เอนไซม์เป็นตัวเร่งปฏิกิริยาโปรตีนของปฏิกิริยาทางชีวเคมี ที่สุดซึ่งหากไม่มีเอนไซม์ก็จะดำเนินไปช้ามาก ต่างจากตัวเร่งปฏิกิริยาทางเคมี เอนไซม์แต่ละตัวสามารถกระตุ้นปฏิกิริยาได้เพียงเล็กน้อยเท่านั้น ซึ่งมักจะเกิดเพียงปฏิกิริยาเดียวเท่านั้น

ดังนั้นเอนไซม์จึงเป็นตัวเร่งปฏิกิริยาที่จำเพาะต่อปฏิกิริยา ปฏิกิริยาทางชีวเคมีเกือบทั้งหมดถูกเร่งด้วยเอนไซม์

เอนไซม์หลายชนิดมีผลในการเร่งปฏิกิริยาบนพื้นผิวเฉพาะเมื่อมีสารประกอบอินทรีย์โมเลกุลต่ำที่ทนความร้อนได้จำเพาะนั่นคือโคเอ็นไซม์

ในกรณีเช่นนี้ โฮโลเอนไซม์ (สารเชิงซ้อนเชิงเร่งปฏิกิริยา) ประกอบด้วยอะโปเอ็นไซม์ (ส่วนโปรตีน) และโคเอ็นไซม์ที่เกี่ยวข้อง (ภาคผนวก H) โคเอ็นไซม์สามารถเชื่อมโยงกับอะโปเอ็นไซม์ได้ด้วยพันธะโควาเลนต์และไม่ใช่โควาเลนต์ คำว่า "กลุ่มเทียม" อ้างอิงถึงโคเอ็นไซม์ที่เชื่อมโยงด้วยโควาเลนต์ ปฏิกิริยาที่จำเป็นต้องมีโคเอ็นไซม์ ได้แก่ รีดอกซ์ การถ่ายโอนหมู่ ไอโซเมอไรเซชัน และการควบแน่น (ตามระบบ IUB สิ่งเหล่านี้คือคลาส 1, 2, 5, 6) ปฏิกิริยาความแตกแยกเกิดขึ้นในกรณีที่ไม่มีโคเอ็นไซม์ (ตามระบบ IUB เหล่านี้เป็นคลาส 3 และ 4)

^ 4.1 งานห้องปฏิบัติการ“การกำหนดกิจกรรมของอะไมเลส
มอลต์ตามวิธี Wolgemut"

วิธีการของโวลเกมมัทขึ้นอยู่กับการหาปริมาณเอนไซม์ขั้นต่ำที่สามารถไฮโดรไลซ์สารละลายแป้ง 0.1% ได้อย่างสมบูรณ์ภายใต้เงื่อนไขบางประการ กิจกรรมอะไมเลสของมอลต์แสดงเป็นจำนวนมิลลิลิตรของสารละลายแป้ง 0.1% ซึ่งสามารถไฮโดรไลซ์ด้วยสารสกัดมอลต์ 1 มิลลิลิตรที่อุณหภูมิ 38 °C เป็นเวลา 30 นาที กิจกรรมของอะไมเลสปกติอยู่ระหว่าง 160 ถึง 320 หน่วยกิจกรรม

วิธี Wohlgemuth ใช้กันอย่างแพร่หลายในการปฏิบัติทางคลินิกเพื่อตรวจสอบกิจกรรมของอะไมเลสในเลือดและปัสสาวะ และในการต้มเบียร์เพื่อตรวจสอบกิจกรรมของอะไมเลสของมอลต์ กิจกรรมของอะไมเลสในเลือดและปัสสาวะเพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็ว (10-30 เท่า) สังเกตได้ในตับอ่อนอักเสบเฉียบพลันและเนื้องอกในตับอ่อน

^ วัสดุและรีเอเจนต์: สารสกัดจากเกรนมอลต์เจือจาง 10 เท่า สารละลายแป้ง 0.1% สารละลายไอโอดีน 0.1% ในสารละลายโพแทสเซียมไอโอไดด์ 0.2%

อุปกรณ์:ยืนด้วยหลอดทดลอง ปิเปต หยด เทอร์โมสตัท

^ ความคืบหน้าการทำงาน.หลอดทดลองสิบหลอดเต็มไปด้วยน้ำกลั่น 1 มิลลิลิตร เติมสารสกัด 1 มิลลิลิตรที่เจือจาง 10 ครั้งลงในหลอดทดลองหลอดแรก ผสมให้เข้ากัน ย้ายส่วนผสม 1 มิลลิลิตรไปยังหลอดทดลองหลอดที่สอง เนื้อหาของหลอดทดลองนี้จะถูกผสมอีกครั้ง และถ่ายโอน 1 มิลลิลิตรไปยังหลอดทดลองหลอดที่สามและต่อไปเรื่อยๆ จนถึงหลอดทดลองหลอดที่สิบ นำ 1 มล. จากหลอดทดลองสุดท้ายแล้วเทออก ดังนั้นในแต่ละหลอดทดลองถัดไป ปริมาณเอนไซม์จึงน้อยกว่าหลอดก่อนหน้าถึงสองเท่า การเจือจางของสารสกัดในหลอดทดลอง 10 หลอดจะเป็น: 1:10; 1:20; 1:40; 1:80; 1:160; 1:320; 1:640; 1:1280; 1:2560; 1:5120; 1:10240.

จากนั้น เติมน้ำ 1 มล. และสารละลายแป้ง 2 มล. ลงในหลอดทดลองทั้งหมด ผสมและวางในเทอร์โมสตัทที่อุณหภูมิ 38 °C เป็นเวลา 30 นาที หลังจากการฟักตัว หลอดจะถูกทำให้เย็นลง น้ำประปาเพื่อหยุดการทำงานของเอนไซม์ ให้เติมสารละลายไอโอดีน 2 หยด เขย่าให้เข้ากัน และสังเกตการเปลี่ยนสี เมื่อทำปฏิกิริยากับไอโอดีน ของเหลวจะเปลี่ยนเป็นสีเหลือง สีชมพู และสีม่วง

สังเกตว่าเจือจางแค่ไหน การไฮโดรไลซิสโดยสมบูรณ์แป้งที่มีปริมาณเอนไซม์ขั้นต่ำ (หลอดทดลองที่มีสีเหลืองของเนื้อหา) กิจกรรมอะไมเลสของสารสกัดคำนวณจากปริมาณของสารสกัดที่ไม่เจือปน (A) ในหลอดทดลองนี้
(สารสกัดหนึ่งมล. สลาย X มล. ของสารละลายแป้ง 0.1%)

ตัวอย่างเช่น, สีเหลืองปรากฏในหลอดทดลองหลอดที่ 4 โดยนำสารสกัดมาเจือจาง 160 เท่า สารสกัดจำนวนนี้สามารถไฮโดรไลซ์สารละลายแป้ง 0.1% 2 มล. และสารสกัดที่ไม่เจือปน 1 มล. ภายใต้เงื่อนไขเดียวกันจะไฮโดรไลซ์ 320 มล.: X = 2 × 160/1 ดังนั้นกิจกรรมของอะไมเลสคือ 320

^ 4.2 งานห้องปฏิบัติการ “การกำหนดกิจกรรมของตัวเร่งปฏิกิริยา

ตามบาค"

วิธีการนี้ขึ้นอยู่กับการหาปริมาณไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ที่เหลืออยู่หลังจากปฏิกิริยาของตัวเร่งปฏิกิริยาโดยการไตเตรทสารละลาย KMnO 4 ลงไป ปฏิกิริยาดำเนินไปตามสมการ

สารละลายโพแทสเซียมเปอร์แมงกาเนต 0.1 โมล/ลิตร 1 มิลลิลิตร เท่ากับไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ 85 มิลลิกรัม

^ วัสดุและรีเอเจนต์: การเตรียมตัวเร่งปฏิกิริยา (ข้าวบาร์เลย์มอลต์งอก 1 กรัมบดในครกพอร์ซเลนพร้อมบัฟเฟอร์ฟอสเฟต 6 มล. แล้วกรอง) สารละลาย 10% ของ H 2 SO 4; สารละลายไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ 0.1% ในบัฟเฟอร์ฟอสเฟต pH=7.0 (35.0 มล. ของ 0.2 โมล/ลิตร NaH 2 PO 4 ใน 13.6 มล. ของ 0.2 โมล/ลิตร NaH 2 PO 4); สารละลาย KMnO 4 0.1 โมล/ลิตร

อุปกรณ์:ขวดปริมาตร 100 มล. ปิเปต บิวเรตต์ เทอร์โมสตัท

^ ความคืบหน้าการทำงาน.เติมตัวเร่งปฏิกิริยาคาตาเลส 2 มล. ลงในขวดสองขวด เติมสารละลาย H2SO4 10% 1 มล. ลงในขวดใดขวดหนึ่ง (ตัวอย่าง) จากนั้นเทสารละลายไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ 2 มล. ลงในขวดแต่ละขวด แล้ววางในเทอร์โมสตัทเป็นเวลา 40 นาทีที่ 38 °C . หลังจากพ้นเวลาฟักตัวแล้ว ให้เติมสารละลาย 10% H 2 SO 4 1 มิลลิลิตรลงในขวดที่สอง (ชุดควบคุม) และสารละลายทั้งสองจะถูกไตเตรทด้วยสารละลาย KMnO 4 0.1 โมล/ลิตร จนกระทั่งสีชมพูถาวรปรากฏขึ้นจากโพแทสเซียมส่วนเกิน เปอร์แมงกาเนต

กิจกรรมของคาตาเลสถูกกำหนดโดยปริมาณไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ที่ย่อยสลาย (มล.) และคำนวณโดยใช้สูตร:

,

ที่ไหน
– ความแตกต่างในผลลัพธ์ของการไตเตรทของตัวอย่างควบคุมและตัวอย่างทดสอบด้วยสารละลาย 0.001 N KMnO 4, ml;

Q – ปริมาณไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ (85 มก.) ที่สอดคล้องกัน
สารละลาย KMnO 4 0.1 โมล/ลิตร 1 มล.

^ 4.3 งานห้องปฏิบัติการ “วิธีหยด
(อ้างอิงจาก Klimovsky และ Rodzevich)"

กิจกรรมอะไมโลไลติกส่วนใหญ่เกิดจากการมีα-amylase ในการเตรียมลักษณะความสามารถของเอนไซม์ในการเร่งปฏิกิริยาไฮโดรไลซิสของแป้งให้เป็นผลิตภัณฑ์ที่ไม่เปื้อนไอโอดีน หากมีα-amylase และ glucoamylase ในการเตรียม วิธีการนี้จะกำหนดผลรวมของเอนไซม์อะไมโลไลติกทั้งหมด

ในวิธีนี้ หน่วยของกิจกรรมอะไมโลไลติกถือเป็นปริมาณของเอนไซม์ที่เร่งการสลายแป้งที่ละลายได้ 1 กรัมให้เป็นผลิตภัณฑ์ที่ไม่เปื้อนไอโอดีนใน 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 30 °C ภายใต้เงื่อนไขที่กำหนดอย่างเคร่งครัด กิจกรรมอะไมโลไลติกของ AS แสดงโดยจำนวนหน่วยที่ระบุต่อยา 1 กรัม การเพาะเลี้ยง หรือสารละลาย 1 ซม. 3 ค่า AC แสดงจำนวนกรัมของแป้งที่สามารถไฮโดรไลซ์เป็นสารประกอบที่ไม่มีไอโอดีนด้วยยา 1 กรัม การเพาะเลี้ยง หรือสารละลาย 1 ซม. 3 ใน 1 ชั่วโมงภายใต้เงื่อนไขที่กำหนด ความสมบูรณ์ของปฏิกิริยาจะถูกตรวจสอบด้วยสายตาโดยใช้การทดสอบไอโอดีน

ความไวของวิธีการถูกกำหนด ปริมาณขั้นต่ำเวลาที่ตรวจพบการเปลี่ยนแปลงของสีไอโอดีนด้วยสายตา สันนิษฐานว่าอัตราการเกิดปฏิกิริยาของเอนไซม์จะเป็นสัดส่วนโดยตรงกับปริมาณของเอนไซม์ที่ใช้และคงที่เป็นเวลาตั้งแต่ 5 นาทีถึง 1 ชั่วโมง กล่าวคือ ปฏิกิริยาเป็นไปตามกฎการเกิดปฏิกิริยา ลำดับศูนย์- นอกจากนี้อิทธิพลของค่า pH และ ลักษณะทางเคมีบัฟเฟอร์ตามจำนวน AC เมื่อใช้บัฟเฟอร์อะซิเตต (pH=4.7) ค่า AC ในการเตรียมเห็ดจะสูงกว่าเมื่อพิจารณาด้วยบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (pH=6.0) โดยเฉลี่ย 1.5 เท่า ดังนั้นเมื่อกำหนดค่า AC ของการเพาะเชื้อรา ขอแนะนำให้ใช้บัฟเฟอร์อะซิเตต

ข้อเสียของวิธีนี้คือความคลุมเครือ คำจำกัดความของภาพสิ้นสุดปฏิกิริยา

^ วัสดุและรีเอเจนต์: บัฟเฟอร์อะซิเตตที่มีค่า pH = 4.7 สำหรับเอนไซม์ที่มีต้นกำเนิดจากเชื้อรา บัฟเฟอร์ฟอสเฟตที่มีค่า pH = 6.0 สำหรับเอนไซม์ที่มีต้นกำเนิดจากแบคทีเรีย สารละลายแป้ง 1% (สารละลายแป้งที่ใช้ในการวิเคราะห์การเตรียมเชื้อราต้องมี pH = 4.7 สำหรับการวิเคราะห์การเตรียมแบคทีเรีย - 6.0) สารละลายไอโอดีน ในการเตรียมสารละลายไอโอดีนขั้นพื้นฐาน ให้ชั่งน้ำหนักโพแทสเซียมไอโอไดด์ 4.4 กรัม และไอโอดีนโลหะ 1.4 กรัมลงในแก้วน้ำหนักภาชนะที่มีฝาปิดแบบกราวด์ และเติมน้ำกลั่นประมาณ 2 ซม. 3 ปิดฝาแก้ว ผสมสารต่างๆ เข้าด้วยกัน และหลังจากที่ไอโอดีนละลายแล้ว สารละลายจะถูกถ่ายโอนลงในขวดวัดปริมาตรขนาด 100 ซม. 3 โดยมีตัวกั้นแบบกราวด์อยู่ เติมปริมาตรด้วยน้ำกลั่นจนถึงเครื่องหมาย เนื้อหาของขวดจะถูกเก็บไว้ในที่เย็นและมืด สารละลายไอโอดีนพื้นฐานสามารถใช้ได้ภายใน 30 วันนับจากวันที่เตรียม สารละลายไอโอดีนที่ใช้งานได้นั้นเตรียมจากสารละลายหลัก ในการทำเช่นนี้ให้เทสารละลายไอโอดีนพื้นฐาน 20 ซม. 3 ลงในขวดปริมาตรที่มีความจุ 100 ซม. 3 โดยเติมโพแทสเซียมไอโอไดด์ 4.4 กรัมและปริมาตรรวมของสารละลายจะถูกปรับเป็น 100 ซม. 3 สารละลายไอโอดีนสามารถบริโภคได้ภายในหกวันหลังจากการเตรียมการ

อุปกรณ์:หลอดทดลองแบบกว้าง แท่งแก้ว ปิเปต บีกเกอร์ขนาด 50 มล. จานเพาะเชื้อ เทอร์โมสตัท

^ ความคืบหน้าการทำงาน.ในการกำหนดค่า AC สิ่งสำคัญคือต้องปฏิบัติตามเงื่อนไขของปฏิกิริยาอย่างเคร่งครัด ในการทำเช่นนี้สารละลายทั้งหมด - สารตั้งต้น (สารละลายแป้ง 1%) สารละลายเอนไซม์และน้ำกลั่นจะต้องได้รับความร้อนที่อุณหภูมิ 30 ° C ก่อน

วางสารตั้งต้นจำนวน 25 ซม. 3 (12.5 มล.) ลงในหลอดทดลองขนาดกว้างโดยสอดแท่งแก้วเข้าไป สารสกัด 30 ซม. 3 (15 มล.) และน้ำ 30 ซม. 3 (15 มล.) เทลงในหลอดทดลองที่แยกจากกัน วางในเทอร์โมสตัทและเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 30 ºС สำหรับ
10 นาที

จากนั้นใช้ปิเปตเติมสารละลายเอนไซม์ดั้งเดิมตั้งแต่ 1 ถึง 25 ซม. 3 และน้ำในปริมาณที่เหมาะสมลงในสารละลายแป้งในหลอดทดลองที่มีขนาดกว้างโดยไม่ต้องถอดหลอดทดลองออกจากเทอร์โมสตัทเพื่อให้ปริมาตรรวมของปฏิกิริยา ส่วนผสมคือ 50 ซม. 3 . หากสารสกัดเอนไซม์ไม่ทำงานคุณสามารถเพิ่มได้เพียง 25 ซม. 3 เท่านั้นและไม่ต้องเติมน้ำเลย

เนื้อหาของหลอดทดลองจะถูกผสมด้วยแท่งไม้ และเวลาจะถูกบันทึกด้วยนาฬิกาจับเวลาเมื่อเติมสารสกัดลงในสารละลายแป้ง ทุก ๆ 60 วินาที จะมีการเก็บตัวอย่างหนึ่งหยดจากหลอดทดลองโดยไม่ต้องถอดออกจากเทอร์โมสตัท หยดหนึ่งวางบนจานพอร์ซเลนสีขาว หยดนี้รวมกับหยดสารละลายไอโอดีนและสังเกตสี ปฏิกิริยาการสลายแป้งจะถือว่าสมบูรณ์เมื่อไอโอดีนไม่ทำให้เกิดการเปลี่ยนสีอีกต่อไปเมื่อรวมกับสารละลายทดสอบที่หยดลงภายใน 10 วินาทีแรก การเปลี่ยนสีมองเห็นได้ชัดเจนที่ขอบสัมผัสระหว่างหยดสองหยด - ไอโอดีนและส่วนผสมของปฏิกิริยา

ระยะเวลาที่แป้งจะแตกตัวเป็นผลิตภัณฑ์ที่ไม่เปื้อนไอโอดีนควรอยู่ในช่วงตั้งแต่ 10 ถึง
20 นาที

หากเวลาไฮโดรไลซิสน้อยกว่า 10 นาที การตรวจวัดจะทำซ้ำโดยใช้สารสกัดน้อยลงและใช้น้ำมากขึ้นในการไฮโดรไลซิส หากไฮโดรไลซิสไม่เสร็จสิ้นภายใน 20 นาที การวิเคราะห์ก็จะถูกทำซ้ำเช่นกัน โดยใช้สารสกัดจากเอนไซม์มากขึ้นและใช้น้ำน้อยลงในการพิจารณา ปริมาณสารสกัดเอนไซม์ที่ต้องรับประทานต่อ การวิเคราะห์ซ้ำคำนวณโดยคำนึงถึงเวลาไฮโดรไลซิสที่ได้รับ

หากสารสกัดเอนไซม์มีน้อยหรือมากเกินไป กิจกรรมสูงและปริมาณสารละลายเอนไซม์ตั้งแต่ 1 ถึง 25 ซม. 3 ไม่ได้รับประกันระยะเวลาของการไฮโดรไลซิสของแป้งเป็นเวลา 10...20 นาที จากนั้นสำหรับการวิเคราะห์พวกเขาไม่ได้ใช้สารละลายแป้ง 25 ซม. 3 แต่ในปริมาณที่มากขึ้นหรือน้อยลงสำหรับ เช่น 10 หรือ 40 ซม. 3 โดยเพิ่มการแก้ไขที่เกี่ยวข้อง สูตรการคำนวณ(0.1 หรือ 0.4 ตามลำดับ แทนที่จะเป็น 0.25 ปกติ)

ค่าของกิจกรรมอะไมโลไลติกของ AS (หน่วย/กรัม) คำนวณโดยใช้สูตร:

โดยที่ 0.25 คือปริมาณแป้งที่อยู่ใน 25 ซม. 3 ของสารละลาย 1%, g;

60 – ปัจจัยการแปลงเป็นเวลา 1 ชั่วโมง;

N คือปริมาณของเอนไซม์ที่เข้าร่วมในปฏิกิริยา g หรือ cm 3 (ค่านี้พิจารณาจากความเข้มข้นของสารสกัดเริ่มต้นและการเจือจางในภายหลัง)

T – เวลาที่แป้งถูกย่อยเป็นผลิตภัณฑ์ที่ไม่เปื้อนไอโอดีน นาที

ตัวอย่าง.นำสารสกัดเอนไซม์ของการเพาะเลี้ยงทางอากาศของเชื้อรามาวิเคราะห์ สารละลายสต๊อกถูกเตรียมในอัตรา 5 กรัมของการเพาะเลี้ยงในน้ำบัฟเฟอร์ 100 ตารางเซนติเมตร 3 เป็นที่ทราบกันดีว่าวัฒนธรรมนี้มีความกระตือรือร้นมากดังนั้นจึงมีการเจือจางสารละลายดั้งเดิมเพิ่มเติม: นำ 20 ซม. 3 ในขวดวัดปริมาตรเป็น 50 ซม. 3 ด้วยน้ำกลั่นและจากนั้นจึงนำ 2 ซม. 3 มาวิเคราะห์เช่น ได้รับลำดับการเจือจางต่อไปนี้:

5 ก. → 100 ซม. 3 → 20 ซม. 3 → 50 ซม. 3 → 2 ซม. 3

ใช้เวลา 12 นาทีในการไฮโดรไลซ์แป้ง 0.25 (25 ซม. 3 ของสารละลายแป้ง 1%) ด้วยสารละลายเอนไซม์ของการเจือจางครั้งสุดท้าย (2 ซม. 3) จากนั้นค่า AC ของพืชตากแห้ง (หน่วย/กรัม) จะเป็น:

เมื่อคำนวณใหม่ กิจกรรมของเอนไซม์ไม่ควรนำมาพิจารณาโดยเด็ดขาด ของแห้งการเตรียมเอนไซม์และคำนึงถึงความชื้นด้วย การคำนวณควรทำโดยใช้สูตร:

,

โดยที่ W คือปริมาณความชื้นของการเพาะเลี้ยงหรือการเตรียม

^ 4.4 งานห้องปฏิบัติการ “วิธี Willstetter
และคำจำกัดความของ Waldschmidt-Leitz ของโปรตีโอไลติก
กิจกรรมของเอนไซม์ในการดัดแปลง"

วิธีการนี้ขึ้นอยู่กับการกำหนดกลุ่มคาร์บอกซิลอิสระในสารละลายแอลกอฮอล์ของกรดอะมิโนและโพลีเปปไทด์

กิจกรรม (PA) แสดงโดยจำนวนมิลลิกรัมของเอมีนไนโตรเจนที่เกิดขึ้นระหว่างการไฮโดรไลซิสของสารละลายเจลาติน 5% จำนวนหนึ่งโดยมีค่า pH จาก 7.3 ถึง 7.5 1 กรัมของยาหรือ 1 ซม. 3 ของสารละลายเอนไซม์ใน เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิ 40 องศาเซลเซียส

หน่วยของกิจกรรมโปรตีโอไลติกคือปริมาณของเอนไซม์ที่ผลิตเอมีนไนโตรเจน 1 มก. ใน 1 ชั่วโมงภายใต้เงื่อนไขการทดลองที่เป็นที่ยอมรับ

^ วัสดุและรีเอเจนต์: เอทิลแอลกอฮอล์ 96%; สารละลายไทมอลธาทาลีน 1%; 0.1 N สารละลาย NaOH; สารตั้งต้น – สารละลายเจลาติน 5%; สารสกัดจากพืชที่วิเคราะห์

การเตรียมสารสกัดเพื่อตรวจสอบกิจกรรมโปรตีโอไลติก: วางตัวอย่างวัสดุพืช 0.25 กรัมในปูนพอร์ซเลนและบดเป็นเวลา 2.5 นาทีด้วยบัฟเฟอร์ฟอสเฟต 2.5 มล. (pH = 7.3) จากนั้นมวลจะถูกกรอง

การเตรียมสารละลายเจลาติน 5% (สารตั้งต้น): เจลาติน 5 กรัมแช่ไว้ล่วงหน้าในถ้วยแก้วในน้ำกลั่น 15...20 ซม. 3 เป็นเวลา 20...30 นาที โปรตีนที่บวมจะถูกเทลงในสารละลายบัฟเฟอร์ 20...25 ซม. 3 ที่อุณหภูมิ 70 ถึง 80 ° C แล้วผสมให้เข้ากันกับแท่งแก้ว ส่วนที่ละลายแล้วจะถูกเทลงในขวดวัดปริมาตรขนาด 100 ซม. 3 จากนั้นเติมสารละลายบัฟเฟอร์อีก 20...25 ซม. 3 ลงในส่วนที่ยังไม่ละลาย และสารละลายที่ได้จะถูกถ่ายโอนไปยังขวดเดิมอีกครั้ง สารละลายเจลาตินที่ถูกทำให้เย็นลงถึง 40 °C จะถูกนำไปทำเครื่องหมายด้วยสารละลายบัฟเฟอร์ที่มีอุณหภูมิเท่ากัน สารละลายเจลาตินที่เตรียมไว้จะถูกเก็บไว้ในตู้เย็นที่อุณหภูมิ 2 ถึง 5 °C และใช้ในการวิเคราะห์ภายในสองวัน ก่อนการวิเคราะห์ สารละลายเจลาตินจะถูกให้ความร้อนจนถึงอุณหภูมิ 40 °C ในอ่างน้ำ

อุปกรณ์:ขวดทรงกรวยที่มีปริมาตร 200 ถึง 250 มล., ขวดปริมาตรที่มีปริมาตร 50 มล., แท่งแก้ว, ปิเปต, บิวเรต, เทอร์โมสตัท

^ ความคืบหน้าการทำงาน.ต่อสารละลายเจลาติน 5% 10 ซม. 3 ที่มีค่า pH ตั้งแต่ 7.3 ถึง 7.5 ให้เติมสารละลายเอนไซม์ทดสอบ 2 ซม. 3 แล้วนำส่วนผสมปฏิกิริยา 1 ซม. 3 ลงในขวดทรงกรวยที่มีความจุ 50 ถึง 100 ทันที ซม. 3 โดยที่เท 20 ซม. 3 96% เอทิลแอลกอฮอล์และ 0.2 ซม. 3 1% ไทมอลธาทาลีน ตัวอย่างจะถูกไตเตรทด้วยสารละลาย NaOH 0.1 N จนกระทั่งเป็นสีน้ำเงิน

ส่วนผสมเจลาตินที่เหลือกับสารละลายเอนไซม์จะถูกวางไว้ในเทอร์โมสตัทที่มีอุณหภูมิ 40 °C สำหรับการไฮโดรไลซิส หลังจากผ่านไป 3 ชั่วโมง ให้นำส่วนผสมของปฏิกิริยา 1 ซม. 3 ลงในขวดที่สองซึ่งมีความจุ 50 ถึง 100 ซม. 3 โดยให้เอทิลแอลกอฮอล์ 96% 20 ซม. 3 และไทมอลฟ์ทาลีน 0.2 ซม. 3 ของ 1% ลงไปก่อน ตัวอย่างจะถูกไทเทรตเช่นเดียวกับในกรณีของตัวแปรควบคุม

การคำนวณกิจกรรมโปรตีโอไลติกของ PS ดำเนินการโดยใช้สูตร:

,

โดยที่ A คือปริมาณเอมีนไนโตรเจนที่สะสมระหว่างการทดลองจากตัวกลางปฏิกิริยา, มล.

T – ระยะเวลาของโปรตีโอไลซิส, h;

P คือสัมประสิทธิ์ที่คำนึงถึงการเจือจางและการแปลงเป็นยา 1 กรัมหรือสารละลายเอนไซม์เหลว 1 ซม. 3

ค่า A คำนวณโดยใช้สูตร:

,

โดยที่ a คือปริมาณของสารละลาย NaOH 0.1 N ที่ใช้สำหรับการไตเตรทตัวอย่างทดลอง 1 ซม. 3, ซม. 3;

และถึง – เหมือนกันสำหรับตัวอย่างควบคุม

1.4 – ปัจจัยการแปลงของปริมาณสารละลายอัลคาไล 0.1 N เป็นไนโตรเจนของกรดอะมิโนและโพลีเปปไทด์เป็นมิลลิกรัม

K – การแก้ไขไทเทอร์อัลคาไล

การกำหนดกิจกรรมของตัวเร่งปฏิกิริยา

(อ้างอิงจาก A.N. Bach และ A.I. Oparin)

Oxidoreductases เป็นเอนไซม์ประเภทหนึ่งที่กระตุ้นปฏิกิริยารีดอกซ์ ออกซิเดชันของโมโนเมอร์ที่เกิดขึ้นระหว่างแคทาบอลิซึมของโพลีเมอร์เป็นกระบวนการที่ซับซ้อนหลายขั้นตอน

การเกิดออกซิเดชันของสารในเซลล์ส่วนใหญ่เกิดขึ้นโดยการกำจัดไฮโดรเจน (ดีไฮโดรจีเนชัน) หรือการกำจัดอิเล็กตรอน หรือโดยการเติมออกซิเจนเข้าไปในโมเลกุลของสารประกอบที่ถูกออกซิไดซ์

ตัวรับไฮโดรเจนในดีไฮโดรจีเนสคือ NAD +, NADP, FAD และ FMN ในฟลาวินบางชนิด - ออกซิเจน (เรียกว่าออกซิเดส) ในสารที่มีฮีม (เปอร์ออกซิเดสและคาตาเลส) - H 2 O 2 (ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์)

ตัวรับและพาหะของอิเล็กตรอนคือไซโตโครมที่มีฮีม (ฮีโมโปรตีน)

คาตาเลส (EC 1.11.1.6) เป็นของฮีโมโปรตีน เร่งกระบวนการทำลายไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ซึ่งเป็นพิษต่อเซลล์ให้กลายเป็นน้ำและออกซิเจน: 2 H 2 O 2 = 2 H 2 O + O 2

สำหรับเซลล์ที่มีชีวิต ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์เป็นพิษร้ายแรง ดังนั้นเอนไซม์ทั้งหมดที่สร้างและทำให้ H 2 O 2 เป็นกลางจึงอยู่ในเปอร์รอกซิโซม - ออร์แกเนลล์ที่หุ้มด้วยเมมเบรน ผู้บริโภคหลักของ H 2 O 2 คือเปอร์ออกซิเดส (EC 1.11.1.7.) ซึ่งออกซิไดซ์ฟีนอลเอมีนสารประกอบเฮเทอโรไซคลิกและสารตั้งต้นอื่น ๆ โดยการดีไฮโดรจีเนชันถ่ายโอนสิ่งเหล่านั้นที่ถูกกำจัดออกจากสารตั้งต้นไปยัง H 2 O 2 โดยลดลงเหลือ 2 H 2 O. โมเลกุลไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ที่ไม่มีการอ้างสิทธิ์โดยเปอร์ออกซิเดสจะถูกทำให้เป็นกลางโดยตัวเร่งปฏิกิริยา

วิธีการระบุกิจกรรมของตัวเร่งปฏิกิริยานั้นขึ้นอยู่กับการหาปริมาณของไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ที่สลายตัวในระหว่างการฟักตัวด้วยเอนไซม์ ปริมาณของ H 2 O 2 ในส่วนผสมของปฏิกิริยาถูกกำหนดโดยการไตเตรทเข้า สภาพแวดล้อมที่เป็นกรดสารละลายที่มีความเข้มข้นของโพแทสเซียมเปอร์แมงกาเนต 0.02 โมล/ลิตร:

5 H 2 O 2 + 2KMnO 4 + 3H 2 SO 4 = 2MnSO 4 + K 2 SO 4 + 5O 2 +8H 2 O

จากสมการปฏิกิริยาข้างต้น สามารถคำนวณได้ว่าสารละลาย 1 มิลลิลิตรที่มีความเข้มข้นของโพแทสเซียมเปอร์แมงกาเนต 0.02 โมล/ลิตร สอดคล้องกับไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ 1.7 มก. (50 ไมโครโมล)

ความก้าวหน้าของการทำงาน มันฝรั่งดิบ 2-3 กรัม (หรือวัสดุจากพืชสดอื่น ๆ) บดให้ละเอียดในครกด้วยทรายควอทซ์หรือแก้ว เพื่อลดปฏิกิริยาที่เป็นกรด ให้เติม CaCO 3 ที่ปลายมีดผ่าตัดจนกระทั่งฟอง CO 2 หายไป ในระหว่างขั้นตอนการบด ให้เติมน้ำ 40-50 มิลลิลิตรในส่วนเล็กๆ ลงในครก มวลดินจะถูกถ่ายโอนในเชิงปริมาณลงในขวดวัดปริมาตรขนาด 100 มล. ปรับตามเครื่องหมายด้วยน้ำแล้วผสม ทิ้งส่วนผสมไว้ประมาณ 10-15 นาที แล้วกรองออกหลังจากคนให้เข้ากัน

นำขวดทรงกรวยสองขวดที่มีความจุ 150-200 มล. แล้วเติมผลการกรอง 20 มล. ลงไป ต้มของเหลวในขวดหนึ่งเป็นเวลา 1 นาทีและทำให้เย็นลงจนถึงอุณหภูมิห้อง (ควบคุม) ขวดทดลองอีกขวดหนึ่งมีเอนไซม์ที่ทำงานอยู่ เติมน้ำ 20 มล. และสารละลาย 3 มล. ลงในขวดทดสอบและขวดควบคุม เศษส่วนมวลเอช 2 โอ 2 1% เนื้อหาผสมให้เข้ากันแล้วทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 30 นาที ในตอนท้ายของการบ่มสารละลาย 5 มล. ที่มีเศษส่วนมวลของกรดซัลฟิวริก 10% จะถูกเติมลงในขวดทั้งสองผสมและ H 2 O 2 ส่วนเกินในแต่ละขวดจะถูกไตเตรทด้วยสารละลายที่มีความเข้มข้นของโพแทสเซียมเปอร์แมงกาเนต 0.02 โมล/ลิตร จนกระทั่งเกิดเป็นสีชมพู ซึ่งจะไม่หายไปภายใน 1 นาที

กิจกรรมของคาตาเลสแสดงเป็น µmol ของไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ที่แยกย่อยโดยเอนไซม์ต่อ 1 กรัมของวัสดุทดสอบ (หรือต่อสารสกัด 1 มก.) ต่อ 1 นาที การคำนวณดำเนินการตามสูตร:

ที่ไหน เอ็กซ์– กิจกรรมของตัวเร่งปฏิกิริยา, E/g;

(ก-ข)– ผลต่างระหว่างปริมาตรของสารละลายที่มีความเข้มข้นของโพแทสเซียมเปอร์แมงกาเนต 0.02 โมล/ลิตร ใช้สำหรับการไทเทรตตัวควบคุม (ก)และมีประสบการณ์ (ข)ตัวอย่างมล.

ต– การไตเตรทของสารละลายโพแทสเซียมเปอร์แมงกาเนตที่ใช้สำหรับการไตเตรท

50 – ปัจจัยการแปลงต่อ µmol H 2 O 2;

100 – ปริมาตรรวมของสารสกัดที่เตรียมไว้

ม. – มวลของวัสดุที่นำมาวิเคราะห์ g;

20 – ปริมาตรของการกรองที่นำมาวิเคราะห์, มล.;

30 – เวลาฟักตัว, นาที.

หลักการกำหนด ขั้นตอนการวิเคราะห์ และผลการวิเคราะห์จะถูกบันทึก

กิจกรรมของคาตาเลสสามารถกำหนดได้จากปริมาตรของออกซิเจนที่ปล่อยออกมาหลังจากเติม H 2 O 2 ให้กับวัตถุทดสอบ

หลักการนี้ใช้เพื่อกำหนดกิจกรรมของคาตาเลสในนมแสดงด้วยเลขคาตาเลสซึ่งเป็นปริมาตรของออกซิเจน (มล.) ที่ปล่อยออกมาใน 2 ชั่วโมงที่ 25 ° C จากสารละลาย 5 มก. โดยมีเศษส่วนมวล H 2 O 2 1% เติมนม 15 มล. นมที่ได้จากสัตว์ที่มีสุขภาพดีจะปล่อยออกซิเจน 0.7-2.5 มิลลิลิตรเช่น จำนวนตัวเร่งปฏิกิริยาของนมธรรมชาติไม่เกิน 2.5 นมที่ได้จากสัตว์ป่วย (โรคเต้านมอักเสบ ฯลฯ) และน้ำนมเหลืองมีจำนวนตัวเร่งปฏิกิริยาเพิ่มขึ้นถึง 15 ตัว

รีเอเจนต์ น้ำกลั่น แคลเซียมคาร์บอเนต (ผง); สารละลายที่มีความเข้มข้นของโพแทสเซียมเปอร์แมงกาเนต 0.02 โมล/ลิตร สารละลายที่มีเศษส่วนมวล: ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ 1% (สารละลาย 10 มล. ที่มีเศษส่วนมวล H 2 O 2 30% เจือจางด้วยน้ำถึง 300 มล.), กรดซัลฟิวริก 10%

คำถามทดสอบ

1. เส้นทางหลักในการออกซิเดชั่นของสารตั้งต้นในเซลล์

2. ลักษณะของโครงสร้างและการออกฤทธิ์ของดีไฮโดรจีเนสที่ขึ้นกับ NAD + - และ NADP

3. ลักษณะของโครงสร้างและการออกฤทธิ์ของดีไฮโดรจีเนสที่ขึ้นกับ FAD

4. เอนไซม์ชนิดใดที่เรียกว่าออกซิเดส? ปัจจัยร่วมของพวกเขา

5. ลักษณะของโครงสร้างและการออกฤทธิ์ของเปอร์ออกซิเดสและตัวเร่งปฏิกิริยา

6. ลักษณะของโครงสร้างและการออกฤทธิ์ของไซโตโครม

7. เคมี การก่อตัว และวิธีการทำให้ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์เป็นกลางในเซลล์

8. วิธีการกำหนดกิจกรรมของตัวเร่งปฏิกิริยา

№	ชื่อหัวข้อห้องปฏิบัติการ	จำนวนชั่วโมง
	การเพาะเลี้ยงจุลินทรีย์โดยวิธีพื้นผิวบนอาหารเลี้ยงเชื้อที่เป็นของแข็ง
	การสกัดเอนไซม์ที่ปลูกบนพื้นผิว
	การเพาะเลี้ยงจุลินทรีย์แบบลึก
	การกำหนดกิจกรรมของมอลต์อะไมเลส
	การเตรียมเอนไซม์และการแปรรูปเยื่อกระดาษ
	การหาความเหมาะสมของชีสในนมโดยการทดสอบเรนเนต
	ตรวจหาการปนเปื้อนของแบคทีเรียในนม
	ศึกษาอิทธิพลของการให้ความร้อนต่อคุณสมบัติของนม
	ทั้งหมด:

เอนไซม์

เอนไซม์เป็นตัวเร่งปฏิกิริยาทางชีวภาพที่มีลักษณะเป็นโปรตีน สร้างขึ้นจากเซลล์ที่มีชีวิตและมีความสามารถในการกระตุ้นสารประกอบทางเคมีต่างๆ

กลไกการออกฤทธิ์ของเอนไซม์เช่นเดียวกับตัวเร่งปฏิกิริยาอื่น ๆ นั้นสัมพันธ์กับพลังงานกระตุ้นที่ลดลงซึ่งต้องผ่าน ปฏิกิริยาเคมีโดยขับไปในวงเวียนผ่านปฏิกิริยาขั้นกลางที่ต้องใช้พลังงานกระตุ้นที่ต่ำกว่ามาก ดังนั้นปฏิกิริยา AB A + B เมื่อมีเอนไซม์เกิดขึ้นดังนี้: AB + F → AVF; AVF→A+VF; วีเอฟ→วี+เอฟ

เอนไซม์ทั้งหมดแบ่งออกเป็นสองชั้นใหญ่: ส่วนประกอบเดียวและสองส่วนประกอบ

คลาสแรกประกอบด้วยเอนไซม์ที่ประกอบด้วยโปรตีนที่มีคุณสมบัติในการเร่งปฏิกิริยาเท่านั้น และคลาสที่สองประกอบด้วยเอนไซม์ที่ประกอบด้วยโปรตีนและส่วนที่ไม่ใช่โปรตีนที่เกี่ยวข้องซึ่งเรียกว่ากลุ่มแอคทีฟ คำว่าโคเอ็นไซม์หรือกลุ่มเทียมมักใช้เพื่อตั้งชื่อกลุ่มแอคทีฟของเอนไซม์สององค์ประกอบ ในเอนไซม์ที่มีองค์ประกอบเดียว บทบาทของกลุ่มที่ออกฤทธิ์จะดำเนินการโดยกลุ่มเคมีบางกลุ่มที่รวมอยู่ในโปรตีน กลุ่มเหล่านี้เรียกว่าศูนย์แอคทีฟหรือตัวเร่งปฏิกิริยา

คุณสมบัติของเอนไซม์ชนิดหนึ่งที่แตกต่างจากคุณสมบัติ ตัวเร่งปฏิกิริยาอนินทรีย์คือความสามารถที่ยอดเยี่ยม - ขึ้นอยู่กับอิทธิพลหลายประการ: ความเข้มข้นของไอออนไฮโดรเจน, อุณหภูมิ, สภาวะรีดอกซ์, ความเข้มข้นของสารประกอบบางชนิด (ผลิตภัณฑ์เมตาบอลิซึม), ไอออนของโลหะ ฯลฯ

อันที่สองมันมาก คุณสมบัติที่สำคัญการกระทำของตัวเร่งปฏิกิริยาของเอนไซม์คือมีความเฉพาะเจาะจงอย่างเคร่งครัด กล่าวคือ การกระทำของเอนไซม์มุ่งเป้าไปที่พันธะเคมีที่เฉพาะเจาะจงมาก

ตามลักษณะของปฏิกิริยาเร่งปฏิกิริยา เอนไซม์แบ่งออกเป็น 6 คลาส:

1) oxidoreductases หรือเอนไซม์รีดอกซ์

2) การถ่ายโอนเช่น ถ่ายโอนเอนไซม์เร่งปฏิกิริยา กลุ่มต่างๆอะตอมจากโมเลกุลหนึ่งไปยังอีกโมเลกุลหนึ่ง

3) ไฮโดรเลสที่กระตุ้นปฏิกิริยาไฮโดรไลติก

4) ไลเอส - เอนไซม์ที่แยกกลุ่มหนึ่งหรืออีกกลุ่มออกจากสารตั้งต้น (ไม่ใช่โดยการไฮโดรไลซิส) เพื่อสร้างพันธะคู่หรือในทางกลับกันเพิ่มเข้าไปในพันธะคู่

5) ไอโซเมอเรส เช่น เอนไซม์ที่กระตุ้นปฏิกิริยาไอโซเมอไรเซชัน สารประกอบอินทรีย์;

6) ligases หรือ synthetases - เอนไซม์ที่กระตุ้นปฏิกิริยาสังเคราะห์อยู่ในคลาสนี้

แต่ละคลาสเหล่านี้แบ่งออกเป็นคลาสย่อย และคลาสหลังเหล่านี้ก็แบ่งออกเป็นกลุ่มเล็ก ๆ

ในทุกขั้นตอนของการแปรรูปเมล็ดพืชเป็นแป้งระหว่างการเก็บรักษาตลอดจนระหว่างการเตรียมแป้งและขนมปังอบกิจกรรมของเอนไซม์ไฮโดรไลติกและออกซิเดชั่นจะปรากฏในระดับมากหรือน้อยซึ่งมีผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญต่อคุณภาพของ ผลิตภัณฑ์

ในเมล็ดพืช เอนไซม์จะบรรจุอยู่ในเนื้อเยื่อของเอ็มบริโอ ชั้นอะลูโรน และเอนโดสเปิร์ม สิ่งเหล่านี้เป็นลักษณะของการดำรงชีวิต เซลล์พืชเอนไซม์ที่กำหนดหน้าที่เฉพาะในกระบวนการเผาผลาญ

จากเอนไซม์หลายชนิดที่พบในธัญพืช มีเพียงเอนไซม์ที่มีหรืออาจส่งผลต่อคุณภาพของผลิตภัณฑ์แปรรูปธัญพืชเท่านั้นที่ได้รับการศึกษาอย่างละเอียด เหล่านี้รวมถึงอะไมเลส, โปรตีเอส, ไลเปส, ไลโปซีเจเนส, โพลีฟีนอลออกซิเดส ฯลฯ ในเวลาเดียวกันพบว่าเอนไซม์จากเมล็ดพืชบางชนิดสามารถเป็นตัวบ่งชี้ที่ดีเกี่ยวกับสถานะทางสรีรวิทยาของมันได้ ดังนั้นตัวเร่งปฏิกิริยาซึ่งมีความร้อนสูงจึงสะท้อนถึงการงอกที่ลดลงระหว่างการอบแห้งเมล็ดพืชได้ดี และกิจกรรมของมันสามารถทำหน้าที่เป็นตัวบ่งชี้ในการติดตามกระบวนการทำให้แห้ง

ขนาดใหญ่เป็นพิเศษ ความสำคัญทางชีวภาพอะไมเลสในระหว่างการทำให้เมล็ดสุกและการงอกรวมทั้งในจำนวนหนึ่ง กระบวนการทางเทคโนโลยีการผลิตอาหารโดยอาศัยกระบวนการไฮโดรไลติกของแป้งภายใต้อิทธิพลของอะไมเลสของเมล็ดพืช

เมล็ดธัญพืชมีเอนไซม์เฉพาะ 2 ชนิดที่ทำให้เกิดการไฮโดรไลซิสของแป้ง ได้แก่

1) -1,4 - กลูแคนไฮโดรเลสหรือαα-amylase, ไฮโดรไลซ์α-1,4 - พันธะกลูแคนของแป้งและโพลีแซ็กคาไรด์ที่เกี่ยวข้องและพันธะเหล่านี้จะถูกทำลายแบบสุ่ม

2) -1,4 - กลูแคนมอลโตไฮโดรเลสหรือαβ - อะไมเลส, ไฮโดรไลซ์α-1,4 - พันธะกลูแคนในโพลีแซ็กคาไรด์, แยกมอลโตสตกค้างตามลำดับจากปลายที่ไม่ลดของโซ่

แม้ว่าโปรตีเอสจะมีความสำคัญไม่น้อยสำหรับเทคโนโลยี แต่ก็มีการศึกษาน้อยกว่าอะไมเลสมาก เหตุผลก็คือวิธีการคลาสสิกในการศึกษาโปรตีเอสของสัตว์ (เอนไซม์ที่ไฮโดรไลซ์โปรตีน) กลับกลายเป็นว่าไม่ได้ผลในการศึกษา เอนไซม์โปรตีโอไลติกธัญพืช ภายใต้อิทธิพลของโปรตีเอสกลูเตนเหลวซึ่งในทางกลับกันทำให้คุณภาพของขนมปังอบลดลง

ไลเปสทำให้เกิดการไฮโดรไลซิสของไขมันเช่น แยก เอสเทอร์กลีเซอรอลที่มีการก่อตัวของกรดไขมันอิสระส่งผลให้ธัญพืชและแป้งมีความเป็นกรดเพิ่มขึ้น

ด้วยการมีส่วนร่วมของ lipoxygenase จะเกิดปฏิกิริยาออกซิเดชันของกรดไขมันไม่อิ่มตัวและเกิดสารประกอบคาร์บอนิลและคาร์บอกซิลน้ำหนักโมเลกุลต่ำซึ่งมี กลิ่นอันไม่พึงประสงค์และมีรสขม กระบวนการนี้เรียกว่าความหืนของไขมัน (แป้ง)

งานห้องปฏิบัติการหมายเลข 1

เรื่อง:การเพาะเลี้ยงจุลินทรีย์โดยวิธีพื้นผิวบนอาหารเลี้ยงเชื้อที่เป็นของแข็ง

วัตถุประสงค์ของงาน:การเพิ่มผู้ผลิตเอนไซม์ต่างๆ บนตัวกลางที่เป็นเม็ดแข็ง และการวิเคราะห์ผลการเพาะเลี้ยงสำหรับกิจกรรมของเอนไซม์ที่มีอยู่

วิธีการเพาะเลี้ยงพื้นผิว- การเพาะเลี้ยงแอโรบิกบนพื้นผิวนั้นดำเนินการบนอาหารที่มีความหนาแน่นหรือหลวมเช่นเดียวกับในชั้นบาง ๆ ของอาหารเหลวในภาชนะแก้วที่มีก้นกว้าง: จานเพาะเชื้อ, ขวด Winogradsky, ที่นอน, คูเวต ภาชนะเพาะเมล็ดจะเติบโตที่อุณหภูมิคงที่ในเทอร์โมสตัทหรือห้องควบคุมอุณหภูมิ (ห้องทำความร้อน) จุลินทรีย์พัฒนาบนพื้นผิวของตัวกลางและใช้ออกซิเจนโดยตรงจากอากาศ ในสื่อของเหลว แอโรบิกบังคับจะเติบโตในรูปของฟิล์มจำนวนมาก แอโรบีแบบปัญญา (แอนแอโรบี) พัฒนาทั้งในความหนาของตัวกลางของเหลว ก่อตัวเป็นสารแขวนลอย สะเก็ด ตะกอน และบนพื้นผิวในรูปของฟิล์มบาง ๆ บนสื่อที่มีความหนาแน่นสูง จุลินทรีย์จะเติบโตในรูปแบบของอาณานิคมเดี่ยวหรือในสนามหญ้าที่ต่อเนื่องกัน การเพาะปลูกภาคพื้นดินใน สภาพห้องปฏิบัติการใช้กันอย่างแพร่หลายเพื่อให้ได้สะสมและ วัฒนธรรมที่บริสุทธิ์การเก็บรักษา การศึกษาลักษณะทางสัณฐานวิทยา วัฒนธรรม และชีวเคมีของจุลินทรีย์ ในอุตสาหกรรม วิธีการเพาะเลี้ยงพื้นผิวในตัวกลางของเหลวใช้ในการผลิตกรดซิตริก และในตัวกลางจำนวนมากสำหรับการผลิตการเตรียมเอนไซม์

1. การเตรียมจานและการฆ่าเชื้อ

2. การเตรียมสารอาหารและการฆ่าเชื้อ

3. การคำนวณปริมาณน้ำที่ต้องใช้ในการหล่อเลี้ยงสารอาหาร

4. ให้ความชุ่มชื้นแก่สารอาหารที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว เพาะเชื้อและวางไว้ในคิวเวตต์เพื่อการเพาะปลูก

1.เตรียมจานสำหรับการฆ่าเชื้อ อุปกรณ์ทั้งหมดต้องล้างให้สะอาดและทำให้แห้งในตู้อบแห้งก่อนนำไปฆ่าเชื้อ

สำหรับการฆ่าเชื้อ อุปกรณ์ต่อไปนี้ควรห่อด้วยกระดาษและผูกด้วยเชือกอย่างระมัดระวัง: คิวเวตต์ หรือฝาปิดคิวเวตต์

ควรฆ่าเชื้ออาหารและน้ำในหม้อนึ่งความดันที่อุณหภูมิ 120°C เป็นเวลา 0.5 ชั่วโมง

หลังจากการนึ่งฆ่าเชื้อ ควรอบเครื่องแก้วปลอดเชื้อในเตาอบที่อุณหภูมิ 105 องศาเซลเซียส เนื่องจากกระดาษจะชื้นเล็กน้อยระหว่างการฆ่าเชื้อ

2. การเตรียมและการฆ่าเชื้อสารอาหาร สำหรับจุลินทรีย์แต่ละตัว อาหารเลี้ยงเชื้อในตัวมันเองจะถูกเตรียมเพื่อให้แน่ใจว่าการสังเคราะห์ทางชีวภาพของเอนไซม์บางชนิดจะถูกฆ่าเชื้อแยกกัน สื่อที่เตรียมไว้จะใส่ในถุงหรือผ้ากอซหลายชั้นหรือในบีกเกอร์แก้วกว้าง สำหรับงูเห่า ตัวอย่างเช่น oryzae มีการใช้สารอาหารประเภทต่อไปนี้: รำข้าวสาลี - 100.70; มอลต์งอก - 30; เนื้อบีทรูท-50; องุ่นมาร์ค-20; มอลต์งอก - 50; แกลบ-50.

3. สำหรับ การพัฒนาตามปกติเชื้อราด้วยกล้องจุลทรรศน์และการก่อตัวของเอนไซม์อย่างเข้มข้นจำเป็นที่สภาพแวดล้อมจะมีความชื้น 58-63%

ปริมาณน้ำที่เพิ่มคำนวณโดยใช้ข้อมูลต่อไปนี้:

Acp คือมวลของสารอาหารที่มีความชื้นเริ่มต้น

Ср - มวลของสารอาหารที่มีความชื้นที่ต้องการ

Gsr คือมวลของสารอาหารหลังการฆ่าเชื้อ

D คือปริมาณน้ำที่ต้องเติมเพื่อให้ได้สารอาหารตามความชื้นที่ต้องการ

งานห้องปฏิบัติการหมายเลข 2

เรื่อง:การสกัดเอนไซม์ที่ปลูกบนพื้นผิว

วัตถุประสงค์ของงาน:สามารถเพาะเลี้ยงจุลินทรีย์โดยใช้วิธีพื้นผิวบนอาหารที่เป็นของแข็งได้

วิธีการสกัดวัฒนธรรมพื้นผิว- การเพาะเลี้ยงแอโรบิกบนพื้นผิวนั้นดำเนินการบนอาหารที่มีความหนาแน่นหรือหลวมเช่นเดียวกับในชั้นบาง ๆ ของอาหารเหลวในภาชนะแก้วที่มีก้นกว้าง: จานเพาะเชื้อ, ขวด Winogradsky, ที่นอน, คูเวต ภาชนะเพาะเมล็ดจะเติบโตที่อุณหภูมิคงที่ในเทอร์โมสตัทหรือห้องควบคุมอุณหภูมิ (ห้องทำความร้อน) จุลินทรีย์พัฒนาบนพื้นผิวของตัวกลางและใช้ออกซิเจนโดยตรงจากอากาศ ในสื่อของเหลว แอโรบีบังคับจะเติบโตในรูปของฟิล์มจำนวนมาก แอโรบีแบบปัญญา (แอนแอโรบี) พัฒนาทั้งในความหนาของตัวกลางของเหลว ก่อตัวเป็นสารแขวนลอย สะเก็ด ตะกอน และบนพื้นผิวในรูปของฟิล์มบาง ๆ บนสื่อที่มีความหนาแน่นสูง จุลินทรีย์จะเติบโตในรูปแบบของอาณานิคมเดี่ยวหรือในสนามหญ้าที่ต่อเนื่องกัน การเพาะเลี้ยงพื้นผิวในห้องปฏิบัติการมีการใช้กันอย่างแพร่หลายเพื่อให้ได้มาซึ่งวัฒนธรรมบริสุทธิ์ การเก็บรักษา และการศึกษาลักษณะทางสัณฐานวิทยา วัฒนธรรม และชีวเคมีของจุลินทรีย์ ในอุตสาหกรรม วิธีการเพาะเลี้ยงพื้นผิวในตัวกลางของเหลวใช้ในการผลิตกรดซิตริก และในตัวกลางจำนวนมากสำหรับการผลิตการเตรียมเอนไซม์

ในงานห้องปฏิบัติการนี้จะสะดวกที่สุดในการใช้เชื้อราด้วยกล้องจุลทรรศน์หรือจุลินทรีย์ที่มีลักษณะคล้ายยีสต์ เช่น Asp niger ร. เดเลมาร์ และคณะ

งานห้องปฏิบัติการหมายเลข 3

เรื่อง:การเพาะเลี้ยงจุลินทรีย์ด้วยวิธีเชิงลึก

วัตถุประสงค์ของงาน:สามารถเพาะเลี้ยงจุลินทรีย์ได้แบบเจาะลึก

การเพาะปลูกแบบลึก การเพาะเลี้ยงจุลินทรีย์แบบลึกอาจเป็นแบบเป็นระยะหรือต่อเนื่องก็ได้ ในกระบวนการเป็นระยะ ปริมาตรทั้งหมดของสารอาหารจะถูกหว่านด้วยวัสดุเมล็ดและการเพาะปลูกจะดำเนินการภายใต้สภาวะที่เหมาะสมในช่วงระยะเวลาหนึ่งจนกระทั่งเกิดการสะสม ปริมาณที่ต้องการชีวมวลหรือผลิตภัณฑ์เป้าหมาย เพื่อให้แน่ใจว่าการเจริญเติบโตของการเพาะเลี้ยงแอโรบิกในชั้นของเหลวลึก จะต้องจัดหาออกซิเจน เนื่องจากเซลล์จุลินทรีย์สามารถใช้เฉพาะออกซิเจนที่ละลายน้ำได้และมีความสามารถในการละลายต่ำ (4-7 มก./กรัม)

เรียบง่ายและ ในทางที่เข้าถึงได้การเพาะปลูกแบบลึกเป็นระยะคือการเพาะปลูกแบบแอโรบิกในสถานะแขวนลอยในตัวกลางของเหลวเทลงในหลอดทดลองและขวดในปริมาณเล็กน้อย

การเพาะปลูกเชิงลึกอย่างต่อเนื่องจะดำเนินการในถังหมักในห้องปฏิบัติการ กระบวนการเพาะปลูกอย่างต่อเนื่องในถังหมักจะดำเนินการในลักษณะของคีโมสแตทหรือเทอร์บิโดสแตท

วัตถุประสงค์ของงานนี้ คือ เพื่อเพิ่มผู้ผลิตเอนไซม์ต่างๆ บนตัวกลางสารอาหารเหลวในเชิงลึก และวิเคราะห์ผลการเพาะเลี้ยงจุลินทรีย์เพื่อหาปริมาณของเอนไซม์บางชนิดในเอนไซม์เหล่านั้น

เช่นเดียวกับงานห้องปฏิบัติการครั้งแรก จำเป็นต้องได้รับหัวเชื้อซึ่งเตรียมโดยการปลูกผู้ผลิตในหลายตอนบนอาหารเลี้ยงเชื้อในหลอดทดลองหรือที่นอน

ในงานห้องปฏิบัติการ นักเรียนเตรียมสารอาหารในปริมาณ 0.7 dm3 ขั้นแรก แก้วจะถูกชั่งน้ำหนักด้วยสเกลทางเทคนิค จากนั้นจึงชั่งน้ำหนักส่วนประกอบที่จำเป็นทั้งหมดของตัวกลางลงในแก้ว ส่วนประกอบของเหลวของตัวกลางวัดโดยปริมาตร

เกลือละลายโดยไม่มีข้อควรระวังพิเศษ แป้งหรือแป้งผสมในอัตราส่วน 1:10 ด้วย น้ำเย็นและต้มในอ่างน้ำเดือด

ความหลากหลายของสารอาหารสำหรับการเพาะเลี้ยงจุลินทรีย์ที่ผลิตเอนไซม์

ตารางที่ 1

ส่วนประกอบของอาหารเลี้ยงเชื้อ	ตัวเลือกสื่อสารอาหารและปริมาณส่วนประกอบ,%
งูเห่า. ออริแซ	0,3
สารสกัดจากข้าวโพด	0,3	0,4	2,0
แป้งถั่วเหลือง	0,5	4,0	2,0
แป้งข้าวโพด	2,0	-	0,5
ให้อาหารยีสต์	-	-	0,2
แคลเซียมคาร์บอเนต	-	0,1	0,2
เถ้า. บิตาเต้	1,0
กรองแอลกอฮอล์นิ่ง	98,3	96,8	-
แป้งข้าวโพด	1,5	-	0,2
แมกนีไซต์ทางเทคนิค	0,2	0,2	1,5
แป้งไรย์	-	2,5	1,0
สารสกัดจากข้าวโพด	0,2	0,5	1,0

สำหรับแต่ละตัวเลือก ให้ใช้ขวดสี่ใบ เทอาหารกลางที่เตรียมไว้ขนาด 120 ซม. 3 ลงในแต่ละขวด ปิดขวดด้วยจุกสำลีปิดฝาด้วยกระดาษหนาเพื่อไม่ให้ชื้นระหว่างการฆ่าเชื้อ พร้อมกับขวดโยก วางขวดที่มีตัวกลางขนาด 50 ซม. 3 ไว้เพื่อการฆ่าเชื้อเพื่อตรวจวัดค่า pH ในภายหลัง

การหาค่า pH ของตัวกลาง

ค่า pH ของสภาพแวดล้อมถูกกำหนดโดยวิธีอิเล็กโทรเมตริกสองครั้ง: ก่อนและหลังการฆ่าเชื้อ จะมีการดำเนินการตรวจวัดซ้ำสามครั้งในแต่ละครั้ง จากนั้นจึงวิเคราะห์ความน่าเชื่อถือของผลลัพธ์เหล่านี้

การฉีดวัคซีนของสารอาหาร

หลังจากการฆ่าเชื้อเสร็จสิ้นและเปิดหม้อนึ่งความดันแล้ว ให้วางปิเปตไว้ประมาณ 10-15 นาที ในเตาอบร้อนเพื่อให้กระดาษ ขวด และจานอื่น ๆ แห้งทิ้งไว้ในหม้อนึ่งความดันเป็นเวลา 10-15 นาที การฉีดสารอาหารตัวกลางจะดำเนินการในกล่อง

งานห้องปฏิบัติการหมายเลข 4

การกำหนดกิจกรรมของตัวเร่งปฏิกิริยา

คาตาเลสเป็นของเอนไซม์ชั้นหนึ่ง (ออกซิโดเรดักเตส) และเร่งปฏิกิริยาปฏิกิริยาการสลายตัวของไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ลงในน้ำและออกซิเจนตามสมการ:

คาตาเลสเล่น บทบาทที่สำคัญในชีวิตของสิ่งมีชีวิตเนื่องจากจะไปทำลายไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ซึ่งเป็นพิษต่อเซลล์ที่เกิดขึ้นระหว่างกระบวนการหายใจ

การกำหนดเชิงปริมาณของตัวเร่งปฏิกิริยาขึ้นอยู่กับการรวมไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์โดยการไตเตรทด้วยโพแทสเซียมเปอร์แมงกาเนต ปฏิกิริยาเป็นไปตามสมการ:

2KMnO 4 + 5H 2 O 2 + 4H 2 SO 4 2KHSO→ 4 + 2MnSO 4 + 8H 2 O + 5O 2

ปริมาณไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ที่ถูกทำลายโดยเอนไซม์จะตัดสินจากความแตกต่างในปริมาณ 0.1 mol/dm 3 สารละลาย KMnO 4 ที่ใช้สำหรับการไตเตรทในการทดลองควบคุมและการทดลองทำงาน

วัสดุทดสอบ:มอลต์ (เมล็ดงอก)

รีเอเจนต์:สารละลายไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ ω (H 2 O 2) = 1%

สารละลายกรดซัลฟิวริก ω (H 2 SO 4) = 10%

สารละลายโพแทสเซียมเปอร์แมงกาเนต C (1/5 KMnO 4) = 0.1 โมล/dm 3

ใส่วัสดุทดสอบ 5 กรัมที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 30 นาทีกับน้ำ 100 ซม. 3 โดยกวนสารในขวดเป็นระยะๆ หลังจากการแช่ ของเหลวจะถูกกรองผ่านตัวกรองแบบพับแห้ง และปิเปตขนาด 20 ซม. 3 สองส่วน (แบบทดลองหนึ่งอันและแบบควบคุมหนึ่งอัน) จะถูกปิเปตจากสารละลายใส และแต่ละส่วนจะถูกถ่ายโอนไปยังขวดทรงกรวยขนาด 200 ซม. 3 ที่แยกกัน ส่วนควบคุมจะถูกต้มเป็นเวลา 3 นาทีเพื่อหยุดการทำงานของเอนไซม์

เติมน้ำกลั่น 20 ซม. 3 และไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ 4 ซม. 3 ลงในตัวอย่างทดลองและควบคุม และทิ้งไว้ 20 นาทีที่อุณหภูมิห้องเพื่อให้เอนไซม์ออกฤทธิ์ หลังจากผ่านไป 20 นาที กรดซัลฟิวริก 5 ซม. 3 จะถูกเติมลงในตัวอย่าง และไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ที่เหลือ (ไม่สลายตัว) จะถูกไตเตรทด้วยสารละลายโพแทสเซียมเปอร์แมงกาเนต

กิจกรรมของคาตาเลสแสดงเป็นไมโครโมลของไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ที่สลายตัวโดยเอนไซม์ใน 1 นาทีต่อ 1 กรัมของวัสดุที่อยู่ระหว่างการศึกษา

กิจกรรมของคาตาเลสถูกกำหนดโดยสูตร:

โดยที่ X คือกิจกรรมตัวเร่งปฏิกิริยา

a คือปริมาณ 0.1 mol/dm 3 สารละลาย KMnO 4 ที่ใช้สำหรับการไทเทรตสารละลายควบคุม cm 3 ;

b คือปริมาณ 0.1 mol/dm 3 สารละลาย KMnO 4 ที่ใช้สำหรับการไทเทรตสารละลายทดลอง, cm 3 ;

K – การแก้ไข titer;

100 – ปริมาตรรวมของสารสกัด, cm3;

50 – ปัจจัยการแปลงเป็นไมโครโมล H 2 O 2;

20 – ปริมาตรของสารละลายเอนไซม์ cm 3;

20 – เวลาปฏิกิริยาของเอนไซม์, นาที;

P คือตัวอย่างของวัสดุทดสอบที่นำมาวิเคราะห์ g

งานห้องปฏิบัติการหมายเลข 5

วิธีการวัดสีเพื่อกำหนดกิจกรรมของα-และβ-amylase

ภายใต้การกระทำของอะไมเลสในพืช การไฮโดรไลซิสของคาร์โบไฮเดรตโพลีเมอร์สูง - แป้ง - เกิดขึ้นพร้อมกับการก่อตัวของเดกซ์ทรินและมอลโตส α-และβ-amylases พบได้ในพืช

การพิจารณาเชิงปริมาณแยกกันของกิจกรรมของ α- และ β-amylase ขึ้นอยู่กับความเสถียรทางความร้อนที่แตกต่างกัน: β-amylase ถูกทำลายโดยการให้ความร้อนถึง 70 °C ในขณะที่ α-amylase ยังคงทำงานอยู่

วิธีการระบุกิจกรรมของอะไมเลสจะขึ้นอยู่กับปริมาณน้ำตาลที่เกิดขึ้นระหว่างการทำงานของเอนไซม์กับแป้ง หรือโดยคำนึงถึงปริมาณของแป้งที่ไม่ถูกทำลายโดยเอนไซม์ ซึ่งจะถูกกำหนดโดยวิธีโฟโตเมตริกหลังการบำบัดด้วย สารละลายไอโอดีน

รีเอเจนต์:บัฟเฟอร์อะซิเตท pH 5.5;

สารละลายโซเดียมคลอไรด์ ω (NaCl) = 1%;

สารละลายแป้ง ω = 10% (แป้ง 2 กรัมผสมใน 20 ซม. 3 น้ำเย็นเทลงในน้ำเดือด 80 ซม. 3 จากนั้นให้ความร้อนในอ่างน้ำเดือดจนสารละลายหมด)

สารละลาย กรดไฮโดรคลอริก C(HCl) = 1 โมล/ลูกบาศก์เมตร 3

สารละลายกรดไฮโดรคลอริก C(HCl) =0.1 โมล/เดซิเมตร 3

สารละลายไอโอดีน ω = 0.3% ในสารละลายโพแทสเซียมไอโอไดด์ 3%

ตัวอย่างแป้งหรือถั่วงอก 0.5 - 1 กรัมบดในครกด้วยสารละลาย NaCl 1% จำนวนเล็กน้อย แล้วถ่ายโอนไปยังขวดทรงกรวยขนาด 50 ซม. 3 อัตราส่วนระหว่างตัวอย่างและสารละลาย NaCl คือ 1:10 หรือ 1:20 ส่วนผสมในขวดผสมให้เข้ากันแล้วปล่อยทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 30 นาที โดยเขย่าเป็นครั้งคราว จากนั้นกรองผ่านตัวกรองแบบจีบหนาแน่น สำหรับการกรองที่ยาก คุณสามารถรวมการกรองและการหมุนเหวี่ยงที่ 4,000-5,000 รอบต่อนาที สารละลายใสใช้เป็นการเตรียมเอนไซม์

ในการตรวจสอบกิจกรรมของα-และβ-amylase ให้ใช้หลอดทดลอง 4 หลอด (การทดลอง 2 อันและการควบคุม 2 อัน) แล้วเติมบัฟเฟอร์อะซิเตต 3 ซม. 3 และสารละลายแป้ง 2% 3 ซม. 3 ลงไป ส่วนผสมถูกให้ความร้อนในอ่างน้ำหรือในเทอร์โมสตัทจนถึงอุณหภูมิ 40°C จากนั้นเติมการเตรียมเอนไซม์ 0.2-1.0 ซม. 3 ลงในหลอดทดลอง (ขึ้นอยู่กับกิจกรรมของอะไมเลสในวัตถุประสงค์ของการศึกษา) และเติม H 2 O ในปริมาณเท่ากันลงในหลอดควบคุม ผสมและวางในเทอร์โมสตัทที่อุณหภูมิ 40 ° C เป็นเวลา 30 หรือ 60 นาที หลังจากการฟักตัว ให้เท 2 cm 3 1 N ลงในหลอดทดลองแต่ละหลอดทันที สารละลาย HCl เพื่อหยุดการทำงานของอะไมเลส

เพื่อระบุแป้งที่ไม่ทำปฏิกิริยากับเอนไซม์ จะทำปฏิกิริยากับไอโอดีน เทน้ำประมาณ 30 ซม. 3, 1 ซม. 3 ของ 0.1 N ลงในขวดวัดปริมาตรขนาด 50 ซม. 3 HCl หยดสารละลายไอโอดีน 0.3% 5 หยด และเติมส่วนผสม 0.5 ซม. 3 จากหลอดทดลองแต่ละหลอด สารที่อยู่ในขวดผสมกันอย่างดี นำไปทำเครื่องหมายด้วยน้ำและกำหนดสีด้วยโฟโตอิเล็กโตรคัลเลอร์ริมิเตอร์พร้อมฟิลเตอร์สีแดง หรือบนสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ที่ 595 นาโนเมตรในคิวเวตต์ที่มีความยาวใช้งาน 1 ซม.

เพื่อตรวจสอบกิจกรรมของ α-amylase นั้น ให้เทสารละลายกรอง 5 ซม. 3 (การเตรียมเอนไซม์) ลงในขวดรูปกรวยขนาด 100 ซม. 3 จากนั้นเติมแคลเซียมอะซิเตตแห้งที่ปลายมีดและเก็บไว้เป็นเวลา 15 นาทีในอุลตร้าเทอร์โมสแตทหรือใน อ่างน้ำที่อุณหภูมิ 70 ° C (อนุญาตให้มีความผันผวนของอุณหภูมิไม่เกิน 0.5 ° C) จากนั้นสารที่อยู่ในขวดจะถูกทำให้เย็นลงอย่างรวดเร็วในภาชนะที่มีน้ำเย็น ด้วยการให้ความร้อนนี้ β-amylase จะถูกปิดใช้งานอย่างสมบูรณ์ ในขณะที่ α-amylase ยังคงทำงานอยู่ จากนั้น การพิจารณากิจกรรมของ α-amylase จะลดลงตามขั้นตอนที่อธิบายไว้ข้างต้น

การทำงานของเอนไซม์ทั้งสองแสดงเป็นมิลลิกรัมของแป้งไฮโดรไลซ์ภายใต้สภาวะการทดลอง (30 นาทีหรือ 1 ชั่วโมง) ต่อแป้ง 1 กรัม (ถั่วงอก) กิจกรรมของ β-amylase ถูกกำหนดโดยความแตกต่างระหว่างกิจกรรมทั้งหมดของ α- และ β-amylases และกิจกรรมของ α-amylase กิจกรรมอะไมเลสต่อแป้ง 1 กรัมต่อ 1 ชั่วโมงคำนวณโดยใช้สูตรต่อไปนี้:

โดยที่ D คือความหนาแน่นเชิงแสงของโซลูชันควบคุม

D 1 - ความหนาแน่นทางแสงของสารละลายทดลอง

ก - ปริมาณแป้งที่เพิ่ม (60 มก.)

m คือมวลของตัวอย่าง g;

V คือปริมาตรของสารสกัดเอนไซม์เริ่มต้น cm 3

V 1 - ปริมาตรของสารสกัดที่นำมาฟัก, ซม. 3

งานห้องปฏิบัติการหมายเลข 6

©2015-2019 เว็บไซต์
สิทธิ์ทั้งหมดเป็นของผู้เขียน ไซต์นี้ไม่ได้อ้างสิทธิ์ในการประพันธ์ แต่ให้ใช้งานฟรี
วันที่สร้างเพจ: 2016-02-13

งานห้องปฏิบัติการหมายเลข 1

หัวข้อ: กิจกรรมการเร่งปฏิกิริยาของเอนไซม์ในเซลล์ที่มีชีวิต

เป้า:ระบุฟังก์ชันการเร่งปฏิกิริยาของโปรตีนในเซลล์ที่มีชีวิต พัฒนาความรู้เกี่ยวกับบทบาทของเอนไซม์ในเซลล์ รวบรวมความสามารถในการทำงานร่วมกับกล้องจุลทรรศน์ ทำการทดลอง และอธิบายผลการทำงาน อุปกรณ์:มันฝรั่งดิบและต้ม, ใบเอโลเดีย (พืชอื่น), สารละลายไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ 3% สด, หลอดทดลอง, แหนบ, ทราย, ครกและสาก, สมุดบันทึก, ปากกา, ดินสอ, ไม้บรรทัด

ความคืบหน้าการทำงาน:

เตรียมหลอดทดลองสองหลอด และวางทรายเล็กน้อยลงในหลอดแรก หลอดที่สองใส่มันฝรั่งดิบ และมันฝรั่งต้มสุกหนึ่งหลอดลงในหลอดที่สาม สังเกตสิ่งที่เกิดขึ้นในแต่ละหลอดทดลอง

บดมันฝรั่งดิบด้วยทรายเล็กน้อยในครก

ใส่มันฝรั่งบดพร้อมกับทรายลงในหลอดทดลอง และหยดไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ลงไปเล็กน้อย

เปรียบเทียบกิจกรรมของเนื้อเยื่อพืชที่ถูกบดและเนื้อเยื่อพืชทั้งหมด

จัดตารางแสดงการทำงานของเนื้อเยื่อแต่ละชนิดภายใต้การบำบัดที่แตกต่างกัน อธิบายผลลัพธ์ของคุณ ตอบคำถาม:

ข้อสังเกต

ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์และมันฝรั่งดิบ

ออกซิเจนจะถูกปล่อยออกมาทำให้โปรตีนแตกตัวลงไป โครงสร้างหลักและกลายเป็นโฟม

ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์และมันฝรั่งต้ม

ไม่มีปฏิกิริยา

ตอบคำถาม: กิจกรรมของเอนไซม์คาตาเลสปรากฏในหลอดทดลองใด? อธิบายว่าทำไม

คาตาเลสเป็นเอนไซม์ที่กระตุ้นปฏิกิริยาการสลายตัวของไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ให้เป็นน้ำและออกซิเจนโมเลกุล: H2O2 + H2O2 = O2 + 2H2O บทบาททางชีวภาพ K. ประกอบด้วยการย่อยสลายของไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ที่เกิดขึ้นในเซลล์อันเป็นผลมาจากการกระทำของฟลาโวโปรตีนออกซิเดสจำนวนหนึ่ง (แซนทีนออกซิเดส, กลูโคสออกซิเดส, โมโนเอมีนออกซิเดส ฯลฯ ) และให้การป้องกันที่มีประสิทธิภาพ โครงสร้างเซลล์จากการถูกทำลายภายใต้อิทธิพลของไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ การขาด K. ที่กำหนดทางพันธุกรรมเป็นหนึ่งในสาเหตุของสิ่งที่เรียกว่า acatalasia ซึ่งเป็นโรคทางพันธุกรรมที่แสดงออกทางคลินิกโดยการเป็นแผลของเยื่อเมือกของจมูกและช่องปากซึ่งบางครั้งการเปลี่ยนแปลงของแกร็นเด่นชัดในผนังกั้นถุงและการสูญเสียฟัน กิจกรรมปรากฏในหลอดทดลอง 1.3 เพราะ พวกเขามีอาหารดิบที่มีโปรตีน และในหลอดทดลองที่เหลือมีผลิตภัณฑ์ที่มีโปรตีนถูกทำลายระหว่างกระบวนการปรุงและไม่ปรากฏปฏิกิริยา ดังนั้นร่างกายจึงดูดซึมอาหารที่มีโปรตีนได้ดีขึ้น

กิจกรรมของเอนไซม์แสดงออกมาอย่างไรในเนื้อเยื่อที่มีชีวิตและเนื้อเยื่อที่ตายแล้ว?อธิบายปรากฏการณ์ที่สังเกตได้ ไม่มีการทำงานของเอนไซม์ในเนื้อเยื่อที่ตายแล้วเพราะว่า โปรตีนในนั้นถูกทำลายระหว่างการปรุงอาหาร และในเนื้อเยื่อของสิ่งมีชีวิต เมื่อมีปฏิกิริยากับไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ ออกซิเจนจะถูกปล่อยออกมา และโปรตีนเมื่อสลายตัวจนถึงโครงสร้างหลักก็กลายเป็นโฟม

การบดเนื้อเยื่อส่งผลต่อการทำงานของเอนไซม์ในเนื้อเยื่อที่มีชีวิตของพืชและสัตว์อย่างไรเมื่อบดเนื้อเยื่อที่มีชีวิตปฏิกิริยาจะเกิดขึ้นเร็วขึ้นเพราะว่า พื้นที่สัมผัสระหว่างโปรตีนกับไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์เพิ่มขึ้น คุณจะเสนอให้วัดอัตราการสลายตัวของไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์อย่างไร v=kc(a)c(b) โดยที่ v คืออัตราของปฏิกิริยาเคมี k คืออัตราคงที่ c คือการเปลี่ยนแปลงความเข้มข้น คุณคิดว่าสิ่งมีชีวิตทุกชนิดมีเอนไซม์คาตาเลส ซึ่งรับประกันการสลายตัวของไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์หรือไม่

ชี้แจงคำตอบของคุณ เนื่องจากนี่เป็นเอนไซม์ในกลุ่มออกซิโดรีดักเตส จึงเร่งการสลายตัวของไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ซึ่งเป็นพิษต่อเซลล์ที่มีชีวิตให้กลายเป็นน้ำและออกซิเจน มีอยู่ในไลโซโซม เราสามารถสรุปได้ว่ามีอยู่ในทุกเซลล์ของสิ่งมีชีวิต อธิบายข้อสังเกตของคุณ ระบุข้อสรุปของคุณ

สรุป: โปรตีนมีอยู่ในอาหารมีชีวิตเท่านั้น และในอาหารปรุงสุกโปรตีนจะถูกทำลาย ดังนั้นจึงไม่มีปฏิกิริยาเกิดขึ้นกับพวกมัน หากคุณบดผลิตภัณฑ์ ปฏิกิริยาจะเกิดขึ้นเร็วขึ้น

การแนะนำ

คู่มือนี้มีจุดมุ่งหมายเพื่อให้นักเรียนคุ้นเคยกับวิธีการศึกษาเอนไซม์ทั้งแบบคลาสสิกและวิธีการสมัยใหม่ที่มีความไวสูง วิธีการวิเคราะห์โดยใช้เอนไซม์เป็นเครื่องมือในการวิจัย คู่มือประกอบด้วยห้าส่วน:

1. วิธีการตรวจสอบการทำงานของเอนไซม์

2. การศึกษาพารามิเตอร์จลน์ของปฏิกิริยาของเอนไซม์

3. วิธีการแยกและการทำให้เอนไซม์บริสุทธิ์

4. การศึกษาการแปลเอนไซม์ในระดับเซลล์ย่อย

5. การใช้เอนไซม์เป็นรีเอเจนต์เชิงวิเคราะห์

ทุกส่วนของ "การประชุมเชิงปฏิบัติการ" มี งานอิสระอย่างไรก็ตาม ข้อกำหนดสำหรับนักศึกษายังคงเหมือนเดิม ผลงานแต่ละชิ้นที่นำเสนอถือเป็นผลงานเล็กๆ น้อยๆ การศึกษานำร่อง- เมื่อดำเนินการอย่างใดอย่างหนึ่ง นักเรียนจะต้องเตรียมวิธีแก้ปัญหาที่จำเป็นทั้งหมดอย่างอิสระ เชี่ยวชาญวิธีการวิจัยที่จำเป็น ทำการทดลองและนำเสนอผลลัพธ์ในรูปแบบของรายงาน แสดงข้อมูลที่ได้รับด้วยตารางและกราฟ

ระดับการใช้งาน เทคนิคระเบียบวิธีตรงตามข้อกำหนด วิทยาศาสตร์สมัยใหม่- หากจำเป็น รายละเอียดงานจะให้ข้อมูลโดยย่อ ข้อมูลทางทฤษฎี- งานทั้งหมดที่รวมอยู่ใน “เวิร์คช็อป” ดำเนินการโดยนักศึกษาซ้ำแล้วซ้ำเล่า

งาน 1. การกำหนดไทโตรเมทริกของกิจกรรมตัวเร่งปฏิกิริยา

อุปกรณ์และรีเอเจนต์: อ่างน้ำเดือด; ปิเปตสำหรับ 5, 10, 20 และ 25 มล. กระบอกตวงพร้อมพวยกาขนาด 10 และ 25 มล. ขวดปริมาตร 100 มล. ขวดทรงกรวย 200 มล. ครกและสากพอร์ซเลน โพแทสเซียมเปอร์แมงกาเนต (0.1 N); กรดซัลฟิวริก(10%); โซเดียมคาร์บอเนต; ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ (0.1 N); วัสดุจากพืชสด (มันฝรั่งหรือแครอท)

มันฝรั่งดิบ (หรือแครอท) 2 กรัมบดในครกแล้วค่อยๆ เติมน้ำ 2-3 มิลลิลิตร เพื่อลดปฏิกิริยาของกรด ให้เติมโซเดียมคาร์บอเนตที่ปลายไม้พายจนกระทั่งฟองหยุด คาร์บอนไดออกไซด์- มวลดินจะถูกถ่ายโอนในเชิงปริมาณไปยังขวดวัดปริมาตรและเจือจางด้วยน้ำให้มีปริมาตร 100 มล. ปล่อยให้ส่วนผสมยืนเป็นเวลา 30 นาที หลังจากนั้นจึงกรอง ถัดไป กิจกรรมถูกกำหนดตามโครงร่างต่อไปนี้ (ตัวอย่างการทดลอง 2 ตัวอย่าง และตัวอย่างควบคุม 2 ตัวอย่าง):

การทดลองและการควบคุมถูกไทเทรตด้วย 0.1 N สารละลายโพแทสเซียมเปอร์แมงกาเนต (จนกระทั่งสีชมพูอ่อนคงอยู่ประมาณ 1 นาที) สังเกตปริมาณของสารละลายโพแทสเซียมเปอร์แมงกาเนตที่ใช้สำหรับการไทเทรตไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ที่เหลือ (หลังการสลายตัวของเอนไซม์) ในขวดทดสอบ และสำหรับการไทเทรตไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ทั้งหมดในขวดควบคุม จากความแตกต่างระหว่างการไทเทรตแบบทดลองและแบบควบคุม จะพบปริมาณเปอร์แมงกาเนตที่เทียบเท่ากับปริมาณไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ที่ย่อยสลายโดยเอนไซม์

การคำนวณดำเนินการตามสมการปฏิกิริยา:

5H2O2 + 2KMnO4 + 3H2SO4 > 2MnSO4 + K2SO4 + 5O2 + 8H2O,

ตามที่สารละลายโพแทสเซียมเปอร์แมงกาเนต 1 มิลลิลิตรของ 0.1 N สอดคล้องกับไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ 1.7 มก.

ตัวอย่างการคำนวณ: เตรียมสารสกัดคาตาเลสที่มีปริมาตร 100 มล. จากแครอท 1.25 กรัม: ใช้ 15.5 มล. ในการไตเตรทตัวอย่างทดสอบ, 30.2 มล. ของสารละลายโพแทสเซียมเปอร์แมงกาเนต 0.1 N ใช้กับตัวอย่างควบคุม ปริมาณไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ที่สลายตัวในตัวอย่างมีค่าเท่ากับ (30.2 - 15.5) 14.7 มล. ของ 0.1 N สารละลายโพแทสเซียมเปอร์แมงกาเนตจึงเท่ากับ (14.7 1.7) 24.99 มก. ซึ่งหมายความว่าแครอทดิบ 1 กรัมมีปริมาณตัวเร่งปฏิกิริยาที่สามารถย่อยสลายได้ = 99.96 มก. ของไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ และใน 1 นาที - (99.96:30) 3.33 มก. เนื่องจากไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ 1 ไมโครโมลคือ 0.034 มก. ดังนั้นแครอท 1 กรัมจึงมีคาตาเลส (3.33:0.034) 100 U

1. คำนวณเนื้อหาของตัวเร่งปฏิกิริยาในวัสดุที่กำลังศึกษา

2. เขียนชื่อที่เป็นระบบของเอนไซม์นี้ รหัสตามแค็ตตาล็อกที่เป็นระบบ และอธิบายบทบาททางชีววิทยาของเอนไซม์