

En annen vanlig type post-translasjonelle modifikasjoner er polypeptidkjedespaltning. For eksempel oppnås chymotrypsin (en protease involvert i fordøyelsen) ved å spalte en polypeptidregion fra chymotrypsinogen. Chymotrypsinogen er en inaktiv forløper for chymotrypsin og syntetiseres i bukspyttkjertelen. Den inaktive formen transporteres til magesekken hvor den omdannes til chymotrypsin. Denne mekanismen er nødvendig for å unngå spaltning av bukspyttkjertelen og annet vev før enzymet kommer inn i magesekken. En inaktiv enzymforløper blir også referert til som et "zymogen".

Enzymkofaktorer

Noen enzymer utfører den katalytiske funksjonen på egen hånd, uten noen tilleggskomponenter. Imidlertid er det enzymer som krever ikke-proteinkomponenter for katalyse. Kofaktorer kan enten være uorganiske molekyler (metallioner, jern-svovelklynger, etc.) eller organiske (f.eks.

1. Funksjoner ved enzymatiske reaksjoner

2. Effekt av temperatur på enzymaktivitet

3. Effekt av pH på enzymaktivitet

4. Enzymaktivatorer og -hemmere

Jeg. Alle enzymatiske reaksjoner har 4 funksjoner

· Høy aktivitet av enzymer;

Reversibiliteten av virkningen av enzymer;

Spesifisiteten til virkningen av enzymer;

labilitet (sensitivitet).

Høy enzymaktivitet. Enzymer forårsaker en høy hastighet på den enzymatiske reaksjonen, som er preget av antall enzymomsetninger - dette er antallet substratmolekyler som blir til reaksjonsprodukter under påvirkning av ett enzymmolekyl per tidsenhet. For eksempel har alkoholdehydrogenase en aktivitet på 4700 enheter, fosforylase - 50000 enheter, a-amylase - 16000 enheter.

Reversibilitet av enzymvirkning etablert av Danilevsky. Under reversibiliteten av virkningen av enzymer forstås dannelsen av ES-komplekset og dets forfall, dvs. reaksjoner som involverer enzymet kan gå både i én retning (biosyntese) og i motsatt retning (forfall).

Spesifisiteten til virkningen av enzymer- hvert enzym virker kun på sitt spesifikke substrat eller gruppe av beslektede substrater. For eksempel virker invertase på sukrose; a-amylase - bare på stivelse og dekstriner; proteaser til proteiner.

Det er to synspunkter som forklarer spesifisiteten til virkningen av enzymer. I følge den figurative ideen til E. Fisher, "nærmer et enzym seg til underlaget som en nøkkel til en lås", dvs. topografien til det aktive senteret av enzymet er ikke bare høyt ordnet, men også stivt fiksert. Det aktive stedet for enzymet tilsvarer topografien til bare ett enkelt substrat. Det andre synspunktet, foreslått av D. Koshland, er teorien om indusert konformasjon av enzymet og substratet: konformasjonen av enzymet, spesielt dets aktive senter, er i stand til visse modifikasjoner. Avhengig av konformasjonsmobiliteten til det aktive stedet, er enzymet i stand til å interagere med enten noen få eller en lang rekke substrater. Med andre ord, i øyeblikket for dannelse av ES-komplekset, skjer endringer i strukturen til både enzymet og substratet. Som et resultat tilpasser de seg til hverandre.

Spesifisiteten til enzymer spiller en viktig rolle i prosessen med metabolisme i en levende organisme. (Hvis enzymet ikke hadde unike egenskaper, ville det ikke vært metabolisme i en levende organisme)

På grunnlag av spesifisitet er enzymer delt inn i 2 grupper:

Absolutt spesifisitet - enzymet virker bare på et enkelt stoff eller katalyserer bare en viss transformasjon av dette stoffet;

Relativ eller gruppespesifisitet - enzymer virker samtidig på mange underlag som har en rekke felles strukturelle egenskaper.

Labilitet (sensitivitet) - alle enzymer er følsomme for forhøyede temperaturer og lave pH-verdier, hvor det er tap av enzymaktivitet.

II. Den viktigste faktoren som aktiviteten til enzymer avhenger av er temperatur.

Grafisk er avhengigheten av den enzymatiske reaksjonshastigheten på temperaturen som følger:

Ved 0°C, og enda mer ved temperaturer under 0°C, opphører virkningen av de fleste enzymer. En økning i temperatur (kurve 1) over 0°C fremmer en økning i aktiviteten til enzymer (antall kollisjoner av reaktanter øker). Ved en viss temperatur viser enzymet maksimal aktivitet. For de fleste enzymer er den optimale virkningstemperaturen 40-50°C. En ytterligere temperaturøkning fører til enzyminaktivering (reduksjon i aktivitet) på grunn av termisk denaturering av proteinmolekylet (kurve 2).

Endringen i reaksjonshastigheten med økende temperatur for hver 10°C uttrykkes ved temperaturkoeffisienten Q 10 . Temperaturkoeffisienten er forholdet mellom reaksjonshastigheten ved en gitt temperatur vt +10 og reaksjonshastigheten ved en temperatur 10 °C under den gitte:

Verdien av Q 10 for kjemiske reaksjoner ligger i grensene på 2-4, for en enzymatisk reaksjon - mellom 1 og 2; Q 10 enzymatiske reaksjoner avtar markant med økende temperatur.

III. Hvert enzym utøver sin aktivitet innenfor et ganske smalt pH-område. Den grafiske avhengigheten av enzymaktivitet på pH er som følger:

I et surt miljø, ved lave pH-verdier, har det form av EH 2 + , i denne formen er det inaktivt. Ved optimal pH har enzymet maksimal aktivitet og er i form av EH; når mediet er alkalisert, tar enzymet formen E - .

Optimal aktivitet tilsvarer et visst pH-område, og hvert enzym har sin egen optimale pH-verdi for virkning (for eksempel har bakteriell a-amylase en optimal pH på 6, og a-amylase av mikroskopiske sopp er 4,7). Den optimale pH-verdien er assosiert med aminosyresammensetningen til enzymer.

Den klokkeformede formen på kurven vil bli forklart av enzymenes amfotere natur; de stigende og synkende grenene til denne kurven er typiske titreringskurver og bestemmes av pK-verdiene til de ioniske gruppene som er på det aktive stedet til enzymene.

For å bestemme de funksjonelle gruppene som er inkludert i det aktive senteret av enzymet, er det nødvendig å bestemme avhengigheten av aktiviteten til dette enzymet på pH ved forskjellige temperaturer og å bestemme pK-verdien. Når du kjenner verdiene til ΔрК for de sure og alkaliske grenene av avhengigheten v = f(pH), finnes funksjonelle grupper som tilsvarer denne verdien.

IV. Alle stoffer som følger med enzymet under reaksjonen kan deles inn i aktivatorer, inhibitorer og nøytrale forbindelser.

Aktivatorer- kjemiske forbindelser som øker virkningen av enzymer (for eksempel aktiverer glutation virkningen av proteaser, NaCl øker aktiviteten til amylaser); inhibitorer- forbindelser som hemmer deres aktivitet (for eksempel hemmer -CN-gruppen aktiviteten til respiratoriske enzymer lokalisert i cytokromsystemet) og nøytrale forbindelser har ingen effekt på enzymer.

Inhiberingsprosessen kan være reversible og irreversible.

Reversible inhibitorer er:

Konkurrerende handling - inhibitoren samhandler med de funksjonelle gruppene til det aktive senteret av enzymer. Inhibering i dette tilfellet avhenger av konsentrasjonen av substratet: hvis [S] er stor, kan det hende at effekten av inhibitoren [I] ikke vises; hvis [S] er liten, kan inhibitoren fortrenge substratet fra forbindelsen med enzymet, hvis virkning deretter hemmes. Det trippel ESI-komplekset dannes aldri under konkurrerende hemming.

· Ikke-konkurrerende hemming observeres når inhibitoren ikke er i stand til å feste seg til enzymet, den kan ikke binde seg til enzym-substratkomplekset, og omdanner det til en inaktiv form.

· Ved blandet hemming virker inhibitoren både på ES-bindingssetet og det katalytiske stedet til enzymet.