Det ble imidlertid også utført en gassversjon av TLC. Finkornet, Al 2 O 3, og andre brukes som finkornede, Disse er dekket med glass, folie eller plater; for å fikse laget brukes, eller andre. Prom-Stu produserer ferdige plater med et allerede fast lag. Eluentene er vanligvis blandinger av org. løsninger, vannløsninger, to-t, kompleksdannende osv. inn-inn. Avhengig av valg av kromatografi systemer (sammensetning av mobile og stasjonære faser) i separasjon inn-inn hoved- prosesser kan spille en rolle. I praksis implementeres ofte flere samtidig. separasjonsmekanismer.

Avhengig av posisjonen til platen og retningen på eluentstrømmen, skilles stigende, synkende og horisontal TLC. I henhold til arbeidsteknikken skilles frontalanalyse (når den analyserte blandingen fungerer som den mobile fasen) og den vanlig brukte elueringsvarianten. Også brukt er "sirkulær" (når den analyserte løsningen og løsningsmidlet mates sekvensielt inn i midten av platen) og "anti-sirkulær" TLC (når den analyserte løsningen påføres rundt omkretsen og eluenten beveger seg fra periferien til senteret av platen), TLC under (når p -løsningsmiddel under føres gjennom et lag dekket med tett presset), samt TLC under betingelsene for en gradient av t-ry, sammensetning, etc. I den såkalte. todimensjonal TLC-kromatografi. prosessen utføres sekvensielt i to innbyrdes perpendikulære retninger med dekomp. elueringsmidler, noe som øker separasjonseffektiviteten. For samme formål brukes multippel eluering i én retning.

I elueringsvarianten påføres dråper (1-5 μl) av den analyserte løsningen på laget og kanten av platen dyppes ned i eluenten, som er plassert i bunnen av et hermetisk forseglet glasskammer. Eluenten beveger seg langs laget under påvirkning av kapillær- og gravitasjonskrefter; den analyserte blandingen beveger seg i samme retning. Som et resultat av gjentatt repetisjon og i samsvar med koeffisienten. fordelinger i den valgte er separert og ordnet på platen i separate soner.

Etter at prosessen er fullført, fjernes platen fra kammeret, tørkede og separerte soner finnes i sine egne. farging eller etter å ha sprayet dem med løsninger som danner fargede eller fluorescerende flekkermed komponentene i blandingen som skal separeres. Radioaktive stoffer påvises autoradiografisk (ved eksponering for en plate lagt på en plate). Også brukt. og aktive metoder for deteksjon. Det resulterende bildet av fordelingen av kromatografi. soner kalt kromatogram (se fig.).

Kromatogram oppnådd ved å separere en blanding av tre komponenter ved bruk av tynnsjiktsmetoden.

Plasseringen av kromatografien Sonene på kromatogrammet er karakterisert ved verdien av R f - forholdet mellom banen l i som krysses av sentrum av sonen til den i-te komponenten fra startlinjen til banen l som eluenten krysser: R f = l i /l; R f 1. Verdien av R f avhenger av koeffisienten. fordeling () og på forholdet mellom volumene til den mobile og stasjonære fasen.

Separasjonen i TLC påvirkes av en rekke faktorer - sammensetningen og egenskapene til eluenten, naturen, og, t-ra, dimensjonene og tykkelsen på laget, dimensjonene til kammeret. Derfor, for å oppnå reproduserbare resultater, er det nødvendig å nøye standardisere de eksperimentelle forholdene. Overholdelse av dette kravet lar deg sette Rf med relativ. standardavvik 0,03. Under standardforhold er Rf konstant for en gitt in-va og brukes for sistnevnte.

Antall komponent i kromatografien. sonen bestemmes direkte på laget av området til sonen (vanligvis varierer dens diameter fra 3 til 10 mm) eller intensiteten på fargen (). Bruk også automatisk skanningsinstrumenter som måler absorpsjon, transmisjon eller refleksjon av lys, eller kromatografi. soner. De separerte sonene kan skrapes av platen sammen med laget, komponenten kan ekstraheres til et løsningsmiddel og analyseres ved en passende metode (fluorescens, atomabsorpsjon, atomfluorescens, radiometrisk analyse, etc.). Feilen ved kvantitativ bestemmelse er vanligvis 5-10 %; grenser for deteksjon in-in i sonene -10 -3 -10 -2 μg (for fargede derivater) og 10 -10 -10 -9 μg (bruker).

Fordeler med TLC: enkelhet, kostnadseffektivitet, tilgjengelighet av utstyr, hurtighet (separasjonstid 10-100 min), høy produktivitet og separasjonseffektivitet, klarhet i separasjonsresultater, enkel deteksjon av kromatografi. soner.

TLC brukes for separasjon og analyse av både org. og inorg. in-in: nesten alle inorg.

Kromatografi i moderne kjemi

En av de viktige oppgavene til moderne kjemi er pålitelig og nøyaktig analyse organisk materiale, ofte like i struktur og egenskaper. Uten dette er det umulig å drive kjemisk, biokjemisk og medisinsk forskning, denne er i stor grad basert økologiske metoder analyse miljø, rettsmedisinsk undersøkelse, samt kjemisk industri, olje, gass, mat, medisinsk industri og mange andre sektorer av den nasjonale økonomien.

En av de mest sensitive metodene er kromatografisk analyse, først foreslått av den russiske forskeren M.S. Tsvet på begynnelsen av 1900-tallet. og ved slutten av århundret omgjort til et kraftig verktøy, uten som både syntetiske og kjemikere som arbeider i andre områder ikke lenger kan klare seg.

Fargeseparasjon ble utført i kolonnen vist i fig. 1. En blanding av stoffene A, B og C - naturlige pigmenter, opprinnelig plassert i sonen e,- separeres ved å tilsette passende løsningsmiddel D (elueringsmiddel) i separate soner.

Som alltid begynte det hele, ser det ut til, fra det enkleste en skolegutt kunne gjøre. Tidligere år skrev skolebarn, inkludert forfatteren av denne artikkelen, med blekk. Og hvis blotteren falt på blekkflekken, kunne man legge merke til at blekkløsningen var delt inn i flere "fronter" på den. Kromatografi er basert på fordelingen av ett av flere stoffer mellom to, som de sier, faser (for eksempel mellom fast og gass, mellom to væsker osv.), og en av fasene beveger seg konstant, det vil si at den er mobil.

Dette betyr at en slik fase, for eksempel en gass eller en væske, hele tiden beveger seg frem og bryter likevekten. Dessuten, jo bedre dette eller det stoffet sorberes (absorberes) eller oppløses i den stasjonære fasen, desto langsommere er bevegelseshastigheten, og omvendt, jo mindre forbindelsen sorberes, dvs. har lavere affinitet for den stasjonære fasen, desto større bevegelseshastigheten. Som et resultat, som vist i fig. 2, hvis vi først har en blanding av forbindelser, flytter de gradvis alle, presset av den mobile fasen, til "avslutningen" med forskjellige hastigheter og skiller seg til slutt.

Ris. 2. Grunnprinsippet for kromatografisk separasjon: NF er et lag av stasjonær fase som dekker den indre overflaten av kapillærrøret T, gjennom hvilken den mobile fasen (MP) strømmer. Komponent A 1 av den separerte blandingen har høy affinitet for den mobile fasen, og komponent A 2 - for den stasjonære fasen. A "1 og A" 2 er posisjonene til sonene til de samme komponentene etter en tidsperiode hvor den kromatografiske separasjonen skjedde i retningen angitt av pilen

I praksis injiseres en prøve av en blanding av stoffer, for eksempel med en sprøyte, inn i laget av den stasjonære fasen, og deretter beveger de ulike forbindelsene som utgjør blandingen, sammen med den mobile fasen (eluenten) seg med laget, drevet av denne fasen. Bevegelseshastigheten avhenger av mengden av interaksjon (affinitet) av komponentene i de stasjonære og mobile fasene, og som et resultat oppnås separasjon av komponentene.

Etter separering skal alle komponenter identifiseres og kvantifiseres. Dette er det generelle skjemaet for kromatografi.

Det skal bemerkes at denne moderne metoden gjør det mulig å bestemme innholdet av titalls og hundrevis av forskjellige forbindelser i en blanding i løpet av få minutter, selv i ubetydelige "spor" mengder på ~10–8%.

La oss vurdere mer detaljert den kromatografiske analysemetoden. Kromatografiske systemer kan deles inn i henhold til følgende prinsipper:

– aggregeringstilstand for de mobile og stasjonære fasene;
- geometriske egenskaper ved systemet;
– mekanismen for interaksjon mellom det separerte stoffet og fasene.

En gass eller væske brukes som den mobile fasen. Faste stoffer eller væsker brukes som stasjonære eller stasjonære faser.

I henhold til arrangementet av faser er kromatografiske systemer delt inn i to grupper: plan og kolonne.

Sistnevnte er på sin side delt inn i:

- pakket, fylt med granulært fast materiale (små kuler), enten som et skillemedium eller tjener som en bærer av en stasjonær væskefase;
- kapillær, hvis indre vegger er dekket med en film av en immobil væske eller et lag av en fast adsorbent (absorber).

Interaksjonen mellom stoffet som skal separeres og fasene i det kromatografiske systemet kan utføres enten på overflaten av fasen eller i bulk. I det første tilfellet kalles kromatografi adsorpsjon, i den andre fordeling.

Mekanismene for separasjon av molekyler i kromatografiske systemer er oftest redusert til følgende:

– den stasjonære fasen fysisk absorberer (sorberer) stoffene som skal separeres;
- den stasjonære fasen interagerer kjemisk med de separerte stoffene;
- den stasjonære fasen løser opp stoffene som skal separeres fra løsningen i et ublandbart løsningsmiddel;
- den stasjonære fasen har en porøs struktur, som hindrer diffusjon av molekyler av stoffene som skal separeres i denne fasen.

Kromatografi, som begynte med selvlagde enheter som en papirstrimmel dyppet i et løsemiddel, er nå representert av de mest komplekse instrumentelle systemene basert på moderne presisjons- eller presisjonsprinsipper og utstyrt med dataprogramvare. Det er nok å si at et av de beste datafirmaene, Hewlett-Packard, produserer moderne kromatografer samtidig.

Opplegget for kromatografiprosessen er i hovedsak veldig enkelt og er vist i fig. 3. Videre, omtrent i denne sekvensen, vil prinsippet for drift av kromatografen bli vurdert.

Hovedtyper av kromatografi

Hovedtypene av kromatografi inkluderer adsorpsjon, ionebytting, væske, papir, tynt lag, gelfiltrering og affinitetskromatografi.

Adsorpsjonskromatografi. I dette tilfellet utføres separasjonen av stoffer på grunn av den selektive (selektive) adsorpsjonen av stoffer på den stasjonære fasen. Slik selektiv adsorpsjon skyldes affiniteten til en eller annen forbindelse for den faste adsorbenten (stasjonær fase), og dette bestemmes igjen av de polare interaksjonene mellom molekylene deres. Derfor brukes kromatografi av denne typen ofte i analysen av forbindelser hvis egenskaper bestemmes av antall og type polare grupper. Adsorpsjonskromatografi inkluderer ionebytter-, væske-, papir-, tynnsjikts- og gass-adsorpsjonskromatografi. Gassadsorpsjonskromatografi er beskrevet mer detaljert i avsnittet Eluentanalyse.

Ionebyttekromatografi. brukes som stasjonær fase. ionebytterharpikser(Fig. 4) både i kolonner og som et tynt lag på en plate eller papir. Separasjon utføres vanligvis i vandige medier, så denne metoden brukes hovedsakelig i uorganisk kjemi, selv om blandede løsningsmidler også brukes. Drivkraften for separasjon i dette tilfellet er den forskjellige affiniteten til de separerte ionene i løsningen til ionebyttersentre med motsatt polaritet i den stasjonære fasen.

væskekromatografi. I dette tilfellet er den stasjonære fasen en væske. Det vanligste tilfellet er adsorpsjonsversjonen av væskekolonnekromatografi. Et eksempel på separasjon av naturlige pigmenter er vist i fig. 5.

Ris. 5. Kromatografisk separasjon av naturlige pigmenter (flavoner og isoflavoner)

Papirkromatografi. Strimler eller papirark brukes som stasjonær fase (fig. 6). Separasjon skjer i henhold til adsorpsjonsmekanismen, og noen ganger utføres den i to vinkelrette retninger.

Tynnsjiktskromatografi er ethvert system der den stasjonære fasen er et tynt lag, spesielt et lag av aluminiumoksyd (2 mm tykt) i form av en pasta avsatt på en glassplate. Et eksempel på et slikt system og separasjonsresultatene er vist i fig. 7.

Gelfiltrering, eller molekylsikt, kromatografi. Prinsippet om separasjon i slike systemer er noe annerledes enn i tidligere tilfeller. Den stasjonære fasen er materialer, vanligvis geler, med strengt kontrollert porøsitet, som et resultat av at noen komponenter i blandingen, i samsvar med størrelsen og formen til molekylene, kan trenge inn mellom gelpartiklene, mens andre ikke kan. Oftest brukes denne typen kromatografi for å skille makromolekylære forbindelser. En av bruksområdene for denne metoden er bestemmelse av molekylmassene til stoffene som skal separeres, som ofte er nødvendige for kjemiske studier (fig. 8).

affinitetskromatografi. Denne typen kromatografi er basert på interaksjonen mellom et stoff, på den ene siden, i stand til å reagere med den isolerte forbindelsen, og på den annen side assosiert med en fast bærer av den stasjonære fasen. Et slikt stoff har en affinitet for den isolerte forbindelsen og kalles en affinitetsligand.

Oftest brukes denne metoden i biokjemisk analyse. For eksempel, når biologiske antigenobjekter som inneholder proteiner føres gjennom cellulose aktivert med cyanogenbromid, beholdes de spesifikt, som vist i skjema 1.

I henhold til en annen metode, for å feste proteiner til hydroksylgruppen til cellulose, behandles sistnevnte først med 2-amino-4,6-diklor- Sim-triazin, og deretter reagerer produktet av deres interaksjon med aminogruppen til proteinet i henhold til skjema 2:

Selvfølgelig er antallet kromatografimetoder ikke begrenset til de som er oppført ovenfor. Kromatografi kombineres ofte med andre fysisk-kjemiske metoder, for eksempel massespektrometri, men denne artikkelen tar sikte på å gjøre leseren kjent med de generelle prinsippene for kromatografi. Derfor vil vi videre vurdere behandlingen av kromatografiresultater.

Metoder for utvikling av kromatogram

Manifestasjonen er prosessen med overføring av separerte stoffer av den mobile fasen. Utvikling kan gjøres på tre hovedmåter: frontalanalyse, forskyvning og eluering. Eluering er den mest brukte.

Frontal analyse. Dette er det enkleste tilfellet, siden prøven her fungerer som den mobile fasen. Det legges kontinuerlig til systemet, så store prøvevolum er nødvendig. Resultatene er vist i fig. 9.

Dannelsen av flere soner skyldes de forskjellige affinitetene til forskjellige komponenter for den stasjonære fasen. Skjærkanten kalles fronten, derav navnet. Den første sonen inneholder kun det minst beholdte stoffet A, som beveger seg raskest. Den andre sonen inneholder substans A og B. Den tredje sonen er en blanding av substansene A, B og C. I frontalanalysen oppnås kun komponent A i flytende form.

forskyvningsanalyse. I dette tilfellet har den mobile fasen større affinitet for den stasjonære fasen enn stoffet som skal separeres. En liten prøve introduseres i den stasjonære fasen. Men på grunn av den høye affiniteten forskyver og skyver den mobile fasen alle komponentene. Den fortrenger den sterkest sorberte komponenten C, som igjen fortrenger stoffet B, som fortrenger den minst sorberte komponenten A. I motsetning til frontalanalyse kan denne metoden brukes til å oppnå alle hovedkomponentene i individuell (flytende) form .

elueringsanalyse. Den mobile fasen for å flytte det oppløste stoffet føres gjennom det kromatografiske systemet. Separasjonen skjer på grunn av den forskjellige affiniteten til blandingskomponentene til den stasjonære fasen og følgelig på grunn av forskjellige hastigheter på deres bevegelse. En prøve med lite volum introduseres i det kromatografiske systemet. Som et resultat vil det gradvis dannes soner med komponenter separate seksjoner separert med rent elueringsmiddel. På grunn av den høye separasjonseffektiviteten har metoden blitt den mest brukte og har i stor grad erstattet andre separasjonsalternativer. Derfor vil vi videre vurdere teorien og maskinvaredesignen til denne metoden.

Litt teori. Det er ofte praktisk å betrakte kromatografiske prosesser som en serie ekstraksjonsprosesser; i dette tilfellet kan stoffer med svært like egenskaper separeres, siden hundrevis og til og med tusenvis av ekstraksjonssykluser skjer raskt og samtidig under kromatografiske prosesser.

For å evaluere effektiviteten til kromatografiske prosesser, basert på det teoretiske konseptet destillasjon (analogt med separasjonen av olje i destillasjonskolonner, hvor den teoretiske platen tilsvarer den delen av destillasjonskolonnen der damp og væske er i likevekt), konseptet er introdusert "høyde tilsvarende teoretisk plate"(VETT). Den kromatografiske kolonnen betraktes dermed som et sett med hypotetiske lag (plater). HETP forstås vanligvis som en slik lagtykkelse som er nødvendig for at blandingen som kommer fra forrige lag skal komme i likevekt med den gjennomsnittlige konsentrasjonen av stoffet i den mobile fasen av dette laget. Det kan beskrives med følgende formel:

HETT = L/N,

Hvor L- kolonnelengde, N er antall teoretiske plater.

HETP er et sammendrag av separasjon av stoffer. Det er imidlertid viktig å skille komponentene i blandingen, men ikke tilstrekkelig. Det er nødvendig å identifisere hver komponent og bestemme mengden i prøven. Dette gjøres vanligvis ved å behandle kromatogrammer - avhengigheten av signalintensiteten, proporsjonal med konsentrasjonen av stoffet, på separasjonstiden. Noen eksempler på kromatogrammer er vist i fig. 10, 11.

Tiden fra det øyeblikket prøven injiseres i kolonnen til det øyeblikket den maksimale toppen er registrert kalles oppbevaringstid (tR). Under optimale forhold avhenger det ikke av mengden injisert prøve, og, tatt i betraktning de geometriske parametrene til kolonnen, bestemmes av strukturen til en bestemt forbindelse, det vil si at det er en kvalitativ karakteristikk av komponentene. Det kvantitative innholdet i komponenten er preget av størrelsen på toppen, mer presist av området. Telle toppareal gjøres vanligvis automatisk med et integratorinstrument som registrerer både retensjonstid og toppareal. Moderne utstyr lar deg umiddelbart få en datamaskinutskrift som indikerer innholdet i alle komponentene i blandingen som skal separeres.

Arbeidet til kromatografen. Installasjonsskjemaet til den enkleste gasskromatografen er vist i fig. 12. Den består av en gassflaske som inneholder en mobil inert fase (bæregass), oftest helium, nitrogen, argon osv. Ved hjelp av en redusering som reduserer gasstrykket til ønsket nivå, kommer bæregassen inn i kolonnen, som er et rør fylt med sorbent eller annet kromatografisk materiale som spiller rollen som en stasjonær fase.

Ris. 12. Driftsskjema for en gasskromatograf:
1 - ballong høytrykk med bæregass; 2 - strømningsstabilisator; 3 og 3" - manometre; 4 - kromatografisk kolonne; 5 - prøveinjeksjonsanordning; 6 - termostat; 7 - detektor; 8 - opptaker; 9 - strømningsmåler

Den kromatografiske kolonnen er "hjertet" til kromatografen, siden det er i den blandingene separeres. Søyler er oftest laget av glass; det er stål, teflon og også kapillærsøyler. En prøveinjeksjonsanordning er installert nær gassinnløpet til kolonnen. Oftest injiseres en prøve ved hjelp av en sprøyte, som gjennomborer gummimembranen. Den analyserte blandingen separeres i kolonnen og går inn i detektoren - en enhet som konverterer separasjonsresultatene til en form som er praktisk for registrering.

En av de mest brukte detektorene er et katharometer, hvis prinsipp er basert på å måle varmekapasiteten til forskjellige kropper.

På fig. 13 viser et diagram av et katarometer. En metallspiral (motstandstråd) er plassert i et sylindrisk hulrom, som varmes opp som et resultat av at en likestrøm passerer gjennom den. Når en bæregass strømmer gjennom den med konstant hastighet, forblir temperaturen på spolen konstant. Imidlertid, hvis sammensetningen av gassen endres med utseendet til det eluerte stoffet, endres temperaturen på spolen, noe som registreres av enheten.

En annen vanlig detektor er flammeioniseringsdetektoren, hvis skjema er vist i fig. 14. Det er mye mer følsomt enn et katarometer, men krever tilførsel av ikke bare bæregass, men også hydrogen. Bærergassen som forlater kolonnen, inneholder eluenten, blandes med hydrogen og passerer inn i dysen til detektorbrenneren. Flammen ioniserer elueringsmolekylene, som et resultat av at den elektriske motstanden mellom elektrodene avtar og strømmen øker.

I væskekromatografi brukes spektrofotometriske detektorer (i de synlige, UV- og IR-områdene), samt refraktometriske detektorer basert på måling av brytningsindeksene til løsninger.

De er inne generelt grunnleggende om kromatografisk analyse. Artikkelen inneholder selvfølgelig kun generelle prinsipper kromatografi, og ofte er de ganske enkelt merket. Faktisk er "kjøkkenet" til denne metoden ganske stort og komplekst. hovedmålet denne artikkelen, ifølge forfatteren, for å trekke oppmerksomheten til unge lesere til denne kraftige metoden.

De som ønsker å lære mer om dette området kan bruke litteraturen nedenfor.

Litteratur

Zhukhovitsky A.A., Turkeltaub N.M. Gasskromatografi. M.: Gostoptekhizdat, 1962, 240 s.;
Sakodynsky K.I., Kiselev A.V., Iogansen A.V. og så videre. Fysisk-kjemisk anvendelse gasskromatografi. M.: Kjemi, 1973,
254 s.;
Væskekolonnekromatografi. I 3 bind Red. Z. Deyla, K. Maceka, J. Janaka. Moskva: Mir, 1972;
Berezkin V.G., Alishoev V.R., Nemirovskaya I.B.. Gasskromatografi i polymerkjemi. M.: Nauka, 1972, 287 s.;
Morozov A.A. Kromatografi i uorganisk analyse. M.: Høyere. skole, 1972, 233 s.;
Berezkin V.G., Bochkov A.S.. Kvantitativ tynnsjiktskromatografi. M.: Nauka, 1980, 183 s.;
Laboratorieveiledning for kromatografiske og relaterte metoder. I 2 bind Red. O. Mikesh. Moskva: Mir, 1982, bind 1–2, 783 s.;
Kromatografisk analyse av miljøet. Ed. R. Kiste. M.: Mir, 1979, 606 s.;
Kirchner Yu. Tynnsjiktskromatografi. I 2 vol. M.: Mir, 1981, vol. 1, 615 s., bd. 2, 523 s.;
Ekstraksjonskromatografi. Ed. T.Brown, G.Gersini. M.: Mir, 1978, 627 s.

V.V. Safonov,
professor i Moskva
statlig tekstil
akademi. A.N. Kosygina

MZRF

FESMU

Institutt for generell, fysikalsk og kolloidkjemi

Essay

Tynnsjiktskromatografi. Søknad i apotek

Fullført av: elev av gruppe 201-F

Danilov D.I.

Sjekket av: Nemov V.A.

Khabarovsk, 2005

PLAN:

Introduksjon

Fysiske og kjemiske baser for TLC

Partisjonskromatografi på papir

Grunnleggende om tynnsjiktskromatografi

• sorbenter
• løsemidler
• forberedelse av tallerkener
• test løsningsapplikasjonsteknikk

Kromatografi

Tørking av plater.

Identifikasjon av separerte stoffer

Anvendelse av TLC-metoden i farmasi

• Kvantitativ bestemmelse av triterpen-saponiner ved HPTLC ved bruk av skanningsdensitometri
• Studiet av lipid- og flavonoidsammensetningen av prøver av noen arter av slekten Chin (Lathyrus.)

Konklusjon

Litteratur

Introduksjon

Tynnsjiktskromatografi (TLC, TLC) er en av de mest brukte metodene for kromatografisk analyse, men den minst populære.
Til tross for de betydelige manglene som eksisterte inntil nylig, er det mye brukt til kvalitativ analyse blandinger, hovedsakelig på grunn av billigheten og hastigheten på å oppnå resultater. Tynnsjiktskromatografi (TLC) ble opprinnelig utviklet for separasjon av lipider. Selv om papirkromatografi er raskere enn kolonnekromatografi, har det den ulempen at papir kun kan lages av cellulosebaserte materialer, noe som gjør det uegnet for å separere ikke-polare stoffer. Tynnsjiktskromatografi beholder alle fordelene ved papirkromatografi, men tillater bruk av ethvert materiale som kan finmales og deretter oppnås et homogent lag. Det kan bli uorganiske stoffer, slik som silikagel, alumina, diatoméjord og magnesiumsilikat, samt organiske stoffer, spesielt cellulose, polyamider og polyetylenpulver.

Fysiske og kjemiske baser for tynnsjiktskromatografi.

Grunnlaget for tynnsjiktskromatografi er adsorpsjonsmetoden, selv om man også finner partisjonskromatografi.
Adsorpsjonsmetoden er basert på forskjellen i graden av sorpsjon-desorpsjon av de separerte komponentene på den stasjonære fasen. Adsorpsjon utføres på grunn av van der Waals-krefter, som er grunnlaget for fysisk adsorpsjon, polymolekylær (dannelse av flere lag adsorbat på overflaten av adsorbenten) og kjemisorpsjon (kjemisk interaksjon av adsorbenten og adsorbatet).
For effektive sorpsjon-desorpsjonsprosesser er det nødvendig stort torg, som stiller visse krav til adsorbenten. På stor overflate faseseparasjon er en rask etablering av likevekt mellom fasene til komponentene i blandingen og effektiv separasjon.
En annen type tynnsjiktskromatografi som brukes i tynnsjiktskromatografi er skillevæskekromatografi.
Ved partisjonskromatografi er begge fasene – mobile og stasjonære – væsker som ikke blander seg med hverandre. Separasjonen av stoffer er basert på forskjellen i deres fordelingskoeffisienter mellom disse fasene.
For første gang erklærte metoden for tynnsjiktskromatografi seg som "Papirtynnlagskromatografi", som var basert på distribusjonsmetoden for separering av komponenter.

Partisjonskromatografi på papir.

På grunn av det faktum at kromatografipapiret som brukes i denne metoden (spesielle kvaliteter av filterpapir) inneholder vann (20-22%) i porene, brukes organiske løsemidler som den andre fasen.
Bruken av kromatografi på papir har en rekke betydelige ulemper: separasjonsprosessen avhenger av sammensetningen og egenskapene til papiret, endringen i vanninnholdet i porene på papiret med endringer i lagringsforholdene, en svært lav kromatografihastighet ( opptil flere dager), og lav reproduserbarhet av resultatene. Disse manglene påvirker alvorlig spredningen av papirkromatografi som en kromatografisk metode.
Derfor kan utseendet av kromatografi i et tynt lag av en sorbent, dvs. tynnsjiktskromatografi, betraktes som naturlig.

Grunnleggende om tynnsjiktskromatografi.

I TLC-metoden skjer kromatografien av stoffer i et tynt lag av en sorbent avsatt på et fast flatt substrat. Separasjon i denne metoden skjer hovedsakelig på grunnlag av sorpsjon-desorpsjon.
Bruken av forskjellige sorbenter gjorde det mulig å utvide og forbedre denne metoden betydelig.
I begynnelsen av fremkomsten av metoden måtte platene lages uavhengig. Men i dag brukes hovedsakelig prefabrikkerte wafere, som har et ganske bredt spekter både i størrelse og bærere, og i underlag.
En moderne kromatografisk plate er en base laget av glass, aluminium eller en polymer (for eksempel polytereftalat). På grunn av det faktum at glassbasen blir mindre populær (den går ofte i stykker, det er umulig å dele platen i flere deler uten å skade sorbentlaget, tungt i vekt), er plater basert på aluminiumsfolie eller polymerer mest brukt.
For å fikse sorbenten brukes gips, stivelse, silikasol etc. som holder sorbentkornene på underlaget. Lagtykkelsen kan være forskjellig (100 mikron eller mer), men det viktigste kriteriet er at laget må være jevnt i tykkelse hvor som helst på den kromatografiske platen.

Sorbenter

Den vanligste sorbenten er silikagel.
Silikagel er en hydratisert kiselsyre dannet ved virkningen av mineralsyrer på natriumsilikat og tørking av den resulterende solen. Etter maling av solen brukes en brøkdel av en viss kornstørrelse (angitt på platen, vanligvis 5-20 mikron).
Silikagel er en polar sorbent, der -OH-grupper fungerer som aktive sentre. Den absorberer lett vann på overflaten og danner hydrogenbindinger.
Alumina. Alumina er en svakt basisk adsorbent og brukes hovedsakelig til å skille svakt basiske og nøytrale forbindelser. Ulempen med plater på aluminiumoksid er obligatorisk aktivering av overflaten før bruk i tørkeskap når høy temperatur(100-150 0 C) og lav adsorpsjonskapasitet til laget sammenlignet med silikagel.
Diatoméjord er en adsorbent hentet fra naturlige mineraler: diatoméjord. Absorbenten har hydrofile egenskaper, men en lavere adsorpsjonskapasitet på laget sammenlignet med silikagel.
Magnesiumsilikat er mindre polart enn silikagel og brukes vanligvis når mer polare adsorbenter ikke gir effektiv separasjon.
Cellulose - tynnsjikts cellulosebelagte plater er svært effektive for å separere komplekse organiske molekyler. Adsorbenten er hovedsakelig cellulosekuler med en diameter på opptil 50 mikron, festet på bæreren med stivelse. Men som i papirkromatografi, er stigningen av løsningsmiddelfronten veldig langsom.
I ionebytterkromatografiske plater brukes ionebytterharpikser som inneholder kvaternære ammonium- eller aktive sulfogrupper involvert i ionebytting som adsorbent. Tynnsjiktskromatografi med denne typen plater utføres med mobile faser som inneholder sterke syrer eller alkalier. Disse platene er effektive for å skille makromolekylære og amfotere forbindelser.

De ovennevnte sorbentene er de vanligste, men i tillegg til disse er det mange stoffer som brukes som sorbenter. Disse er talkum, kalsiumsulfat, stivelse, etc.
Samtidig kan selv de allerede nevnte sorbentene modifiseres for å gi dem nye sorpsjonsegenskaper (impregnering av sorbenter med reagenser, for eksempel AgNO 3 , dannelse av plater med reversert fase). Det er denne variasjonen av mulige faser til minimale kostnader som gjør det mulig å bruke TLC for kromatografi av et stort antall stoffer.

Løsemidler

I tynnsjiktskromatografi brukes enten rene stoffer (etylacetat, benzen, etc.) eller blandinger av stoffer (systemer) i et visst forhold som mobil fase.
Valget av mobilfasen (systemet) utføres i henhold til følgende regler:

· Velg et system der komponentene som skal separeres har lav løselighet (hvis løseligheten til stoffet er høy, vil stoffene bevege seg med fronten, hvis løseligheten er lav vil de forbli i starten). Ved partisjonskromatografi eller ved bruk av reverserte faser må løseligheten av stoffene være høyere i mobilfasen enn i stasjonær fase.

· Sammensetningen av systemet må være konstant og lett reproduserbar.

· Løsemidlet eller systemkomponentene må ikke være giftige eller mangelfulle.

· Systemet må fullstendig separere stoffer med lignende struktur, og forskjellene i Rf må være minst 0,05.

· Systemet må ikke forårsake at kjemiske endringer i komponentene skilles.

I det valgte systemet må analyttene ha ulike betydninger Rf og fordelt over hele lengden av kromatogrammet. Det er ønskelig at Rf-verdiene ligger i området 0,05-0,85.

· Ved valg av system må det også tas hensyn til arten av stoffene som skal separeres. Så når du kromatograferer stoffer med grunnleggende egenskaper, bør systemet ikke ha sure egenskaper og omvendt.

Forberedelse av tallerkener

Ved bruk av kjøpte plater må de først klargjøres for kromatografi. Dette skyldes det faktum at under lagring absorberer plateadsorbenter ikke bare fuktighet, men også andre stoffer i luften. Ved bruk av uforberedte plater under kromatografi, vises en "smuss"-front, som kan forstyrre bestemmelsen av stoffer med store Rf-verdier, og noen stoffer, som vann, kan endre sammensetningen av den mobile fasen, og dermed endre de resulterende Rf-verdiene .
Forberedelse av platene består i å dispergere platene med et rent løsningsmiddel til hele høyden av platen (metanol, benzen, dietyleter), etterfulgt av tørking av platen i en ovn ved en temperatur på 110-120 0C i 0,5-1 time. På denne måten kan flere plater tilberedes på en gang, og ved lagring på et tørt, forseglet sted beholder de egenskapene i flere måneder.

Teknikk for påføring av testløsninger.

Som det viser seg, er påføringen av teststoffet ikke en så komplisert operasjon, men samtidig påvirker det resultatene av kromatografi i stor grad.
Ofte testes enten flytende analytter eller løsninger av faste stoffer, uten noen forutgående prøvepreparering.
Derfor er det alltid nødvendig å huske en rekke punkter som alvorlig påvirker resultatene av separasjon.
Det viktigste er konsentrasjonen av påførte stoffer. I TLC er det vanlig å bruke konsentrasjoner av løsninger på ca. 1%. Men på den annen side lar følsomheten til metoden deg bestemme stoffer med mye lavere konsentrasjoner.
Hvis den totale konsentrasjonen av komponentene i teststoffet er ukjent, eller konsentrasjonen er kjent, men denne typen stoff er ennå ikke kromatografert, er det nødvendig å bestemme hvilken mengde av testløsningen som er tilstrekkelig for høykvalitets kromatografi. Det er flere metoder for å bestemme dette.
Først må du påføre flere flekker med kromatografiske løsninger, like store, men med forskjellige mengder (for eksempel 1, 2, 5 µl), og etter kromatografi studere formen og størrelsen på de separerte flekkene.
Så, med en riktig valgt konsentrasjon, er formen på de separerte stoffene den samme som formen påført startlinjen. Hvis de separerte flekkene er større enn flekken ved starten, er den påførte konsentrasjonen for høy. Utseendet til "haler", den uregelmessige formen til separerte flekker på platen, kan også indikere en høy konsentrasjon, men kan være forårsaket av et feil valgt kromatografisk system, eller av kjemisk interaksjon av de separerte komponentene.
Ved å velge mengden av det avsatte stoffet og systemet av løsemidler, er det mulig å oppnå fullstendig separasjon på en plate med opptil ti komponenter i stoffene som studeres. Det er praktisk å bruke prøver på et spesielt bord med sjablonger og oppvarming. Spotting utføres på "startlinjen" 1-2 cm fra underkanten av platen. Dette er nødvendig slik at når platen senkes ned i systemet, oppløses ikke prøvene i den, og alt avsatt stoff blir utsatt for kromatografi.
Påføring av løsninger utføres enten med en mikrosprøyte eller graderte kapillærer. Størrelsen på den påførte flekken bør ikke overstige 4 mm. Dette skyldes det faktum at med en større flekkstørrelse oppstår en formendring under påvirkning av fysiske krefter, og grensene til de separerte komponentene kan overlappe hverandre.
Påføringen av teststoffene på platene bør ikke ledsages av ødeleggelse av sorbenten (som har en ganske sterk effekt på separasjonskvaliteten), så dråpen bør påføres ved å berøre nålen eller kapillæren mot sorbentlaget, og ikke ved å trykke. Størrelsen på det resulterende punktet påvirkes ikke bare av mengden påført løsning, men også av polariteten til løsningsmidlet og dets kokepunkt. Så når det samme stoffet brukes i forskjellige løsningsmidler, vil den resulterende flekken der metanol ble brukt som løsningsmiddel være større enn flekken fra kloroformløsningen. på den annen side, når substratet varmes opp, vil fordampningen av løsemidler være mer intens og flekkstørrelsen vil også avta.
Selvfølgelig er det lettere å bruke en hårføner når du bruker tørre flekker, men bare hvis det er full tillit til at de påførte stoffene ikke vil oksidere under påvirkning av varm luft.
Avstanden mellom de påførte flekkene skal være ca. 2 cm.
Noen ganger, under kromatografi på plater, observeres en kanteffekt, som et resultat av at flekkene ikke er plassert på samme linje, men ser ut som en hestesko, eller diagonalt. For å eliminere denne effekten kan hvert punkt "forsynes" med sitt eget spor, og skille den påførte prøven fra de andre ved å fjerne sorbentlinjen. Dette gjøres best under linjalen med en skarp gjenstand (som en skalpell), men vær forsiktig så du ikke fjerner for mye sorbent.
Etter å ha påført teststoffene på platen, er det nødvendig å oppnå fullstendig fjerning av løsningsmidler, siden selv en liten mengde løsningsmiddel i teststoffet kan påvirke separasjonen og til og med endre sammensetningen av det kromatografiske systemet.
Fjerning av løsemidler utføres vanligvis ved naturlig tørking av platene i 5-10 minutter, enten ved oppvarming med hårføner eller i ovn.

Kromatografi

Tynnsjiktskromatografi har flere metoder, hovedsakelig knyttet til typen bevegelse av løsemidler.

Tynnsjiktskromatografi oppover

Tynnlagskromatografi nedover

Horisontal tynnsjiktskromatografi

· Radiell tynnsjiktskromatografi.

Oppstrøms tynnsjiktskromatografi

Denne typen kromatografi er den vanligste og er basert på at fronten av det kromatografiske systemet stiger langs platen under påvirkning av kapillærkrefter, dvs. fronten av det kromatografiske systemet beveger seg fra bunn til topp. For denne metoden brukes det enkleste utstyret, siden enhver beholder med flat bunn og et tettsittende lokk, som en kromatografisk plate fritt kan plasseres i, kan brukes som et kromatografisk kammer.
Metoden for stigende tynnsjiktskromatografi har en rekke ulemper. For eksempel oppstår hastigheten på stigningen av fronten langs platen ujevnt, dvs. i den nedre delen er den høyest, og etter hvert som fronten stiger avtar den. Dette skyldes det faktum at i den øvre delen av kammeret er metningen med løsemiddeldamp mindre, derfor fordamper løsningsmidlet fra den kromatografiske platen mer intensivt, derfor reduseres konsentrasjonen og bevegelseshastigheten reduseres. For å eliminere denne mangelen er strimler av filterpapir festet langs veggene i det kromatografiske kammeret, langs hvilke det stigende kromatografiske systemet metter kammeret med damp gjennom hele volumet.
Noen kromatografiske kammer har en inndeling i to brett nederst. Denne forbedringen tillater ikke bare å redusere forbruket av det kromatografiske systemet (mindre volum kreves for å oppnå den nødvendige høyden på det kromatografiske systemet), men også å bruke en ekstra kyvette for løsningsmidlet, noe som øker metningsdamptrykket i kammeret.
Behovet for å overvåke løsningsmiddelfronten kan også betraktes som en ulempe, siden løsningsmiddelfrontlinjen kan "løpe bort" til den øvre kanten. I dette tilfellet er det ikke lenger mulig å bestemme den faktiske verdien av Rf.

Tynnlagskromatografi nedover

Denne kromatografimetoden er basert på det faktum at fronten av det kromatografiske systemet går ned over platen hovedsakelig under påvirkning av tyngdekraften, dvs. den mobile fasefronten beveger seg fra topp til bunn.
For denne metoden er en kyvette med et kromatografisk system festet til den øvre delen av det kromatografiske kammeret, hvorfra det ved hjelp av en veke kommer et løsningsmiddel inn i den kromatografiske platen, som renner ned og prøven kromatograferes.
Ulempene med denne metoden inkluderer kompleksiteten til utstyret. Denne metoden brukes hovedsakelig i papirkromatografi.

Horisontal tynnsjiktskromatografi

Denne metoden er den mest komplekse innen maskinvaredesign, men den mest praktiske. Så i det kromatografiske kammeret plasseres platen horisontalt og systemet mates til den ene kanten av platen ved hjelp av en veke. Løsemiddelfronten beveger seg i motsatt retning.
Det er et annet triks for å forenkle kameraet så mye som mulig. For å gjøre dette bøyes en aluminiumsbasert kromatografisk plate lett og plasseres i kammeret. I dette tilfellet vil systemet handle fra to sider samtidig. Kun plater med aluminium bak er egnet til dette formålet, siden plast- og glassbunnene er "ufleksible", dvs. beholder ikke formen.
Fordelene med denne metoden inkluderer det faktum at i en horisontal celle skjer dampmetningen av systemet mye raskere, fronthastigheten er konstant. Og når du kromatograferer fra begge sider, "løper ikke fronten bort"

Radiell tynnsjiktskromatografi.

Radiell tynnsjiktskromatografi består i at teststoffet påføres midten av platen og systemet mates dit, som beveger seg fra midten til kanten av platen.

Tørking av plater.

Etter prosessen med å separere teststoffene, tørkes platene. Dette er også en viktig prosess, siden hvis det til og med er spor av løsemiddel på platen, er det mulig å oppnå feil kromatografiske resultater.
Hvis det kromatografiske systemet bare inkluderte lavtkokende komponenter, er naturlig tørking i 3-5 minutter tilstrekkelig. Hvis systemet inkluderer høytkokende væsker (alkoholer, vann, organiske syrer osv.), bør platene tørkes i minst 10 minutter eller platen settes i en ovn.

Identifikasjon av separerte stoffer.

Den tørkede platen er et kromatogram av de studerte stoffene. Hvis stoffene er farget, begynner identifiseringen med å bestemme fargen på de separerte stoffene.
Men i de fleste tilfeller er de separerte stoffene fargeløse og en enkel visuell sammenligning er ikke mulig.
For tynnsjiktskromatografi er det flere typer kvalitativ analyse (identifikasjon) av separerte stoffer:

· Visuelle metoder og bestemmelse av Rf for separerte stoffer.

Fargereaksjoner.

· Sammenligning med vitner.

· Fysiske og kjemiske metoder for identifikasjon.

La oss vurdere mer detaljert hver type kvalitativ analyse i tynnsjiktskromatografi.

Fysiske metoder

Visuelle metoder brukes hovedsakelig for å lokalisere flekker av separerte stoffer på en kromatografisk plate. For å gjøre dette blir platen sett både i synlig lys og ved hjelp av ultrafiolett lys (hovedsakelig lys med en bølgelengde på 366 og 254 nm)
Dette er den første fasen av identifikasjon, som bestemmer kvaliteten på de valgte forholdene og resultatene av kromatografi.
Så etter å ha bestemt kvaliteten på kromatografi (fraværet av "haler" av stoffene som skal separeres eller overlappingen av flekkene deres, riktig form og størrelse, fravær av sammenslåing av kromatografiske spor, etc.) og erklært separasjonen passende til videre forskning, bestemme Rf for de identifiserte flekkene.

Rf-verdi.

En av hovedindikatorene i TLC er Rf. Denne parameteren er analog med retensjonstiden og avhenger både av egenskapene til stoffene som skal separeres, sammensetningen av mobilfasen og sorbenten, og av de fysiske parameterne.
Bestemmelsen av Rf-verdien utføres som forholdet mellom avstanden som stoffet passerer og avstanden som passerer av løsningsmiddelfronten

Rf-verdien er en dimensjonsløs verdi og har en verdi fra 0 til 1. Imidlertid finnes slike indikatorer som hRf, Rf × 100 ofte i litteraturen, som er den samme Rf, men multiplisert med 100, for ikke å fungere med desimalverdier.
Verdien av Rf påvirkes ikke av avstanden tilbakelagt av løsemiddelfronten, men mange metoder beskriver passasje av fronten i en avstand på 10 cm. Dette brukes kun for å lette beregningen av Rf.
I praksis, i begynnelsen, bestemmes avstanden som passerer av løsningsmiddelfronten: fra startlinjen (og ikke fra kanten av platen) til stedet der fronten var på slutten av kromatografien. Deretter bestemmes avstanden fra startlinjen til stedet for det separerte stoffet. Det er her størrelsen på flekken påvirker! Tross alt, hvis flekken har rund form og liten størrelse, så har den resulterende Rf en klar verdi. Og hvis det resulterende punktet har en stor størrelse eller uregelmessig form, kan feilen nå 0,1 når du bestemmer Rf for et slikt punkt!
Når det gjelder partisjonskromatografi, er fordelingskoeffisienten til et stoff og dets Rf relatert av forholdet:

Hvor Sp Og Sn- tverrsnittsarealer av den mobile og stasjonære fasen.
Som vi kan se, er fordelingskoeffisienten, ved et konstant forhold Sp/Sn er en mengde proporsjonalt avhengig av Rf , og kan bestemmes gjennom den.

fargereaksjoner.

Fargereaksjoner i tynnsjiktskromatografi brukes ekstremt mye. De tjener ikke bare til å bestemme plasseringen av de separerte komponentene (behandling med svovelsyre, joddamp), men også for å bestemme både klassen av stoffer og identifikasjon (i nærvær av individuelle reaksjoner).
Vi vil ikke vurdere her dette enorme utvalget av fargede kvalitative reaksjoner, vil vi bare si at hvis alle kvalitative reaksjoner sammenfaller og de oppnådde Rf-verdiene for stoffet i tre ulike systemer med litteraturdata er stoffet identifisert. Selv om det etter min mening er behov for ytterligere bekreftelse ved forskning ved hjelp av en annen fysisk-kjemisk metode.

Vitnesammenlikning.

Ved gjennomføring av studier av stoffer med forventet sammensetning brukes kromatografimetoden med vitne- kjent stoff. Denne metoden brukes når kromatografiske forhold er vanskelige å motstå, det er ingen litteraturdata om Rf for et gitt system eller adsorbent, bruk av en gradientmetode osv. Og når du utfører fargereaksjoner, kan du sammenligne ikke bare farger, men også nyanser av stoffene som studeres og vitner, noe som også er viktig.
På den annen side krever denne metoden ekstra kostnader for vitner.

Metoder for kvantitativ analyse

Kvantitativ analyse i tynnsjiktskromatografi har flere typer, som karakteriserer hvert trinn i utviklingen av metoden. Og selv om noen metoder kun kan brukes som semi-kvantitative, brukes de fortsatt i praksis.

visuell sammenligningsmetode. Som nevnt ovenfor avhenger fargeintensiteten til flekken og størrelsen av mengden av det kromatograferte stoffet. Derfor er visuell kvantifisering basert på flere teknikker.
Fortynningsmetode. Denne metoden består i at for hvert stoff bestemmes den begrensende konsentrasjonen der stoffet ikke kan bestemmes ved kromatografisk metode. Ved kromatografering av teststoffet utføres fortynningen til det slutter å vises på platen.
Innholdet av stoff C, bestemt ved denne metoden, er funnet ved formelen:

Hvor n-fortynning, EN- konsentrasjonen av et stoff som det ikke vises ved under kromatografi.
Metode for å bestemme flekkarealet. Hvis de samme volumene av teststoffer og vitner påføres, er flekkene oppnådd etter kromatografi proporsjonale med logaritmen til konsentrasjonen av stoffet. S=a ln c+b

hvor a og b er empiriske koeffisienter bestemt eksperimentelt.
Hvis flekken til det separerte stoffet har skarpe grenser, kan området til flekken bestemmes ved gravimetrisk metode (kuttet ut stedet og veid), målt med et planimeter. Denne metoden gir en feil på opptil 10-15%.
Det har imidlertid en rekke betydelige ulemper. Den første og mest betydningsfulle er at det på denne måten er mulig å bestemme konsentrasjonen av fargede stoffer eller de som har fluorescens i UV-området (254, 366 nm). Denne ulempen kan elimineres ved å tilsette forskjellige fosforer til sorbenten, noe som øker bestemmelsesfeilen.
Behandling av plater med utviklingsstoffer (reagenser) kan også brukes (for eksempel ved bruk av filterpapir impregnert med et fremkallingsreagens, etterfulgt av kontakt med en kromatografisk plate og videre bestemmelse av området til det utviklede stoffet på den), men bestemmelsesfeilen er også høy.
Behovet for et mer pålitelig kvantifiseringsresultat førte til bruk av instrumentelle metoder.
Elueringsmetode. Denne metoden består i det faktum at det separerte stoffet vaskes av sorbenten med et løsningsmiddel og dets konsentrasjon bestemmes av andre metoder - fotometriske, polarografiske, etc. Dette er en ganske nøyaktig metode, men bare under betingelse av kvantitativ isolasjon av det separerte stoffet. På grunn av den høye arbeidsintensiteten brukes metoden ganske sjelden og er uakseptabel for et stort antall prøver som studeres.
Fotografisk metode Definisjonen består i å fotografere platene med det separerte stoffet og videre bestemme graden av sverting ved bruk av disintometre.
radiografisk metode lik fotometrisk, bare med den forskjellen at svertingen av platen bestemmes, forårsaket av strålingen fra det separerte stoffet. Denne metoden brukes kun til bestemmelse av stoffer med merkede atomer.
Fotodesyntometrisk metode kan brukes uten å isolere stoffet fra platen og er basert på å bestemme ikke bare området på stedet, men også dets intensitet.
Dette er den mest nøyaktige metoden for å bestemme konsentrasjonen av stoffer, siden den ved hjelp av kalibreringsgrafer gjør det mulig å utføre ganske nøyaktige kvantitative bestemmelser av alle separerte stoffer (opptil 2-10%) direkte på platen i løpet av kort tid .
Det er ikke overraskende at med utviklingen av tynnsjiktskromatografi øker bruken av disintometre, følsomheten og følgelig nøyaktigheten av å bestemme konsentrasjonen av separerte stoffer øker og nærmer seg nøyaktigheten av høyytelses væskekromatografi.

Ris. 1. Typisk kammer for utvikling av en tynnsjiktskromatografisk plate

1. lokk
2. glasskammer
3. TLC plate
4. sorbent
5. prøvetakingssted
6. løsemiddel

Typisk TLC-kromatogram av fettsyremetylestere.

På kromatogrammet FAME= fettsyrer metylestere = metylestere av fettsyrer. Start= påføringspunkt for blandinger som skal separeres.

Kromatogrammet ble laget på en Sorbfil-plate. Systemet er benzen. Manifestasjon - forkulling etter sprøyting med svovelsyre.

Punktum 1 - metylestere av fettsyrer. Punktum 2 - metyleringsprodukter av totale lipider.

Pil bevegelsesretningen til løsningsmiddelfronten (systemet) er vist. Løsemiddelfronten under kromatografi beveget seg opp til den øvre kanten av platen.

Anvendelse av TLC-metoden i farmasi

Den store betydningen av kromatografiske metoder for farmasi skyldes det faktum at i produksjonen av legemidler er det i mange tilfeller nødvendig med foreløpig isolering av naturlige eller syntetiske produkter i ren form. Analyse er også ofte basert på separering av blandinger i komponenter. La oss vurdere to eksempler på bruken av TLC-metoden, som beviser dens betydning i analyse og produksjon av medisinske stoffer.

Kvantitativ bestemmelse av triterpen-saponiner ved HPTLC ved bruk av skanningsdensitometri

Triterpen saponiner (glykosider) er de aktive ingrediensene i mange legemidler.

De fleste av de for tiden brukte metodene for kvantitativ bestemmelse av triterpen-saponiner er basert på syrehydrolyse av sistnevnte med videre bestemmelse av aglykon, oftest ved titrimetrisk, sjeldnere ved spektrale analysemetoder.

Lignende metoder basert på ødeleggelse av saponinmolekyler har en rekke ulemper. De er lange og tillater ikke en kvantitativ vurdering av forholdet mellom individuelle saponiner i totale saponinholdige preparater.

I de fleste tilfeller begrenser forfatterne seg som regel til en kvalitativ vurdering ved bruk av TLC-metoden, den mest tilgjengelige og enkle kromatografiske analysemetoden. Bruken av TLC for å bestemme det kvantitative innholdet av komponenter er begrenset av mangelen på skanningsdensitometre.

Denne artikkelen presenterer resultatene av kvantitativ TLC-bestemmelse av noen triterpen-saponiner, derivater av oleanolsyre, i farmasøytiske preparater og ekstrakter fra plantematerialer.

Triterpen-saponiner av manchurisk aralia (aralosider) ble valgt som studieobjekter. den kvalitative bestemmelsen av hvilke i ulike objekter er dekket i verkene, samt triterpene saponiner av sukkerroer - stoffer med forhåndsetablert farmakologisk aktivitet. Begge er derivater av oleanolsyre med en liten (ikke mer enn fire) mengde sukkerrester, noe som antyder deres lignende oppførsel i et tynt lag med sorbent.

Som standard brukte vi summen av aralosider isolert fra Saparal-tabletter og summen av sukkerbetesaponiner isolert fra nyhøstede jordstengler. For påføring på platen ble vandig-alkoholholdige (80 % etanol) løsninger av saponiner fremstilt med innholdet av sistnevnte 0,4–2,0 mg/ml. Kromatografi ble utført ved bruk av plater for TLC "Silufol" (Tsjekkia) 15 x 15 cm, "Armsorb" for HPTLC (Armenia) 6 x 10 cm og "Sorbfil" (Russland) 10 x 10 cm. Høyden på frontstigningen, tilstrekkelig for fullstendig adskillelse, var henholdsvis 10,6 og 6 cm. Prøver ble påført ved hjelp av en MSH-10 mikrosprøyte (Russland) på en plate oppvarmet til 40 ° C. Det optimale volumet av den påførte prøven var 3–5 μL. Påføringen ble utført i flere trinn slik at diameteren til startpunktet ikke oversteg 2 mm.

Kromatografi ble utført ved en temperatur på 20-25°C. Ved slutten av elueringen ble platene tørket i luft og behandlet med et deteksjonsreagens ved bruk av en laboratorieglasssprøyte. Sonene ble skannet ved hjelp av et Shimadzu CS-9000" skanningsdensitometer (Japan). Kvaliteten på sonene oppnådd ved kromatografi i de tre mest anbefalte elueringssystemene ble sammenlignet: I. kloroform - metanol - vann (30:17:3) : II. n-butanol - etanol - ammoniakk (7:2:5) III. n-butanol - vann - eddiksyre (4:5:1), øvre lag IV. benzen - etylacetat (1:1) (for sukkersaponiner rødbeter).

En 25 % alkoholløsning av fosfowolframsyre ble brukt som deteksjonsreagenser (røde saponiner på hvit bakgrunn). mest vanlig brukt for kvantitative TLC-bestemmelser av slike forbindelser og en 10 % alkoholløsning av fosfomolybdinsyre, anbefalt for utvikling av triterpenoidsoner (saponinsonene er mørkeblå på gul bakgrunn). Behandling av plater med ammoniakkdamp i sistnevnte tilfelle gjør det mulig å misfarge bakgrunnen og øke kontrasten til flekker.

Som et resultat av de utførte studiene ble de optimale betingelsene for den kromatografiske prosessen for densitometrisk bestemmelse valgt. Den beste av de tre platetypene ble anerkjent av "Armsorb" for HPTLC. høy effektivitet Prosessen forenkles av et tynt (II0 μm) og homogent i fraksjonert sammensetning (5-10 μm) lag av silikagel, som gir god separasjon og minimal uskarphet av sonene selv når løsningsmiddelfronten stiger med 6 cm. Sorbfil-plater er nesten like gode som dem i separasjonsevne, men elueringstiden på dem er nesten dobbelt så lang. Plater "Silufol" med en tilstrekkelig høy elueringshastighet lar deg skille komponentene med en større kromatografisk bane, noe som fører til noe uskarphet i sonene, men bruken av dem er også mulig.

Elueringen kan utføres med tilstrekkelig kvalitet i hvilket som helst av de tre første elueringssystemene. Jeg gir en gevinst i tid, IV lar deg få en bedre separasjon av sukkerbetesaponiner enn de tre første.

Begge deteksjonsreagensene gir en ganske stabil farging av sonene når skanning utføres innen 1 - 2 timer fra utviklingsøyeblikket. Etter denne perioden endrer saponinsonene på platene behandlet med fosfowolframsyre farge fra bringebær til fiolett, noe som kan føre til en forvrengning av de kvantitative analyseresultatene under skanning. Behandling med fosfomolybdinsyre er mer å foretrekke i dette tilfellet. Når de ble lagret på et sted beskyttet mot lys, ga platene med soner utviklet av denne reagensen fullstendig reproduserbare resultater etter flere måneder fra utviklingsøyeblikket.

Påvisningsgrensen for saponiner var 5 μg i prøven ved utvikling med fosfowolframsyre og 0,5 μg i prøven ved utvikling med fosfomolybdinsyre. Behandling med ammoniakkdamp gjorde det mulig å redusere deteksjonsgrensen for saponiner i sistnevnte tilfelle til 0,2 μg per prøve.

Kvantitativ bestemmelse av saponiner ved TLC ved bruk av skanningsdensitometri ble utført på Armsorb-plater (kromatografihastigheten i dette tilfellet var 2 ganger høyere) eller "Sorbfil", i II- og III-elueringssystemet (som inneholder mindre toksiske komponenter). Soner ble påvist med en 10 % løsning av fosfomolybdinsyre. Volumet av den påførte prøven er ikke mer enn 5 μl, høyden på elueringsfronten er 6 cm, elueringstiden er 30 - 60 minutter. Skannebølgelengde λ = 675 nm. Etter bearbeiding av platene vises aralia og sukkerbetesaponiner i form av tre soner med forskjellig intensitet.

Den generelle oversikten over densitogrammene oppnådd under skanning er vist i fig. 1.

Sammenligning av kromatogrammer av saponiner isolert fra tabletter "Saparal" (fig. 1, a) og "Aralia tinktur" (fig. 1,6) lar oss legge merke til det forskjellige forholdet 44

aralosidene A, B og C, som er en del av disse doseringsformene. En lignende variasjon i forholdet mellom individuelle saponiner i råvarer, avhengig av vekstforholdene til planten, ble notert tidligere. Forholdet mellom saponiner i ferdig doseringsformer enkelt vurderes ved hjelp av de oppnådde densitogrammene. Siden det er henholdsvis 3 soner som tilsvarer saponiner på kromatogrammet, og tre topper på densitogrammet, ble arealene til alle toppene oppsummert ved konstruksjon av kalibreringskurven. Feilen i dette tilfellet var lavere enn i beregninger basert på parametrene til toppen av en av komponentene, tatt i betraktning variabiliteten til forholdet deres (fig. 2).

Ris. I. Densitogrammer oppnådd ved å skanne TLC-plater: EN- Aralia saponiner isolert fra Saparal tabletter; 6 - aralia tinktur saponiner; V- sukkerbetesaponiner. Totalt innhold av saponiner i prøven er 5 μg. A, B, C- topper av saponiner; 0 - startlinje; f- Frontlinje.

Ris. Fig. 2. Kalibreringsavhengighet av summen av arealer av peakonsaponiner på kromatogrammet på innholdet i prøven. / - Aralia saponiner; 2 - sukkerbetesaponiner. På abscisseaksen - innholdet av saponiner i prøven (mcg), på ordinataksen - summen av topparealer (cm 2).

Kalibreringsavhengigheten av summen av topparealer på densitogrammet på innholdet av stoffet i prøven ble oppnådd ved kromatografi av en serie standardløsninger med kjent innhold av saponiner. Den opprinnelige løsningen ble fremstilt ved å oppløse i 80 % etanol en nøyaktig vekt av saponiner, tørket til konstant vekt. En serie arbeidsløsninger ble fremstilt ved sekvensiell fortynning av den innledende 80% etanol. Innholdet av saponiner i dem var 0,04 - 2,0 mg/ml (0,2 - 10 µg i en prøve med et prøvevolum på 5 µl). Dette konsentrasjonsområdet kan anses som optimalt for skanning. Minimumsinnholdet av saponiner bestemt ved denne metoden er 0,2 µg/prøve. Det relative standardavviket i dette tilfellet overstiger ikke 0,03.

De resulterende kalibreringsavhengighetene er ikke-lineære, noe som er helt i samsvar med Kubelka-Munk-teorien, som tar hensyn til absorpsjon og spredning av lys av sorbenten. I et smalt område med lave konsentrasjoner kan avhengighetene betraktes som lineære (0,2 - 2,0 µg/prøve). Den ikke-lineære delen av kurvene kan lineariseres ved å konvertere mengden stoff i prøven og topparealet til resiproke og tar formen vist i fig. 3.

Ris. 3. Avhengighet av den resiproke av summen av arealene til toppene av saponiner på kromatogrammet (1/S 10 -1) på deres gjensidige verdi av innholdet i prøven (1/m - 10 -1). 1 - Aralia saponiner; 2 - sukkerbetesaponiner.

Ved å bruke den oppnådde kalibreringsavhengigheten ble innholdet av saponiner i aralia-tinkturen bestemt. 5 ml av tinkturen ble fortynnet med 70 % etanol i en 25 ml målekolbe. 5 μl av den resulterende løsningen ble påført startlinjen til Armsorb-plastanene 5 μl av en standardløsning av aralosider med en konsentrasjon på 1 mg/ml (5 μg i prøven) ble påført på det tilstøtende punktet Platene ble behandlet som beskrevet ovenfor.

Forskjellen mellom de oppnådde resultatene og resultatene av bestemmelsen i henhold til PS 42-1647-93 (5,3 mg/ml) var 6–7 % i retning av overestimering, noe som kan forklares med tap av saponiner under flertrinns klargjøring av prøven i henhold til PS (tabell).

Metoden beskrevet ovenfor ble brukt til å bestemme saponiner i tabletter "Saparal" og i planteråvarer (røtter av Manchurian aralia og rhizomer av sukkerroer) med foreløpig uttømmende ekstraksjon av saponiner fra tabletter fra råvarer - 80% varm etanol. Avvik fra resultatene av bestemmelsen i henhold til FS 42-1755 - 81 for tabletter (0,040 g) er innenfor samme grenser som for tinktur (tabell).

Muligheten for ekspress kvantitativ bestemmelse av enkelte triterpen-saponiner, derivater av oleanolsyre i legemidler og plantematerialer ved HPTLC med påfølgende kvantitativ vurdering av de oppnådde sonene ved bruk av skanningsdensitometri har blitt vist.

Resultatene av bestemmelsen korrelerer ganske godt med resultatene av bestemmelsen av PS. Teknikken gjør det mulig å kombinere bestemmelsen av autentisiteten til preparater ved TLC (av FS) med den påfølgende skanningen av sonene til komponentene på platene og deres kvantitative vurdering. Kromatogrammer oppnådd under skanning gjør det også mulig å bestemme forholdet mellom individuelle saponiner i de analyserte objektene.

Resultatene av den kvantitative bestemmelsen av araloser iCTofik-fra aralia (I) og tabletter "Saparal" (2) ved TGC-metoden ved bruk av skanning dsnsptoietrnn /" = 0,95, og - 5,/=2,78,/=4

STUDIE AV LIPID- OG FLAVONOID-SAMMENSETNING AV PRØVER AV NOEN ARTER AV SLIKTEN KINA ( Lathyrus .)

Fra mange representanter for belgfruktfamilien, som alfalfa, lupin, kløver, vikker, har det blitt isolert flavonoider som har et bredt spekter av virkning: anti-inflammatorisk, sårheling, vaskulær styrking, etc. Isoflavoner ble isolert fra rødkløver: biochanin A - 0,8% og formononetin - 0,78%, som har østrogen aktivitet.

Vi har studert flavonoidsammensetningen i visse arter av slekten: ch. såing (I), schlugovaya (II), ch.

Med tanke på mulig bruk av lipidkomplekset i mattilsetningsstoffer og medikamenter, studerte vi også hele fraksjonssammensetningen av lipider i gresset og frøene til haken.

Materialer og metoder

Isoleringen av lipidfraksjonen fra tørre råmaterialer ble utført i henhold til metoden til Bligh og Dyer.

Til en prøve (0,2 g) av tørt plantemateriale ble det tilsatt 1,6 ml destillert vann og holdt i en dag i kulden. Deretter ble 6 ml av en blanding av kloroform - metanol (1:2) tilsatt og fikk stå i 3 dager, hvoretter den ble sentrifugert ved 8 tusen rpm - 15 minutter. 2 ml vann og 2 ml kloroform ble tilsatt til den klare supernatanten. Det resulterende 2-fasesystemet ble separert i en skilletrakt. Kloroformlaget ble vasket to ganger med metanol og inndampet til tørrhet på en rotasjonsfordamper. Resten ble tørket i en vakuumekssikkator, deretter fortynnet med kloroform til en konsentrasjon på 10 mg/ml, og løsningen ble lagret i stabilisert kloroform ved +4°C.

Kvalitativ analyse av lipidfraksjonen ble utført ved bruk av TLC på Kizelgel 60 (254) plater i følgende løsningsmiddelsystemer:

A. For nøytrale lipider: 1) Heksan - benzen (9:1); 2) Heksan-eter-eddiksyre (90:10:1).

B. For polare lipider (fosfolipider): 1) kloroform - aceton - metanol - eddiksyre - vann (6:8:2:2:1), surt; 2) kloroform - meta-

nol - 26% ammoniakk (65:25:5), basisk; 3) kloroform - metanol - vann (65:25:4), nøytral.

Ved bestemmelse av den kvalitative sammensetningen av fosfolipider ble identifiseringen utført ved bruk av forskjellige utviklere (joddamp, ninhydrin, Dragendorffs reagens, svovelsyre) og ved å bruke Rf standarder.

Ovennevnte sett med systemer og reagenser gjorde det mulig å utføre en uttømmende analyse av lipidfraksjoner isolert fra hakeprøver.

For å studere flavonoidsammensetningen, tatt i betraktning vegetasjonsfasene, ble følgende prøver valgt: I (blomstrende fase); IV (blomstrende fase); III (sochevnik) fase av spirende; II (blomstrende fase); II (fruktfase); II (vegetasjonsfase før blomstring).

Isoleringen av flavonoider fra tørre råvarer ble utført i henhold til en metode som sikrer deres uttømmende utvinning.

For dette formål ble 1 g av den knuste urten plassert i en tilbakeløpskolbe, fylt med 20 ml 70% etanol og kokt i 20 minutter i vannbad. Ekstraktet ble avkjølt, filtrert gjennom et Schott-filter av glass og inndampet til tørrhet på en rotasjonsfordamper. Resten ble oppløst i etylalkohol til en sluttkonsentrasjon på 10 mg/ml. Bestemmelse av totalinnholdet av flavonoider ble utført ved bruk av rutin som standard. Resultatene av denne studien er vist i tabell. 3.

Den kvalitative sammensetningen av flavonoider ble bestemt ved TLC på Kieselgel 60(254) plater fra Merck, i løsningsmiddelsystemet n-butanol - eddiksyre - vann (6:1:2). Detektor - svovelsyre ved UV (254 nm) - flavonoidflekker lilla farge på grønn bakgrunn.

Tabell 1

Det totale innholdet av flavonoider i råvarer (gress) av ulike typer kines (i %, i form av absolutt tørrvekt)

Ris. Fig. 1. TLC av flavonoidsammensetning av utvalgte arter av slekten Chin. C - mengden vitner av flavonoider: ononin - Rf 0,28; rutine - R 0,48; luteolin-glukosid - Rf 0,58; formononetin - Rf 0,64; quercetin - Rf0,79: luteolin - Rf 0,82; biokanin A - Rf 0,85; apigenin - Rf 0,92.

Ris. Fig. 2. TLC av flavonoider av enggress i ulike faser av vegetasjonen. IIa - blomstringsfase; IIb - fruktfase: IIc - vegetasjonsfase før blomstring. C - mengden vitner av flavonoider: ononin - Rf f 0,28; rutine - Rf 0,48; luteolin-glukosid - Rf 0,58; formononetin - Rf 0,64; quercetin - Rf 0,79; luteolin - R ( 0,82; biokanin A - Rf 0,85; apigenin - Rf 0,92.

Når man studerte flavonoidsammensetningen av II i forskjellige faser av vegetasjonen, ble det bemerket at i tillegg til rutin og quercetin, er ononin og formononetin tilstede i en merkbar mengde i ekstraktet. Andre flavonoider ble funnet i spormengder.

Således har det vist seg at i forskjellige typer hake, i forskjellige faser av vegetasjonen, finnes både glykosider og aglykoner - ononin, rutin, luteolin-glukosid og deres aglykoner: formononetin, quercetin og luteolin, og deres sammensetning varierer avhengig av plantetype, og i en plante (engrang) avhengig av vegetasjonsfasen.

tabell 2

Det kvantitative innholdet av de viktigste flavonoidene i individuelle representanter for slekten chiny (i %, når det gjelder absolutt tørrvekt)

I II ble både ononin og formononetin funnet i den vegetative perioden. I løpet av blomstringen og fruktdannelsen reduseres mengden ononin merkbart, og mengden formononetin øker.

Det kvantitative innholdet av hovedflavonoidene i de studerte prøvene ble bestemt ved kvantitativ TLC under de samme forholdene. Resultatene av denne studien er vist i tabell. 2.

Som følger av dataene i tabell. 2, forskjellige typer Chins er en rik kilde til bloflavonoider, på grunn av hvilke disse plantene viser en av typene biologisk aktivitet.

Konklusjon:

En av de viktige oppgavene til moderne kjemi er pålitelig og nøyaktig analyse av organiske stoffer, ofte like i struktur og egenskaper. Uten dette er det umulig å gjennomføre kjemiske, biokjemiske og medisinsk forskningØkologiske metoder for miljøanalyse, rettsmedisinske undersøkelser, samt kjemiske, olje-, gass-, mat-, medisinske industrier og mange andre sektorer av nasjonaløkonomien er i stor grad basert på dette. Bare en liten del av metodene og teknikkene for tynnsjiktskromatografi er gitt her. Men som du kan se av denne lille, har tynnsjiktskromatografi betydelige og seriøse muligheter, kombinert med bekvemmelighet og enkelhet.