Enzymer er proteinkatalysatorer for biokjemiske reaksjoner, mest av som i fravær av enzymet ville gå ekstremt sakte. I motsetning til kjemiske katalysatorer, kan hvert enzym bare katalysere et svært lite antall reaksjoner, ofte bare én.

Enzymer er således reaksjonsspesifikke katalysatorer. Nesten alle biokjemiske reaksjoner katalyseres av enzymer.

Mange enzymer har en katalytisk effekt på substrater bare i nærvær av en spesifikk termostabil lavmolekylær organisk forbindelse, et koenzym.

I slike tilfeller består holoenzymet (katalytisk aktivt kompleks) av et apoenzym (proteindel) og et tilhørende koenzym (vedlegg H). Koenzymet kan assosieres med apoenzymet ved kovalente og ikke-kovalente bindinger. Begrepet "protesegruppe" refererer til et kovalent bundet koenzym. Reaksjoner som krever tilstedeværelse av et koenzym inkluderer: redoks, gruppeoverføring, isomerisering og kondensasjonsreaksjoner (ifølge IUB-systemet er disse klassene 1, 2, 5, 6). Spaltningsreaksjoner fortsetter i fravær av koenzymer (ifølge IUB-systemet er disse klassene 3 og 4).

^ 4.1 Laboratoriearbeid"Bestemmelse av amylaseaktivitet
malt etter Wolgemuth-metoden

Wohlgemuth-metoden er basert på å bestemme minimumsmengden av et enzym som er i stand til å fullstendig hydrolysere 1 ml av en 0,1 % stivelsesløsning under visse forhold. Amylaseaktiviteten til malt uttrykkes som antall milliliter av en 0,1 % stivelsesløsning som kan hydrolyseres med 1 ml maltekstrakt ved en temperatur på 38 ° C i 30 minutter. Normal amylaseaktivitet er fra 160 til 320 enheter aktivitet.

Wohlgemuth-metoden er mye brukt i klinisk praksis for å bestemme amylaseaktiviteten til blod og urin, i brygging - for å bestemme amylaseaktiviteten til malt. En kraftig økning i amylaseaktivitet i blod og urin (10-30 ganger) observeres ved akutt pankreatitt, bukspyttkjertelsvulster.

^ Materialer og reagenser: ekstrakt fra kornmalt, fortynnet 10 ganger; 0,1 % stivelsesløsning; 0,1 % jodløsning i 0,2 % kaliumjodidløsning.

Utstyr: stativ med reagensrør, pipetter, dropper, termostat.

^ Fremgang. Hell 1 ml destillert vann i ti reagensglass. 1 ml av ekstraktet fortynnet 10 ganger tilsettes det første reagensglasset, blandes, 1 ml av blandingen overføres til det andre reagensglasset. Innholdet i dette røret blandes igjen og 1 ml overføres til det tredje røret og så videre opp til det tiende røret. 1 ml tas fra det siste røret og kastes. Således, i hvert påfølgende rør, er enzyminnholdet to ganger mindre enn i det forrige. Fortynningen av ekstraktet i ti reagensrør vil være: 1:10; 1:20; 1:40; 1:80; 1:160; 1:320; 1:640; 1:1280; 1:2560; 1:5120; 1:10240.

Deretter tilsettes 1 ml vann og 2 ml stivelsesløsning til alle reagensglass, blandes og plasseres i en termostat ved en temperatur 38 °C i 30 min. Etter inkubering avkjøles rørene springvann for å stoppe virkningen av enzymet, tilsett to dråper jodløsning, rist godt og observer fargeendringen. Når den reagerer med jod, blir væsken gul, rosa og lilla.

Legg merke til hvilken avl som skjedde fullstendig hydrolyse stivelse med et minimum enzyminnhold (reagensrør med gulaktig farge på innholdet), amylaseaktiviteten til ekstraktet beregnes fra mengden ufortynnet ekstrakt (A) i dette reagensrøret
(En ml av ekstraktet bryter ned X ml av en 0,1 % stivelsesløsning).

For eksempel, gul dukket opp i det fjerde reagensglasset, hvor ekstraktet ble fortynnet 160 ganger. Denne mengden ekstrakt er i stand til å hydrolysere 2 ml av en 0,1 % stivelsesløsning, og 1 ml ufortynnet ekstrakt hydrolyserer 320 ml under samme betingelser: X = 2 × 160/1. Derfor er amylaseaktiviteten 320.

^ 4.2 Laboratoriearbeid "Bestemmelse av katalaseaktivitet

av Bach"

Metoden er basert på å bestemme mengden av hydrogenperoksid som er igjen etter virkningen av katalase på den ved titrering av en KMnO 4-løsning på den. Reaksjonen fortsetter i henhold til ligningen

1 ml 0,1 mol/l kaliumpermanganatløsning tilsvarer 85 mg hydrogenperoksid.

^ Materialer og reagenser: katalase-preparat (1 g byggmaltspirer males i en porselensmørtel med 6 ml fosfatbuffer og filtreres); 10 % H2SO4-løsning; 0,1 % hydrogenperoksidløsning i fosfatbuffer, pH=7,0 (35,0 ml 0,2 mol/l NaH2P04 i 13,6 ml 0,2 mol/l NaH2P04); 0,1 mol/l KMnO 4 løsning.

Utstyr: 100 ml kolber, pipetter, byretter, termostat.

^ Fremgang. 2 ml av katalasepreparatet tilsettes to kolber, 1 ml av en 10 % løsning av H 2 SO 4 tilsettes til en av dem (prøve), deretter helles 2 ml hydrogenperoksidløsning i hver kolbe, plasseres i en termostat i 40 minutter ved en temperatur på 38 °C. Etter inkubasjonstiden tilsettes 1 ml 10 % H 2 SO 4 løsning til den andre kolben (kontroll), og begge løsningene titreres med 0,1 mol/l KMnO 4 løsning inntil en vedvarende rosa farge vises fra overskudd av kaliumpermanganat.

Katalaseaktivitet bestemmes av mengden spaltet hydrogenperoksid (ml) og beregnes med formelen:

,

Hvor
- forskjellen mellom resultatene av titrering av kontroll- og testprøver med 0,001 N løsning av KMnO 4 , ml;

Q er mengden hydrogenperoksid (85 mg), tilsvarende
1 ml 0,1 mol/l KMnO 4 løsning.

^ 4.3 Laboratoriearbeid "Dryppmetode
(ifølge Klimovsky og Rodzevich)"

Amylolytisk aktivitet, hovedsakelig på grunn av tilstedeværelsen av α-amylase i preparatet, karakteriserer enzymets evne til å katalysere hydrolysen av stivelse til produkter som ikke er farget med jod. I nærvær av α-amylase og glukoamylase i preparatet, bestemmer denne metoden den totale effekten av alle amylolytiske enzymer.

Enheten for amylolytisk aktivitet i denne metoden tas som mengden enzym som katalyserer nedbrytningen av 1 g løselig stivelse til produkter som ikke er farget med jod i løpet av 1 time ved en temperatur på 30 ºС under strengt definerte forhold. Den amylolytiske aktiviteten til AS uttrykkes ved antall indikerte enheter i 1 g av preparatet, kulturen eller i 1 cm 3 løsning. AC-verdien viser hvor mange gram stivelse som kan hydrolyseres til forbindelser som ikke er farget med jod i 1 g av et preparat, kultur eller 1 cm 3 av en løsning i løpet av 1 time under bestemmelsesbetingelser. Slutten av reaksjonen kontrolleres visuelt ved hjelp av jodtesten.

Følsomheten til metoden bestemmes minimumsbeløpet tid som du visuelt kan fange fargeendringen til jod. Det antas at hastigheten på den enzymatiske reaksjonen er direkte proporsjonal med mengden enzym som brukes og forblir konstant i 5 minutter til 1 time, det vil si at reaksjonen overholder reaksjonsloven null rekkefølge. I tillegg kommer påvirkningen av pH-verdien og kjemisk natur buffer etter AC-verdi. Med acetatbuffer (pH=4,7) er AS-verdien i sopppreparater i gjennomsnitt 1,5 ganger høyere enn ved bestemmelse med fosfatbuffer (pH=6,0). Derfor, når man skal bestemme AS-verdien til soppkulturer, anbefales det å ta en acetatbuffer.

Ulempen med metoden er uklarheten visuell definisjon slutten av reaksjonen.

^ Materialer og reagenser: acetatbuffer pH=4,7 for enzymer av soppopprinnelse; fosfatbuffer pH=6,0 for enzymer av bakteriell opprinnelse; 1% stivelsesløsning (stivelsesløsning brukt til analyse av sopppreparater skal ha pH = 4,7, for analyse av bakteriepreparater - 6,0); jodløsninger. For å tilberede den basiske løsningen av jod, veies 4,4 g kaliumjodid, 1,4 g metallisk jod opp i et tarert glass med nedmalt lokk, ca. 2 cm 3 destillert vann tilsettes. Glasset lukkes med lokk, innholdet omrøres, og etter oppløsning av jod overføres løsningen til en målekolbe med et volum på 100 cm 3 med en malt propp. Fortynn volumet med destillert vann til merket. Innholdet i kolben oppbevares på et mørkt og kjølig sted. Den grunnleggende løsningen av jod kan brukes innen 30 dager fra datoen for fremstillingen. Arbeidsløsningen av jod tilberedes fra stamløsningen. For å gjøre dette helles 20 cm 3 av den basiske løsningen av jod i en målekolbe med en kapasitet på 100 cm 3, 4,4 g kaliumjodid tilsettes og det totale volumet av løsningen justeres til 100 cm 3. Arbeidsløsningen av jod kan konsumeres innen seks dager etter tilberedning.

Utstyr: brede prøverør, glassstaver, pipetter, 50 ml begerglass, petriskåler, termostat.

^ Fremgang. For å bestemme AC-verdien er det viktig å følge reaksjonsbetingelsene strengt. For å gjøre dette må alle løsninger - substrat (1% stivelsesløsning), enzymløsning og destillert vann varmes opp til en temperatur på 30 ° C.

Substratet i en mengde på 25 cm 3 (12,5 ml) plasseres i et bredt reagensrør hvor en glassstang settes inn. 30 cm 3 (15 ml) av ekstraktet og 30 cm 3 (15 ml) vann helles i separate reagensrør, plasseres i en termostat og holdes ved en temperatur på 30 ºС i
10 minutter.

Deretter tilsettes fra 1 til 25 cm 3 av den opprinnelige enzymløsningen og den tilsvarende mengden vann til et bredt reagensrør til stivelsesløsningen, uten å fjerne reagensrørene fra termostaten, ved hjelp av pipetter slik at det totale volumet av reaksjonen blandingen er 50 cm 3 . Hvis enzymekstraktet er inaktivt, kan du bare tilsette det i en mengde på 25 cm 3, og ikke tilsette vann i det hele tatt.

Innholdet i reagensrøret blandes med en pinne og tidspunktet noteres med stoppeklokke når ekstraktet ble tilsatt stivelsesløsningen. Hvert 60. sekund tas en dråpe prøve fra reagensrøret uten å fjerne det fra termostaten. En dråpe legges på en hvit porselensplate, denne dråpen kombineres med en dråpe jodarbeidsløsning og fargen observeres. Stivelsesfordøyelsesreaksjonen anses som fullført når jod slutter å gi en fargeendring når den kombineres med en dråpe av testløsningen innen de første 10 sekundene. Endringen i farge er tydelig synlig ved kontaktgrensen mellom to dråper - jod og reaksjonsblandingen.

Tiden det tar før stivelse brytes ned til produkter som ikke flekker med jod, bør være mellom 10 og
20 minutter.

Hvis hydrolysetiden er mindre enn 10 minutter, gjentas bestemmelsen med mindre ekstrakt og mer vann for hydrolyse. Hvis hydrolysen ikke avsluttes innen 20 minutter, gjentas analysen også, og tar mer enzymekstrakt og mindre vann for bestemmelse. Mengden enzymekstrakt som må tas for reanalyse, beregnet under hensyntagen til den oppnådde hydrolysetiden.

Hvis enzymekstraktet har lite eller for mye høy aktivitet, og mengden enzymløsning fra 1 til 25 cm 3 gir ikke varigheten av stivelseshydrolyse i 10 ... 20 minutter, da tas ikke 25 cm 3 stivelsesløsning for analyse, men mer eller mindre av det, for eksempel, tilsvarende endring til beregningsformel(henholdsvis 0,1 eller 0,4 i stedet for de vanlige 0,25).

Verdien av den amylolytiske aktiviteten til AS (enheter/g) beregnes med formelen:

Hvor 0,25 er mengden stivelse som er i 25 cm 3 av en 1 % løsning, g;

60 - konverteringsfaktor i 1 time;

N er mengden av enzymet som er involvert i reaksjonen, g eller cm 3 (denne verdien bestemmes under hensyntagen til konsentrasjonen av initialekstraktet og påfølgende fortynning);

T er tiden som stivelse ble degradert til produkter som ikke var farget med jod, min.

Eksempel. Et enzymatisk ekstrakt av luftkulturen til soppen ble tatt for analyse. Stamløsningen ble fremstilt med en hastighet på 5 g kultur i 100 cm3 bufret vann. Det er kjent at denne kulturen er veldig aktiv, derfor ble det laget en ekstra fortynning av den opprinnelige løsningen: 20 cm 3 ble brakt i en målekolbe til 50 cm 3 med destillert vann, og derfra ble 2 cm 3 tatt for analyse, Jeg. følgende avlssekvens ble oppnådd:

5 g → 100 cm 3 → 20 cm 3 → 50 cm 3 → 2 cm 3.

Det tok 12 minutter å hydrolysere 0,25 stivelse (25 cm 3 av en 1 % stivelsesløsning) med den siste fortynningsenzymløsningen (2 cm 3). Da vil AC for den lufttørke kulturen (enhet/g) være:

Ved omberegning enzymatisk aktivitet bør ikke tas helt i betraktning. tørrstoff enzympreparering, og tar hensyn til fuktighet. Beregningen bør gjøres i henhold til formelen:

,

Hvor W er fuktighetsinnholdet i kulturen eller preparatet.

^ 4.4 Laboratoriearbeid "Wilstetter-metoden
og Waldschmidt-Leitz definisjon av proteolytisk
enzymaktivitet i modifikasjonen"

Metoden er basert på bestemmelse av frie karboksylgrupper i alkoholløsninger av aminosyrer og polypeptider.

Aktivitet (PS) uttrykkes ved antall milligram aminnitrogen, som dannes under hydrolysen av en viss mengde av en 5% gelatinløsning med en pH-verdi på 7,3 til 7,5 1 g av legemidlet eller 1 cm 3 av stoffet. enzymløsning i 1 time ved en temperatur på 40 ºС.

En enhet for proteolytisk aktivitet er mengden enzym som danner 1 mg aminnitrogen i løpet av 1 time under aksepterte eksperimentelle forhold.

^ Materialer og reagenser: 96 % etylalkohol; 1% tymolftaleinløsning; 0,1 N NaOH-løsning; substrat - 5% gelatinløsning; ekstrakt fra den analyserte planten.

Fremstilling av ekstraktet for å bestemme den proteolytiske aktiviteten: en prøve på 0,25 g plantemateriale legges i en porselensmørtel og males i 2,5 minutter med 2,5 ml fosfatbuffer (pH=7,3), deretter filtreres massen.

Tilberedning av en 5 % løsning av gelatin (substrat): 5 g gelatin bløtlegges på forhånd i en glasskopp i 15...20 cm 3 destillert vann i 20...30 minutter. Det hovne proteinet helles i 20 ... 25 cm 3 av en bufferløsning ved en temperatur på 70 til 80 ° C og blandes grundig med en glassstang. Den oppløste delen helles i en målekolbe med et volum på 100 cm 3, ytterligere 20 ... 25 cm 3 bufferløsning tilsettes til den uoppløste delen, og den resulterende løsningen overføres igjen til samme kolbe. Gelatinløsningen avkjølt til 40 °C bringes til merket med en bufferløsning med samme temperatur. Den tilberedte gelatinløsningen oppbevares i kjøleskap ved en temperatur på 2 til 5 °C og brukes til analyse innen to dager. Før analyse varmes gelatinløsningen opp til en temperatur på 40 °C i vannbad.

Utstyr: koniske kolber med et volum på 200 til 250 ml, målekolber med et volum på 50 ml, glassstaver, pipetter, byretter, termostat.

^ Fremgang. Til 10 cm 3 av en 5 % gelatinløsning med en pH-verdi på 7,3 til 7,5, tilsett 2 cm 3 av testenzymløsningen og ta umiddelbart 1 cm 3 av reaksjonsblandingen i en konisk kolbe med en kapasitet på 50 til 100 cm 3, hvor tidligere hell 20 cm 3 96% etyl alkohol og 0,2 cm3 1 % tymolftalein. Prøven titreres med 0,1 N NaOH til en blå farge vises.

Den gjenværende blandingen av gelatin med enzymløsningen plasseres i en termostat med en temperatur på 40 ºС for hydrolyse. Etter 3 timer tas 1 cm3 av reaksjonsblandingen inn i en andre kolbe med en kapasitet på 50 til 100 cm3, hvor 20 cm3 96% etylalkohol og 0,2 cm3 1% tymolftalein først helles. Prøven titreres som for kontrollvarianten.

Beregningen av den proteolytiske aktiviteten til PS utføres i henhold til formelen:

,

Hvor A er mengden amin-nitrogen akkumulert under forsøket fra reaksjonsmediet, ml;

T er varigheten av proteolyse, h;

P er en koeffisient som tar hensyn til fortynning og omregning for 1 g av legemidlet eller 1 cm 3 av en flytende enzymløsning.

Verdien av A beregnes med formelen:

,

Hvor a er mengden av 0,1 n NaOH-løsning brukt for titrering av 1 cm 3 av forsøksprøven, cm 3;

Og k - det samme for kontrollprøven;

1.4 er koeffisienten for å konvertere mengden av 0,1 n alkaliløsning til milligram nitrogen av aminosyrer og polypeptider;

K - korreksjon til titeren av alkali.

Bestemmelse av katalaseaktivitet

(ifølge A.N. Bach og A.I. Oparin)

Oksidoreduktaser er en klasse enzymer som katalyserer redoksreaksjoner. Oksydasjonen av monomerer dannet under katabolismen av polymerer er en kompleks flertrinnsprosess.

Oksidasjon av stoffer i celler foregår hovedsakelig ved å spalte av hydrogen (dehydrogenering) eller spalte av elektroner, eller ved å tilsette oksygen til molekylet til den oksiderte forbindelsen.

Hydrogenakseptorer for dehydrogenaser er NAD +, NADP, FAD og FMN, for noen flavinsyrer - oksygen (de kalles oksidaser), for hemholdig (peroksidaser og katalase) - H 2 O 2 (hydrogenperoksid).

Elektronakseptorer og -bærere er hemholdige cytokromer (hemoproteiner).

Katalase (EC 1.11.1.6) refererer til hemoproteiner, katalyserer prosessen med ødeleggelse av hydrogenperoksid, giftig for celler, til vann og oksygen: 2 H 2 O 2 \u003d 2 H 2 O + O 2.

For en levende celle er hydrogenperoksid en sterk gift, så alle enzymene som danner og nøytraliserer H 2 O 2 befinner seg i peroksisomer – membrandekkede organeller. Hovedforbrukerne av H 2 O 2 er peroksidaser (EC 1.11.1.7.), som oksiderer fenoler, aminer, noen heterosykliske forbindelser og andre substrater ved dehydrogenering, overfører fjernet fra substrater til H 2 O 2, og reduserer det til 2 H 2 O. Molekyler hydrogenperoksid, som ikke er gjort krav på av peroksidaser, nøytraliseres av katalase.

Metoden for å bestemme aktiviteten til katalase er basert på å bestemme mengden av hydrogenperoksid som splittes under inkubering med enzymet. Mengden H 2 O 2 i reaksjonsblandingen bestemmes ved titrering i surt miljø løsning med en konsentrasjon av kaliumpermanganat 0,02 mol / l:

5 H 2 O 2 + 2KMnO 4 + 3H 2 SO 4 = 2MnSO 4 + K 2 SO 4 + 5O 2 + 8H 2 O

Basert på reaksjonsligningen ovenfor kan det beregnes at 1 ml av en løsning med en konsentrasjon av kaliumpermanganat på 0,02 mol/l tilsvarer 1,7 mg (50 µmol) hydrogenperoksid.

FRAMGANG. 2-3 g rå poteter (eller annet ferskt plantemateriale) males forsiktig i en morter med kvartssand eller glass. For å redusere syrereaksjonen tilsettes CaCO 3 på tuppen av skalpellen til frigjøringen av CO 2 -bobler stopper. I prosessen med sliping tilsettes 40-50 ml vann i små porsjoner til mørtelen. Pulvermassen overføres kvantitativt til en 100 ml målekolbe, fortynnes med vann til merket og blandes. Blandingen får stå i 10-15 minutter og filtreres etter omrøring.

Ta to koniske kolber med en kapasitet på 150-200 ml og tilsett 20 ml av det oppnådde filtratet til dem. Innholdet i en kolbe kokes i 1 min og avkjøles til romtemperatur (kontroll). En annen forsøkskolbe inneholder et aktivt enzym. Til innholdet i forsøks- og kontrollkolben, tilsett 20 ml vann og 3 ml av en løsning med massefraksjon H 2 O 2 1 %. Innholdet blandes grundig og får stå i romtemperatur i 30 minutter. På slutten av inkubasjonen tilsettes 5 ml av en løsning med en massefraksjon av svovelsyre på 10 % til begge kolber, blandes og overskuddet H 2 O 2 i hver kolbe titreres med en løsning med en kaliumpermanganatkonsentrasjon på 0,02 mol/l til det dannes en rosa farge som ikke forsvinner på 1 minutt.

Katalaseaktivitet uttrykkes i µmol hydrogenperoksid spaltet under virkningen av enzymet per 1 g av testmaterialet (eller 1 mg ekstrakt fra det) i 1 min. Beregningen utføres i henhold til formelen:

hvor X– aktivitet av katalase, U/g;

(a-b)- forskjellen mellom volumene av en løsning med en konsentrasjon av kaliumpermanganat på 0,02 mol/l, som ble brukt til titrering av kontrollen (en) og erfarne (b) prøver, ml;

T er titeren til kaliumpermanganatløsningen som brukes for titrering;

50 er konverteringsfaktoren pr. µmol H 2 O 2;

100 er det totale volumet av det fremstilte ekstraktet;

m er massen av materialet tatt for analyse, g;

20 er volumet av filtratet tatt for analyse, ml;

30 – inkubasjonstid, min.

Bestemmelsesprinsippet, analyserekkefølgen og resultatet av analysen registreres.

Aktiviteten til katalase kan også bestemmes av volumet av oksygen som frigjøres etter tilsetning av H 2 O 2 til objektet som studeres.

Dette prinsippet brukes til å bestemme aktiviteten til katalase i melk, uttrykt ved katalasenummeret, som er volumet av oksygen (ml) som frigjøres i løpet av 2 timer ved 25 ° C fra 5 mg av en løsning tilsatt 15 ml melk med en massefraksjon av H 2 O 2 1 %. Melk hentet fra friske dyr frigjør 0,7-2,5 ml oksygen, d.v.s. katalasetallet for naturlig melk er ikke mer enn 2,5. Melk hentet fra syke dyr (mastitt, etc.) og råmelk har forhøyede katalasetall, og når opp til 15.

REAGENSER. Destillert vann; kalsiumkarbonat (pulver); løsning med en konsentrasjon av kaliumpermanganat 0,02 mol/l; løsninger med massefraksjoner: hydrogenperoksid 1 % (10 ml av en løsning med en massefraksjon av H 2 O 2 30 % fortynnet med vann til 300 ml), svovelsyre 10 %.

TEST SPØRSMÅL.

1. Hovedveier for substratoksidasjon i cellen.

2. Kjennetegn på strukturen og virkningen av NAD + - og NADP-avhengige dehydrogenaser.

3. Kjennetegn på strukturen og virkningen av FAD-avhengige dehydrogenaser.

4. Hvilke enzymer kalles oksidaser? deres kofaktorer.

5. Karakteristikker av strukturen og virkningen av peroksidaser og katalaser.

6. Kjennetegn på strukturen og virkningen av cytokromer.

7. Kjemi, dannelse og måter for nøytralisering av hydrogenperoksid i celler.

8. Metode for å bestemme aktiviteten til katalase.

№	Navn på laboratorieemner	Antall timer
	Dyrking av mikroorganismer ved overflatemetode på faste næringsmedier.
	Ekstraksjon av overflatedyrkede enzymer
	Dyrking av mikroorganismer ved dyp metode
	Bestemmelse av aktiviteten til maltamylaser.
	Fremstilling av enzympreparatet og massebehandling
	Bestemmelse av osteegnethet av melk ved løpetest
	Bestemmelse av bakteriell forurensning av melk
	Studie av effekten av varmebehandling på melkens egenskaper.
	TOTAL:

Enzymer

Enzymer er biologiske katalysatorer av proteinnatur, dannet av enhver levende celle og har evnen til å aktivere ulike kjemiske forbindelser.

Virkningsmekanismen til enzymer, som alle andre katalysatorer, er assosiert med en reduksjon i aktiveringsenergien som kreves for passasje av kjemisk reaksjon, dirigerer den i en rundkjøring gjennom mellomreaksjoner som krever en mye lavere aktiveringsenergi. Således forløper reaksjonen AB A + B i nærvær av et enzym som følger: AB + F → AVF; AVF→A+VF; WF→W+F. →

Alle enzymer er delt inn i to store klasser: en-komponent og to-komponent.

Den første klassen inkluderer enzymer som kun består av et protein med katalytiske egenskaper, og den andre klassen inkluderer enzymer som består av et protein og en ikke-proteindel knyttet til det, den såkalte aktive gruppen. Begrepet koenzym, eller protesegruppe, brukes ofte for å navngi de aktive gruppene av tokomponentenzymer. I enkeltkomponentenzymer utføres rollen til aktive grupper av visse kjemiske grupper inkludert i proteinet. Disse gruppene kalles aktive eller katalytiske sentre.

En av egenskapene til enzymer som skiller seg fra egenskapene uorganiske katalysatorer, er deres store labilitet - avhengighet av en rekke påvirkninger: konsentrasjonen av hydrogenioner, temperatur, redoksforhold, konsentrasjonen av visse forbindelser (metabolske produkter), metallioner, etc.

Det andre er veldig viktig funksjon Den katalytiske virkningen av enzymer ligger i det faktum at den er strengt spesifikk, det vil si at virkningen av enzymer er rettet mot veldig spesifikke kjemiske bindinger.

I henhold til arten av deres katalytiske virkning er enzymer delt inn i seks klasser:

1) oksidoreduktaser eller redoksenzymer;

2) transferaser, dvs. enzymer som katalyserer overføringen ulike grupper atomer fra ett molekyl til et annet;

3) hydrolaser som katalyserer hydrolytiske reaksjoner;

4) lyaser - enzymer som spalter en eller annen gruppe fra substrater (ikke ved hydrolyse) med dannelse av en dobbeltbinding, eller omvendt, fester seg til dobbeltbindinger;

5) isomeraser, dvs. enzymer som katalyserer isomeriseringsreaksjoner organiske forbindelser;

6) ligaser eller syntetaser - enzymer som katalyserer syntetiske reaksjoner tilhører denne klassen.

Hver av disse klassene er delt inn i underklasser, og disse sistnevnte på sin side i mindre grupper.

På alle stadier av bearbeiding av korn til mel, under lagring, samt under tilberedning av deig og baking av brød, manifesteres aktiviteten til hydrolytiske og oksidative enzymer i større eller mindre grad, som har en betydelig innvirkning på kvaliteten på produktet.

I kornet finnes enzymer i vevet til embryoet, aleuronlaget og endospermen. Det er karakteristisk for de levende planteceller enzymer som bestemmer spesifikke funksjoner i metabolske prosesser.

Av de mange enzymene som finnes i korn, er det kun de som har eller kan ha innvirkning på kvaliteten på kornforedlingsprodukter som har gjennomgått en grundig studie. Disse inkluderer amylaser, proteaser, lipaser, lipoksygenaser, polyfenoloksidaser osv. Sammen med dette ble det funnet at noen kornenzymer kan være gode indikatorer på dens fysiologiske tilstand. Katalase, som er veldig termolabil, reflekterer godt reduksjonen i spiring under tørking av frøkorn, og dens aktivitet kan tjene som en indikator for å kontrollere tørkeprosessen.

Eksepsjonelt stort biologisk betydning amylase under modning og spiring av korn, samt i en rekke teknologiske prosesser næringsmiddelindustri, som er basert på hydrolytiske transformasjoner av stivelse under påvirkning av kornamylaser.

Kornkornet inneholder to spesifikke enzymer som bestemmer hydrolysen av stivelse, nemlig:

1) -1,4 - glukanhydrolase eller αα-amylase, som hydrolyserer α-1,4 - glukanbindinger av stivelse og beslektede polysakkarider, og disse bindingene brytes tilfeldig;

2) -1,4 - glukanmaltohydrolase eller αβ - amylase, hydrolyserer α-1,4 - glukanbindinger i polysakkarider, sekvensielt spalter maltoserester fra ikke-reduserende kjedeender.

Til tross for at proteaser ikke er mindre viktige for teknologi, er de mye mindre studert enn amylaser. Grunnen til dette er at de klassiske metodene for å studere proteaser av animalsk opprinnelse (enzymer som hydrolyserer proteiner) viste seg å være ineffektive i å studere proteolytiske enzymer Frokostblandinger. Under påvirkning av proteaser oppstår flytendegjøring av gluten, noe som igjen fører til en forringelse av kvaliteten på bakt brød.

Lipaser forårsaker hydrolyse av fett, dvs. dele estere glyserin med dannelse av frie fettsyrer, noe som resulterer i en økning i surheten til korn og mel.

Med deltagelse av lipoksygenaser oksideres umettede fettsyrer, karbonyl- og karboksylforbindelser med lav molekylvekt dannes, som har dårlig lukt og bitter smak. Denne prosessen kalles harskning av fett (mel).

Laboratoriearbeid №1.

Emne: Dyrking av mikroorganismer ved overflatemetode på faste næringsmedier.

Objektiv: Voksende produsenter av forskjellige enzymer på faste granulære medier og analysere de resulterende kulturene for aktiviteten til enzymene de inneholder.

Overflatekulturmetode. Overflatedyrking av aerober utføres på et tett eller løst medium, så vel som i et tynt lag av et flytende medium i glass med bred bunn: petriskåler, Winogradsky-kolber, madrasser, kyvetter. Såede kar dyrkes ved konstant temperatur i termostater eller termostatrom (varmekamre). Mikroorganismer vokser på overflaten av miljøet og bruker oksygen direkte fra luften. På flytende medier vokser obligate aerober i form av rikelige filmer. Fakultative aerober (anaerober) utvikles både i tykkelsen av det flytende mediet, og danner suspensjoner, flak, sedimenter og på overflaten i form av en tynn film. På tette medier vokser mikroorganismer i form av individuelle kolonier eller en sammenhengende plen. Overflatedyrking i laboratorieforhold er mye brukt for å oppnå akkumulerende og rene kulturer, deres lagring, studiet av morfologiske, kulturelle og biokjemiske egenskaper til mikroorganismer. I industrien brukes metoden med overflatekulturer på flytende medier for å oppnå sitronsyre, på løse medier - for produksjon av enzympreparater.

1. Tilberedning av retter og deres sterilisering;

2. Tilberedning av næringsmedium og sterilisering av det;

3. Beregning av mengden vann som trengs for å fukte næringsmediet;

4. Fukting av et sterilt næringsmedium, dets inokulering og utforming i kyvetter for dyrking;

1. Klargjøring av retter for sterilisering. Alle redskaper må vaskes grundig og tørkes i ovn før sterilisering.

For sterilisering bør følgende gjenstander pakkes inn i papir og knyttes forsiktig med snorer: en kyvette, et lokk til kyvetten.

Sterilisering av servise og vann bør utføres i en autoklav ved en temperatur på 120ºС i 0,5 timer.

Sterile tallerkener etter autoklavering bør tørkes i en ovn ved 105 ºС, da papiret er lett fuktet under sterilisering.

2. Klargjøring og sterilisering av næringsmediet. For hver mikroorganisme tilberedes et eget næringsmedium som sikrer biosyntesen av visse enzymer Mediet for hver kyvette steriliseres separat. Det tilberedte mediet legges enten i en pose, eller et flerlags gasbind, eller i et bredt glassbeger. For Asp. oryzae, for eksempel, brukes følgende varianter av næringsmedier: hvetekli-100,70; maltspirer-30; betemasse-50; avfall av druer-20; maltspirer-50; risskall-50.

3. For normal utvikling mikroskopisk sopp og intensiv dannelse av enzymer, er det nødvendig at miljøet har en fuktighet på 58-63%.

Beregningen av mengden tilsatt vann utføres i henhold til følgende data:

Acp er massen av næringsmediet med det opprinnelige fuktighetsinnholdet;

Cav er massen av næringsmediet med nødvendig fuktighetsinnhold;

Gav er massen av næringsmediet etter sterilisering;

D er mengden vann som må tilsettes for å oppnå et næringsmedium med nødvendig fuktighet.

Lab #2

Emne: Ekstraksjon av overflatedyrkede enzymer

Objektiv:Å kunne dyrke mikroorganismer ved overflatemetode på faste næringsmedier.

Utvinningsmetode for overflatekultur. Overflatedyrking av aerober utføres på et tett eller løst medium, så vel som i et tynt lag av et flytende medium i glass med bred bunn: petriskåler, Winogradsky-kolber, madrasser, kyvetter. Såede kar dyrkes ved konstant temperatur i termostater eller termostatrom (varmekamre). Mikroorganismer utvikles på overflaten av miljøet og bruker oksygen direkte fra luften. På flytende medier vokser obligate aerober i form av rikelige filmer. Fakultative aerober (anaerober) utvikles både i tykkelsen av det flytende mediet, og danner suspensjoner, flak, sedimenter og på overflaten i form av en tynn film. På tette medier vokser mikroorganismer i form av individuelle kolonier eller en sammenhengende plen. Overflatedyrking under laboratorieforhold er mye brukt for å oppnå berikelse og rene kulturer, deres lagring og studiet av morfologiske, kulturelle og biokjemiske egenskaper til mikroorganismer. I industrien brukes metoden for overflatekulturer på flytende medier for å oppnå sitronsyre, på bulkkulturer - for produksjon av enzympreparater.

I dette laboratoriearbeidet er det mest hensiktsmessig å bruke mikroskopiske sopp eller gjærlignende mikroorganismer, som Asp niger. Rh. Delemar osv.

Lab #3

Emne: Dyrking av mikroorganismer ved dyp metode.

Objektiv:Å kunne dyrke mikroorganismer på en dyp måte.

Dypdyrking. Dypdyrking av mikroorganismer kan være periodisk og kontinuerlig. I en batchprosess inokuleres hele volumet av næringsmediet med inokulum og dyrking utføres under optimale forhold i en viss tidsperiode frem til Riktig mengde biomasse eller målprodukt. For å sikre vekst av aerobe kulturer i de dype lagene av væsken, er oksygentilførsel nødvendig. Siden mikrobielle celler er i stand til å bruke bare oppløst oksygen, og dens løselighet er lav (4-7 mg / g)

Enkelt og tilgjengelig måte periodisk neddykket dyrking er dyrking av aerobe kulturer i suspendert tilstand i et flytende medium hellet i små volumer i reagensrør og kolber.

Kontinuerlig dypdyrking utføres i laboratoriefermentorer. Prosessen med kontinuerlig dyrking i fermenteringsbeholderen utføres i henhold til typen kjemostat eller turbidostat.

Formålet med dette arbeidet er å dyrke produsenter av ulike enzymer på flytende næringsmedier ved dypmetoden og å analysere de oppnådde kulturene av mikroorganismer for innholdet av visse enzymer i dem.

Som i det første laboratoriearbeidet er det nødvendig å bestemme inokulumet, som tilberedes ved å dyrke produsenten i flere passasjer på agarmedier i reagensrør eller madrasser.

I laboratoriearbeidet forbereder studenten 0,7 dm 3 av næringsmediet. Til å begynne med veies et beger på tekniske vekter, og deretter veies alle nødvendige komponenter av mediet inn i begerglasset. Væskekomponentene i mediet måles i volum.

Salter løses opp uten spesielle forholdsregler. Stivelse eller mel blandes i forholdet 1:10 med kaldt vann og brygget i et kokende vannbad.

Varianter av næringsmedier for dyrking av mikroorganismer-produsenter av enzymer.

Tabell 1

Komponenter av kulturmediet	Varianter av næringsmedier og innhold av komponenter, %
asp. Oryzae	0,3
Maisekstrakt	0,3	0,4	2,0
soyamel	0,5	4,0	2,0
Maismel	2,0	-	0,5
mate gjær	-	-	0,2
Kalsiumkarbonat	-	0,1	0,2
Aske. bitatae	1,0
Polyalkoholisk destillasjonsfiltrat	98,3	96,8	-
Maisstivelse	1,5	-	0,2
Teknisk magnesitt	0,2	0,2	1,5
rugmel	-	2,5	1,0
Maisekstrakt	0,2	0,5	1,0

For hvert alternativ tas fire kolber, 120 cm 3 av det tilberedte mediet helles i hver. Kolbene lukkes med bomullstopper, proppene er dekket med tykke papirkorker slik at de ikke blir fuktige under sterilisering. Samtidig med gyngekolbene plasseres en kolbe med 50 cm 3 medium for sterilisering for etterfølgende bestemmelse av pH.

Middels pH-definisjoner

Mediets pH bestemmes ved den elektrometriske metoden to ganger: før og etter sterilisering, hver gang tre repetisjoner av disse bestemmelsene utføres og deretter analyseres påliteligheten til disse resultatene.

Inokulering av næringsmediet

Etter at steriliseringen er fullført og autoklaven er åpnet, plasseres pipettene i 10-15 minutter. I en varm ovn for tørking av papir, blir kolber og andre retter stående i autoklaven i 10-15 minutter. Inokuleringen av næringsmediet utføres i en boks.

Lab #4

Bestemmelse av katalaseaktivitet

Katalase tilhører den første klassen av enzymer (oksidoreduktaser) og katalyserer nedbrytningen av hydrogenperoksid til vann og oksygen i henhold til ligningen:

Catalase spiller viktig rolle i den vitale aktiviteten til organismer, da det ødelegger hydrogenperoksid, som er giftig for celler og dannes under respirasjon.

Den kvantitative bestemmelsen av katalase er basert på å gjøre rede for hydrogenperoksid ved å titrere det med kaliumpermanganat. Reaksjonen går i henhold til ligningen:

2KMnO 4 + 5H 2 O 2 + 4H 2 SO 4 2KHSO → 4 + 2MnSO 4 + 8H 2 O + 5O 2

Mengden hydrogenperoksid ødelagt av enzymet bedømmes etter forskjellen mellom mengdene av 0,1 mol/DM 3 KMnO 4 løsning som ble brukt til titrering i kontroll- og arbeidseksperimentene.

Testmateriale: malt (spiret korn)

Reagenser: hydrogenperoksidløsning ω (H 2 O 2) = 1 %

svovelsyreløsning ω (H 2 SO 4) = 10 %

kaliumpermanganatløsning C (1/5 KMnO 4) = 0,1 mol / dm 3

5 g av testmaterialet infunderes ved romtemperatur i 30 minutter med 100 cm 3 vann, mens innholdet i kolben med jevne mellomrom omrøres. Etter infusjon filtreres væsken gjennom et tørt plissert filter og to porsjoner på 20 cm 3 hver (en eksperimentell og en kontroll) tas fra en klar løsning med en pipette og hver overføres til en separat konisk kolbe i 200 cm 3 . Kontrollen kokes i 3 minutter for å inaktivere enzymet.

20 cm 3 destillert vann, 4 cm 3 hydrogenperoksyd tilsettes til forsøks- og kontrollprøvene og får stå i 20 minutter ved romtemperatur for at enzymet skal virke. Etter 20 minutter tilsettes 5 cm 3 svovelsyre til prøvene, og det gjenværende (ikke dekomponerte) hydrogenperoksydet titreres med en løsning av kaliumpermanganat.

Katalaseaktivitet uttrykkes i mikromol hydrogenperoksid spaltet under påvirkning av enzymet i 1 min per 1 g av testmaterialet.

Katalaseaktivitet bestemmes av formelen:

hvor X er aktiviteten til katalase;

a - mengden av 0,1 mol/dm 3 løsning av KMnO 4 brukt for titrering av kontrollløsningen, cm 3;

b - mengden av 0,1 mol/DM 3 KMnO 4 løsning brukt for titrering av testløsningen, cm 3 ;

K - korreksjon til titeren;

100 er det totale volumet av ekstraktet, cm3;

50 er omregningsfaktoren for mikromol H 2 O 2;

20—volum enzymløsning, cm3;

20 – enzymatisk reaksjonstid, min;

P - prøve av testmaterialet tatt for analyse, g.

Laboratoriearbeid №5.

Kolorimetrisk metode for å bestemme aktiviteten til α- og β-amylase

Under virkningen av amylaser i planter oppstår hydrolysen av et høypolymert karbohydrat - stivelse - med dannelse av dekstriner og maltose. I planter finnes α- og β-amylaser.

Separat kvantitativ bestemmelse av aktiviteten til α- og β-amylaser er basert på deres forskjellige termiske stabilitet: β-amylase ødelegges ved oppvarming til 70 °C, mens α-amylase beholder sin aktivitet.

Metoder for å bestemme aktiviteten til amylase er basert enten på å ta hensyn til mengden sukker som dannes under enzymets virkning på stivelse, eller på å ta hensyn til mengden stivelse som ikke brytes ned av enzymet, som bestemmes fotometrisk etter behandling med en jodløsning.

Reagenser: acetatbuffer pH 5,5;

natriumkloridløsning ω (NаСl) = 1 %;

stivelsesløsning ω \u003d 10%, (2 g stivelse blandet i 20 cm 3 kaldt vann, helles i 80 cm 3 kokende vann, hvoretter de varmes opp i et kokende vannbad til løsningen blir klar);

løsning av saltsyre C (HCl) \u003d 1 mol / dm 3

saltsyreløsning C (HCl) \u003d 0,1 mol / dm 3

jodløsning ω = 0,3 % i 3 % kaliumjodidløsning.

En porsjon på 0,5 - 1 g mel eller frøplanter males i en morter med en liten mengde 1% NaCl-løsning og overføres til en 50 cm 3 konisk kolbe. Forholdet mellom prøven og NaCl-løsningen er 1:10 eller 1:20. Innholdet i kolben blandes godt og får stå ved romtemperatur i 30 minutter, risting av og til. Deretter filtrert gjennom et tett plissert filter. Når filtrering er vanskelig, kan filtrering og sentrifugering ved 4000-5000 rpm kombineres. En klar løsning brukes som et enzympreparat.

For å bestemme aktiviteten til α- og β-amylase tas 4 reagensrør (2 eksperimentelle og 2 kontroll) og tilsettes 3 cm 3 acetatbuffer og 3 cm 3 av en 2 % stivelsesløsning. Blandingen varmes opp i vannbad eller i termostat til 40°C. Deretter tilsettes 0,2-1,0 cm 3 av enzympreparatet til reagensglassene (avhengig av aktiviteten til amylasene i undersøkelsesobjektet), og samme mengde H 2 O tilsettes kontrollrørene. rør blandes og plasseres i en termostat ved 40 ° C i 30 eller 60 min. Etter inkubering helles 2 cm 3 1 N umiddelbart i hvert reagensrør. HCl-løsning for å stoppe virkningen av amylaser.

For å påvise uomsatt stivelse med enzymet, utføres en reaksjon med jod. Omtrent 30 cm 3 vann helles i målekolber per 50 cm 3, 1 cm 3 0,1 n. HCl, 5 dråper 0,3 % jodløsning og tilsett 0,5 cm 3 av blandingen fra hvert rør. Innholdet i kolbene blandes godt, bringes til merket med vann og kolorimetrisk på et fotoelektrisk kolorimeter med rødt lysfilter eller på et spektrofotometer ved 595 nm i en kyvette med en arbeidslengde på 1 cm.

For å bestemme aktiviteten til α-amylase, helles 5 cm 3 av filtratet (enzympreparat) i en 100 cm 3 konisk kolbe, tørt kalsiumacetat tilsettes på tuppen av en kniv og holdes i 15 minutter i en ultratermostat eller i et vannbad ved 70 ° C (temperatursvingninger tillates ikke mer enn 0,5 ° С). Innholdet i kolben avkjøles deretter raskt i en beholder med kaldt vann. Ved slik oppvarming blir β-amylase fullstendig inaktivert, og α-amylase beholder sin aktivitet. Videre reduseres bestemmelsen av a-amylaseaktivitet til prosedyren beskrevet ovenfor.

Virkningen av begge enzymer uttrykkes i milligram hydrolysert stivelse under eksperimentelle forhold (i 30 minutter eller 1 time) per 1 g mel (spirer). Aktiviteten til β-amylase bestemmes av forskjellen mellom den totale aktiviteten til α- og β-amylaser og aktiviteten til α-amylase. Amylaseaktivitet per 1 g mel i 1 time beregnes ved å bruke følgende formel:

hvor D er den optiske tettheten til kontrollløsningen;

D 1 - optisk tetthet av testløsningen;

a - mengden tilsatt stivelse (60 mg);

m - prøvevekt, g;

V er volumet av det opprinnelige enzymekstraktet, cm 3

V 1 - volum ekstrakt tatt for inkubering, cm 3 .

Lab #6

©2015-2019 nettsted
Alle rettigheter tilhører deres forfattere. Dette nettstedet krever ikke forfatterskap, men tilbyr gratis bruk.
Opprettelsesdato for siden: 2016-02-13

Lab #1

Emne: Katalytisk aktivitet av enzymer i levende celler

Mål: identifisere den katalytiske funksjonen til proteiner i levende celler, danne kunnskap om enzymers rolle i celler, konsolidere evnen til å arbeide med mikroskop, gjennomføre eksperimenter og forklare resultatene av arbeidet. Utstyr: rå og kokte poteter, elodea-blad (en annen plante), fersk 3 % hydrogenperoksidløsning, reagensglass, pinsett, sand, morter og stamper, notatbok, penn, blyant, linjal.

Framgang:

Forbered to reagensglass, og legg litt sand i det første, et stykke rå potet i det andre, et stykke kokt potet i det tredje. Slipp litt hydrogenperoksid i hvert av reagensglassene. Observer hva som vil skje i hvert av reagensglassene.

Mal et stykke rå potet med en liten mengde sand i en morter.

Overfør de knuste potetene sammen med sanden til et reagensrør og slipp litt hydrogenperoksid.

Sammenlign aktiviteten til knust og helt plantevev.

Lag en tabell som viser aktiviteten til hvert vev under forskjellige behandlinger. Forklar resultatene dine. Svar på spørsmålene:

Observasjoner

Hydrogenperoksid og rå poteter

Oksygen frigjøres, protein brytes ned til primær struktur og blir til skum

Hydrogenperoksid og kokte poteter

Ingen reaksjon

Svar på spørsmålene: I hvilke prøverør ble aktiviteten til katalaseenzymet manifestert? Forklar hvorfor.

Katalase er et enzym som katalyserer nedbrytningen av hydrogenperoksid til vann og molekylært oksygen: H2O2 + H2O2 = O2 + 2H2O. Biologisk rolle K. består i nedbrytning av hydrogenperoksid, som dannes i cellene som et resultat av virkningen av en rekke flavoproteinoksidaser (xantinoksidase, glukoseoksidase, monoaminoksidase, etc.), og tilveiebringelse av effektiv beskyttelse cellestrukturer fra ødeleggelse av hydrogenperoksid. Genetisk betinget insuffisiens av K. er en av årsakene til den såkalte acatalasia, en arvelig sykdom som er klinisk manifestert ved sårdannelse i nese- og munnslimhinnen, noen ganger uttalte atrofiske forandringer i alveolar septa, og tanntap. Aktivitet dukket opp i 1,3 prøverør, tk. de hadde rå mat som inneholdt proteiner. Og i resten av reagensrørene var det produkter med protein ødelagt under kokeprosessen og reaksjonen viste seg ikke. Derfor absorberes kroppen bedre av matvarer som inneholder protein.

Hvordan manifesteres enzymaktivitet i levende og dødt vev? Forklar det observerte fenomenet. I dødt vev er enzymaktivitet fraværende, pga. proteinet i dem ble ødelagt under matlagingen. Og i levende vev, når det samhandlet med hydrogenperoksid, ble oksygen frigjort, og proteinet, splittet til den primære strukturen, ble til skum.

Hvordan påvirker vevsmaling aktiviteten til enzymet i levende vev hos planter og dyr? Ved sliping av levende vev er reaksjonen raskere, fordi. kontaktområdet mellom protein og hydrogenperoksid øker. Hvordan vil du foreslå å måle nedbrytningshastigheten av hydrogenperoksid? v=kc(a)c(b) hvor v er hastigheten til en kjemisk reaksjon k er hastighetskonstanten c er endringen i konsentrasjon Tror du at alle levende organismer inneholder enzymet katalase, som bryter ned hydrogenperoksid?

Begrunn svaret. Siden dette er et enzym av oksidoreduktase-klassen, katalyserer det nedbrytningen av hydrogenperoksid, som er giftig for levende celler, til vann og oksygen. Finnes i lysosomer. Det kan konkluderes med at det finnes i alle celler i levende organismer. Forklar dine observasjoner. Formuler en konklusjon.

Konklusjon: protein finnes bare i levende mat, og i kokt mat blir proteinet ødelagt, så det oppstår ingen reaksjon med dem. Hvis du maler produktene, vil reaksjonen skje raskere.

Introduksjon

Denne håndboken er ment å gjøre studentene kjent med både klassiske metoder for å studere enzymer og moderne, svært sensitive metoder. analytiske metoder bruke enzymer som forskningsverktøy. Håndboken består av fem deler:

1. Metoder for å bestemme aktiviteten til enzymer.

2. Studie av kinetiske parametere for enzymatiske reaksjoner.

3. Metoder for isolering og rensing av enzymer.

4. Studie av subcellulær lokalisering av enzymer.

5. Bruk av enzymer som analytiske reagenser.

Alle deler av "Praksis" har selvstendige oppgaver Kravene til studenter forblir imidlertid de samme. Hvert foreslått arbeid er et lite pilotstudie. Når du utfører noen av dem, må studenten selvstendig forberede alle nødvendige løsninger, mestre de nødvendige forskningsmetodene, utføre et eksperiment og utarbeide resultatene i form av en rapport, som illustrerer dataene som er oppnådd med tabeller og grafer.

Nivå brukt metodiske teknikker oppfyller kravene moderne vitenskap. Om nødvendig gir beskrivelsen av arbeidet kort teoretisk informasjon. Alle verkene som er inkludert i "Workshop" ble gjentatte ganger fremført av studenter.

Arbeid 1. Titrimetrisk bestemmelse av katalaseaktivitet

Utstyr og reagenser: kokende vannbad; pipetter for 5, 10, 20 og 25 ml; målesylindre med nese for 10 og 25 ml; 100 ml målekolbe; 200 ml koniske kolber; porselen med morter og stamper; kaliumpermanganat (0,1 N); svovelsyre(ti %); natriumkarbonat; hydrogenperoksid (0,1 N); ferskt plantemateriale (poteter eller gulrøtter).

2 g rå poteter (eller gulrøtter) males i en morter, og tilsett gradvis 2-3 ml vann. For å redusere syrereaksjonen, tilsett natriumkarbonat på tuppen av spatelen til boblene stopper karbondioksid. Pulvermassen overføres kvantitativt til en målekolbe og justeres med vann til et volum på 100 ml. Blandingen får stå i 30 minutter, hvoretter den filtreres. Deretter bestemmes aktiviteten i henhold til skjemaet (2 eksperimentelle prøver og 2 kontrollprøver):

Erfaring og kontroll er titrert med 0,1 N. kaliumpermanganatløsning (til en blekrosa farge er stabil i ca. 1 min). Mengden kaliumpermanganatløsning som brukes til titrering av det gjenværende (etter enzymatisk dekomponering) hydrogenperoksid i testkolben og for titrering av alt hydrogenperoksid i kontrollkolben noteres. Forskjellen mellom den eksperimentelle titreringen og kontrolltitreringen brukes til å finne mengden permanganat som tilsvarer mengden hydrogenperoksid som spaltes av enzymet.

Beregningen utføres i henhold til reaksjonsligningen:

5H2O2 + 2KMnO4 + 3H2SO4 > 2MnSO4 + K2SO4 + 5O2 + 8H2O,

ifølge hvilken 1 ml av en 0,1 n løsning av kaliumpermanganat tilsvarer 1,7 mg hydrogenperoksid.

Beregningseksempel: katalaseekstrakt med et volum på 100 ml ble fremstilt fra 1,25 g gulrøtter: 15,5 ml ble brukt på titrering av forsøksprøven, 30,2 ml av en kontrollprøve ble brukt med en 0,1 N løsning av kaliumpermanganat. Mengden spaltet hydrogenperoksid i prøven tilsvarer (30,2 - 15,5) 14,7 ml 0,1 N. kaliumpermanganatløsning og derfor lik (14,7 1,7) 24,99 mg. Dette betyr at 1 g rå gulrøtter inneholder mengden katalase som kan spaltes = 99,96 mg hydrogenperoksid, og i 1 min - (99,96:30) 3,33 mg. Siden 1 µmol hydrogenperoksid er 0,034 mg, inneholder 1 g gulrøtter (3,33:0,034) 100 U katalase.

1. Beregn innholdet av katalase i testmaterialet.

2. Skriv det systematiske navnet på dette enzymet, dets kode i henhold til den systematiske katalogen og beskriv dets biologiske rolle.