Вимірювання ферментативної активності. Метаболізм та ферменти

Поняття про ферменти

Ферментами (ензимами)називають розчинні чи пов'язані з мембранами білки, наділені каталітичної активністю. (Крім білків каталітичну активність в організмі можуть проявляти деякі РНК (рибозими) і антитіла (абзими), проте вони в тисячі разів менш ефективні, ніж ферменти. . Вони нагадують перші джерела ферментів. Біохімії, яка вивчає ферменти, називається ензимологія. На схемах і рівняннях реакцій молекули ферментів позначають - Е. Речовини, перетворення яких каталізують ферменти, називають субстратами (S). Продуктиензиматичної реакції позначають - Р. Оскільки ферменти є білками, їх одержують у гомогенному вигляді тими самими способами, що й інші білки. Для ферментів характерні фізико-хімічні властивості, властиві білкам.

Відмінність ферментів від неорганічних каталізаторів:

а) прискорюють реакції значно ефективніше;

б) наділені високою специфічністю дії;

в) піддаються регуляції у фізіологічних умовах;

г) діють у м'яких умовах.

Будова ферментів

Ферментами можуть бути як прості, так і складні (кон'юговані) білки, до складу яких можуть входити ліпіди, вуглеводи, іони металів, азотисті основи, похідні вітамінів. В організмі ферменти можуть функціонувати як у розчинному стані, так і у вигляді нерозчинних комплексів або входити до складу біологічних мембран.

Відмінною особливістю ферментів є наявність активного центру. Активний центр -це унікальна комбінація зближених у просторі амінокислотних залишків, яка забезпечує:

а) впізнавання молекули субстрату,

б) зв'язування субстрату з ферментом,

в) здійснення каталітичного перетворення (у разі складного ферменту в акті каталізу також бере участь кофермент, що входить до складу активного центру).

Активний центр виникає тоді, коли білок згортається і приймає свою нативну (активну) конформацію. Структура активного центру може бути змінена при взаємодії з субстратом. За образним виразом Д. Кошланд субстрат підходить до активного центру як рука до рукавички.

Одна молекула ферменту, особливо якщо вона складається з кількох субодиниць, може містити більше активного центру.

В активному центрі є дві ділянки. Перша ділянка відповідає за впізнавання та зв'язування субстрату. Він називається субстрат-зв'язуючим ділянкою або якірним майданчиком. Друга ділянка називається каталітичною, до її складу входять амінокислотні залишки, що беруть участь в акті каталізу.

Ферменти представляють білки, що сильно розрізняються за молекулярною масою та складністю будови. Прикладом ферменту з невеликою молекулою є рибонуклеаза, що складається з однієї субодиниці з молекулярною масою 13700 Да. (У рибонуклеази визначена амінокислотна послідовність. У 1969 р. рибонуклеаза була синтезована в лабораторії Б. Мерріфілда в Нью-Йорку.) Багато ферментів складаються з декількох субодиниць, наприклад, лактатдегідрогеназа складається з чотирьох субодиниць двох видів. На цей час відомо кілька мультиферментних комплексів, які з десятків різних субодиниць і кілька типів коферментів. Наприклад, піруватдегідрогеназний комплекс складається з 60 субодиниць трьох типів та п'яти типів кофакторів. Молекулярна маса такого комплексу становить 2,3 * 10 6 - 10 * 10 6 Так залежно від джерела ферменту. Молекула ферменту може бути меншою, ніж молекула субстрату. Наприклад: молекули ферментів амілази та рибонуклеази менші, ніж молекули їх субстратів – крохмалю та РНК.

Білкова частина складних ферментів каталітично неактивна і називається апоферментом. Зв'язування апоферменту з небілковим компонентом призводить до утворення каталітично активного ферменту (холоферменту):

Багато ферментів містять у своєму складі іон металу, який може виконувати різні функції:

а) брати участь у зв'язуванні субстрату та процесі його каталітичного перетворення;

б) сприяти приєднанню коферменту до молекули ферменту;

в) стабілізувати третинну структуру ферменту (наприклад, Са 2+ в амілазі);

г) зв'язуючись із субстратом, утворювати справжній субстрат, на який діє фермент.

Багато коферментів є похідними вітамінів, тому порушення обміну речовин при вітамінній недостатності обумовлено зниженням активності певних ферментів.

Деякі ферменти поряд з активним центром містять алостеричний (регуляторний) центр -ділянка білкової глобули, поза активним центром, де можуть зв'язуватися речовини, що регулюють ферментативну активність. Ці речовини називають алостеричними ефекторами (алостеричними активаторами або інгібіторами). Внаслідок зв'язування ефектора з алостеричним центром відбувається зміна структури білка, що призводить до зміни просторового розташування амінокислотних залишків в активному центрі і, в результаті, зміни ферментативної активності.

Ферменти, що зустрічаються в одному організмі та каталізують одну й ту саму хімічну реакцію, але з різною первинною структурою білка, називаються ізоферментами. Ізоферменти відрізняються один від одного за такими фізико-хімічними властивостями як молекулярна маса, термостабільність, субстратна специфічність, електрофоретична рухливість. Природа появи ізоферментів різноманітна, але найчастіше зумовлена ​​відмінностями у структурі генів, що кодують ці ізоферменти або їх субодиниці. Наприклад, фермент лактатдегідрогеназу (ЛДГ), що каталізує оборотну реакцію окислення лактату до пірувату, має чотири субодиниці двох типів М і Н, комбінація цих субодиниць лежить в основі формування п'яти ізоферментів ЛДГ (рис.1). Для діагностики захворювань серця та печінки необхідне дослідження ізоферментного спектру ЛДГ у сироватці крові, оскільки ЛДГ 1 та ЛДГ 2 активні у серцевому м'язі та нирках, а ЛДГ 4 та ЛДГ 5 – а скелетних м'язах та печінці.

Рис.1 Будова різних ізоферментів ЛДГ.

Вимірювання ферментативної активності

Визначення активності ферментів здійснюється шляхом вимірювання швидкості реакцій, що каталізуються. Швидкість ферментативних реакцій вимірюють за зменшенням концентрації субстрату або збільшення концентрації продукту за одиницю часу:

v = -ΔС S /Δτ , v = ΔC P /Δτ ,

де ΔС S- Зміна молярної концентрації субстрату (моль/л),

ΔC P- Зміна молярної концентрації продукту реакції (моль/л),

Δτ – зміна часу (хв, сек).

Кінетичні дослідження бажано проводити при насичувальній концентрації субстрату, в іншому випадку фермент не матиме змоги проявити максимальну активність.

Одиниці активності ферментів:

Міжнародна одиниця ферменту (U)- це така кількість ферменту, що каталізує перетворення 1 мкмоль субстрату за 1 хвилину при температурі 25 про С та оптимальному рН середовища.

У системі СІ одиницею ферменту є катал (кат)-Це така кількість ферменту, що каталізує перетворення одного мольсубстрату за 1 секунду. Неважко підрахувати, що:

1 U = (1 * 10 -6 М) / 60 с = 1,67 * 10 -8 М с-1 = 1, 67 * 10 -8 кат = 16,7 нкат.

Часто визначають питому активністьпрепаратів ферменту розподілом активності навішування препарату ферменту, вираженої в (U), на масу навішування в міліграмах:

А уд = U/маса препарату (мг)

При очищенні ферментів питома активність зростає. За зростанням питомої активності можна судити про ефективність стадій очищення та чистоту ферментного препарату.

Для оцінки активності високоочищених, гомогенних препаратів ферментів розподілом числа міжнародних одиниць (U) ферменту у зразку на кількість речовини ферменту (мкмоль) у цьому зразку розраховують молярну активність(число обертів). За фізичним змістом молярна активність - це число молекул субстрату, що піддаються перетворенню однією молекулі ферменту за 1 хвилину чи 1секунду. Наприклад: для уреази, що прискорює гідроліз сечовини, молярна активність становить 30000, трипсину – 102, глюкозоксидази – 17000 циклів на секунду.

Властивості ферментів

4.1. Механізм дії.Ферменти не зміщують рівновагу реакцій, що каталізуються, у бік утворення продуктів, таким чином, константа рівноваги реакції залишається постійною. Як і всі каталізатори, ферменти лише зменшують час досягнення цієї рівноваги. Найчастіше ферменти прискорюють реакції в 10 7 - 10 14 разів. В основі ефективності ферментативного каталізу лежить сильне зниження енергії активації реакції за рахунок перетворення субстрату на продукт через перехідні стани.

4.2. Специфіка дії. Специфічність зв'язування з субстратом та шляхи протікання ферментативної реакції визначаються апоферментом. Специфіка дії ферментів визначає спрямований обмін речовин в організмі.

Про ферменти говорять, що вони мають вузьку субстратну специфічністьякщо вони діють на дуже невелике коло субстратів. Іноді можна говорити про абсолютної субстратної специфічності,наприклад, каталаза каталізує лише одну реакцію - розкладання пероксиду водню:

Для більшості ферментів характерна відносна (широка, групова) субстратна специфічністьколи вони каталізують групу однотипних реакцій. Наприклад, алкогольдегідрогеназа каталізує перетворення спиртів на альдегіди, причому як субстрати можуть виступати метанол, етанол, пропанол та інші спирти. Цікавим є той факт, що алкогольдегідрогеназа може окислювати і нелінійні спирти, а також спиртову групу, що входить до складу складних молекул, зокрема, цей фермент може каталізувати перетворення ретинолу на ретиналь. Звичайно, ферменти, наділені широкою субстратною специфічністю, каталізують перетворення субстратів з різною ефективністю.

Ферменти наділені також стереохімічною специфічністю: їх активний центр розпізнає молекули субстратів щодо просторової конфігурації. Наприклад, оксидази L-амінокислот активні лише щодо L-амінокислот і зовсім не діють на їх D-аналоги. Для окисного дезамінування D-амінокислот у живих організмах є оксидази D-амінокислот, що не діють на L-амінокислоти. Саме здатність активного центру зв'язуватися з певними стереоізомерами субстрату є основою функціонування таких ферментів, як рацемази, які перетворюють одні стереоізомери на інші.

Специфіка шляхів перетворенняполягає в тому, що один субстрат під дією різних ферментів може перетворюватися на продукти, що розрізняються за структурою та роллю в метаболізмі.

Наведемо приклад: оксидази L-амінокислотдіють на L-амінокислоти, перетворюючи їх на альфа-кетокислоти з утворенням аміаку та пероксиду водню.

Декарбоксилази L-амінокислотзв'язуються з тими ж субстратами, але каталізують іншу реакцію: декарбоксилювання з утворенням біогенних амінів та виділенням вуглекислого газу.

Ще одним прикладом є можливість перетворення глюкозо-6 фосфату під дією різних ферментів, по одному з можливих метаболічних шляхів:

4.3. Термолабільність .

Як і багато білків, при підвищенні температури ферменти піддаються термічній денатурації, що призводить до порушення нативної конформації ферменту та зміни структури активного центру. Ферменти ссавців починають помітно денатурувати за температур вище 40 про З.

У зв'язку з вищесказаним ферментні препарати бажано зберігати при знижених температурах. Одним з кращих шляхів збереження ферментів є їх ліофілізація (висушування при температурі нижче -70 про С у вакуумі), переведення в частково денатурований стан за допомогою амонію солей і приміщення в холодильник.

4.4. Залежність швидкості реакції від температури.Швидкість ферментативних реакцій, як будь-яких хімічних реакцій, залежить від температури. При підвищенні температури на 10 про З швидкість реакції збільшується в 2-4 рази згідно з правилом Вант-Гоффа. Однак при температурах вище 40 о С істотною стає денатурація ферментів, що призводить до зменшення сумарної активності (рис. 2):

Мал. 2. Залежність швидкості ферментативної реакції від температури.

4.5. Залежність швидкості реакції від рН.Залежність швидкості ферментативної реакції від рН має дзвоноподібний вигляд (рис. 3). Значення рН, у яких спостерігається найвища швидкість ферментативної реакції, називають оптимальними (рН-оптимум). Характер кривих та значення рН-оптимуму залежить від природи заряджених груп субстрату та заряджених груп ферменту (особливо тих, що входять до активного центру). Оптимум рН більшість ферментів лежить у межах від 6,0 до 8,0 (рис. 3).

Мал. 3. Залежність швидкості ферментативної реакції від рН.

Однак є і винятки, наприклад, пепсин найбільш активний при рН 1,5 - 2,0, а лужна фосфатаза при рН 10,0 - 10,5 (рис. 4)

Мал. 4. Залежність швидкості ферментативної реакції (v) від рН середовища.

При екстремальних (надто низьких або дуже високих) значеннях рН відбувається порушення третинної структури молекули ферменту, що призводить до втрати ферментативної активності.

Подібна інформація.

Поняття активності ферменту

У повсякденній біохімічній практиці мало оцінюється кількість ферменту, лише його активність. Активність – ширше поняття, ніж кількість. Вона має на увазі в першу чергу результат реакції, а саме спад субстрату або накопичення продукту. Звичайно, при цьому не можна ігнорувати час, який пропрацював фермент і кількість молекул ферменту. Але оскільки число молекул ферменту підрахувати зазвичай неможливо, то застосовують кількість біологічного матеріалу, що містить фермент (обсяг чи масу).

Таким чином, при визначенні активності ферментів потрібно одночасно враховувати три змінні:

• маса одержаного продукту або зниклого субстрату;
• час, витрачений реакцію;
• кількість ферменту, але насправді масу чи обсяг біологічного матеріалу, що містить фермент.

Для розуміння співвідношень зазначених факторів наочним і простим прикладом може бути будівництво двох будівель. Будівлі прирівняємо до продукту реакції, робітники – це ферменти, бригада нехай відповідає обсягу біологічного матеріалу. Отже, завдання із 3-го класу:

1. На будівництві однієї будівлі працювала бригада з 10 осіб, іншої такої самої будівлі - бригада з 5 осіб. Будівництво закінчено одночасно та в повному обсязі. Де вища активність робітників?
2. На будівництві однієї будівлі з 3 поверхів працювала бригада з 10 осіб, іншої будівлі з 12 поверхів - бригада також із 10 осіб. Будівництво закінчено одночасно та в повному обсязі. Де вища активність робітників?
3. На будівництві однієї будівлі з 5 поверхів працювала бригада з 10 осіб, іншої такої самої будівлі - бригада теж з 10 осіб. Будівництво першої будівлі зайняло 20 днів, друга збудована за 10 днів. Де вища активність робітників?

Основи кількісного визначення активності ферментів

1. Активність ферменту виражається у швидкості накопичення продукту або швидкості втрат субстрату в перерахунку на кількість матеріалу, що містить фермент.

У практиці зазвичай використовують:

• одиниці кількості речовини - моль (та її похідні ммоль, мкмоль), грам (кг, мг),
• одиниці часу - хвилина, година, секунда,
• одиниці маси чи обсягу - грам (кг, мг), літр (мл).

Активно використовуються інші похідні - катал (моль/с), міжнародна одиниця активності (МЕ, Unit) відповідає мкмоль/хв.

Таким чином, активність ферменту може виражатися, наприклад, ммоль/с×л, г/час×л, МО/л, кат/мл і т. д.

Наприклад, відомо,

2. Створення стандартних умов, щоб можна було порівнювати результати, отримані в різних лабораторіях - оптимальна рН та фіксована температура, наприклад, 25°С або 37°С, дотримання часу інкубації субстрату з ферментом.

Активність ферментів.Під активністю ферменту розуміють таку його кількість, що каталізує перетворення певної кількості субстрату на одиницю часу. Для вираження активності препаратів ферментів використовують дві альтернативні одиниці: міжнародну (МЕ) та катал (кат). За міжнародну одиницю активності ферменту прийнято таку його кількість, що каталізує перетворення 1 мкмолю субстрату на продукт за 1 хв у стандартних умовах (зазвичай оптимальних). Один катал позначає кількість ферменту, що каталізує перетворення 1 моля субстрату за 1 с (1 кат = 6 ∙ 10 7 МО). При бімолекулярній реакції A + В = С + D за одиницю активності ферменту приймають таку його кількість, яка каталізує перетворення 1 мкмоля А або В, або 2 мкмолі А (якщо В = А), за 1 хв.

Часто ферментні препарати характеризуються питомою активністю, що відбиває ступінь очищення ферменту. Питома активність - Це кількість одиниць активності ферменту, що припадають на 1 мг білка.

Молекулярна активність (кількість оборотів ферменту) – число молекул субстрату, що піддається перетворенню однією молекулою ферменту за 1 хв при повному насиченні ферменту субстратом. Вона дорівнює числу одиниць активності ферменту, поділеному на кількість ферменту, виражену в мікромолях. Поняття молекулярної активності застосовується лише чистих ферментів.

Коли відома кількість активних центрів у молекулі ферменту, вводиться поняття активності каталітичного центру . Вона характеризується числом молекул субстрату, яке перетворюється за 1 хв у розрахунку на один активний центр.

Активність ферментів залежить від зовнішніх умов, серед яких першорядне значення мають температура і рН середовища. Підвищення температури в інтервалі 0-50°З зазвичай призводить до плавного збільшення ферментативної активності, що пов'язано з прискоренням процесів формування фермент-субстратного комплексу та всіх подальших подій каталізу. При підвищенні температури кожні 10°С швидкість реакції збільшується приблизно вдвічі (правило Вант-Гоффа). Однак подальше зростання температури (>50°С) супроводжується підвищенням кількості інактивованого ферменту за рахунок денатурації його білкової частини, що виражається у зниженні активності. Кожен фермент характеризується температурним оптимумом– значення температури, при якому реєструється найбільша його активність.

Залежність активності ферментів значення рН середовища має складний характер. Для кожного ферменту характерний оптимум рН середи, у якому він виявляє максимальну активність. При віддаленні від цього значення у той чи інший бік ферментативна активність знижується. Це пояснюється зміною стану активного центру ферменту (зменшенням або збільшенням іонізації функціональних груп), а також третинної структури всієї білкової молекули, яка залежить від співвідношення в ній катіонних та аніонних центрів. Більшість ферментів мають оптимум рН у сфері нейтральних значень. Однак є ферменти, що виявляють максимальну активність при рН 1,5 (пепсин) або 9,5 (аргіназ). При роботі з ферментами необхідно підтримувати рН за допомогою буферного розчину.

Активність ферментів схильна до значних коливань залежно від впливу інгібіторів(речовин, що частково або повністю знижують активність) та активаторів(речовин, що збільшують активність). Їх роль виконують катіони металів, деякі аніони, переносники фосфатних груп, відновлювальних еквівалентів, специфічні білки, проміжні та кінцеві продукти метаболізму та ін.

Принципи ферментативної кінетики.Суть кінетичних досліджень полягає у визначенні максимальної швидкості ферментативної реакції ( V max) та константи Міхаеліса К М. Ферментативна кінетика вивчає швидкості кількісних перетворень одних речовин на інші під дією ферментів. Швидкість ферментативної реакції вимірюють по спаду субстрату або приросту продукту, що утворюється за одиницю часу, або по зміні концентрації однієї з суміжних форм коферменту.

Вплив концентрації ферментуна швидкість реакції виявляється у наступному: якщо концентрація субстрату постійна (за умови надлишку субстрату), швидкість реакції пропорційна концентрації ферменту. Для кінетичних досліджень використовують концентрацію ферменту 10-8 М активних центрів. Оптимальне значення концентрації ферменту визначають із графіка залежності активності ферменту від його концентрації. Оптимальним вважається значення, що лежить на плато одержаного графіка в області значень активності ферменту, що мало залежать від його концентрації (рис. 4.3).

Мал. 4.3. Залежність швидкості ферментативної реакції

від концентрації ферменту

Для вивчення впливу концентрації субстратуна швидкість ферментативної реакції спочатку будують кінетичну криву, що відображає зміну концентрації субстрату (S 1) або продукту (Р 1) у часі (рис. 4.4) та вимірюють початкову швидкість ( V 1) реакції як тангенс кута нахилу дотичної до кривої в нульовій точці.

Мал. 4.4. Кінетичні криві ферментативної реакції

Побудувавши кінетичні криві для інших значень концентрації даного субстрату (S 2 , S 3 , S 4 і т. д.) або продукту (Р 2 , Р 3 , Р 4 і т. д.) та визначивши початкові швидкості ( V 2, V 3 , V 4 і т. д.) реакції, будують графік залежності початкової швидкості ферментативної реакції від концентрації субстрату (при постійній концентрації ферменту), який має вигляд гіпербол (рис. 4.5).

Мал. 4.5. Залежність початкової швидкості ферментативної реакції

від концентрації субстрату

Кінетика багатьох ферментативних реакцій описується рівнянням Міхаеліса Ментен. При постійній концентрації ферменту та малих значеннях концентрації субстрату[S] Початкова швидкість реакції прямо пропорційна [S] (рис. 4.5). У цьому випадку говорять про напівнасичення ферменту субстратом, коли половина молекул ферменту знаходиться у формі фермент-субстратного комплексу та швидкість реакції V = 1/2V max. Щодо субстрату реакція має 1-й порядок (швидкість реакції прямо пропорційна концентрації однієї реагуючої речовини) або 2-й порядок (швидкість реакції пропорційна добутку концентрацій двох реагуючих речовин).

При високих значеннях концентрації субстрату[S] швидкість реакції майже не залежить від [S]: при подальшому збільшенні [S] швидкість реакції зростає все повільніше і в результаті стає постійною (максимальною) (рис. 4.5). При цьому досягається повне насичення ферменту субстратом, коли всі молекули ферменту знаходяться у формі фермент-субстратного комплексу та V = V max.

Щодо субстрату реакція має 0-й порядок (швидкість реакції не залежить від концентрації речовин, що реагують).

У 1913 р. Л. Міхаеліс та М. Ментен запропонували просту модель, яка пояснювала таку кінетику. Згідно з цією моделлю, утворення специфічного фермент-субстратного комплексу є необхідним проміжним етапом каталізу. 1 У 1913 р. Л. Міхаеліс та М. Ментен запропонували просту модель, яка пояснювала таку кінетику. Згідно з цією моделлю, утворення специфічного фермент-субстратного комплексу є необхідним проміжним етапом каталізу. 3

k

Е + S ⇄ ЕS → Е + Р У 1913 р. Л. Міхаеліс та М. Ментен запропонували просту модель, яка пояснювала таку кінетику. Згідно з цією моделлю, утворення специфічного фермент-субстратного комплексу є необхідним проміжним етапом каталізу.Фермент Е з'єднується із субстратом S, утворюючи ЕS-комплекс. Константа швидкості цього процесу У 1913 р. Л. Міхаеліс та М. Ментен запропонували просту модель, яка пояснювала таку кінетику. Згідно з цією моделлю, утворення специфічного фермент-субстратного комплексу є необхідним проміжним етапом каталізу. 1 . Доля ЕS-комплексу складається подвійно: він може або дисоціювати на фермент Е та субстрат S з константою швидкості У 1913 р. Л. Міхаеліс та М. Ментен запропонували просту модель, яка пояснювала таку кінетику. Згідно з цією моделлю, утворення специфічного фермент-субстратного комплексу є необхідним проміжним етапом каталізу. 2 або піддатися подальшому перетворенню, утворюючи продукт Р і вільний фермент Е, з константою швидкості

3 . При цьому постулюється, що продукт реакції не перетворюється на вихідний субстрат. Ця умова дотримується на стадії реакції, поки концентрація продукту невелика. Швидкість каталізу визначають устаціонарних умов

коли концентрація проміжних продуктів залишається постійною, тоді як концентрація вихідних речовин і кінцевих продуктів змінюється. Це має місце в тому випадку, коли швидкість утворення ЕS-комплексу дорівнює швидкості його розпаду. Можна запровадити нову константу К М –константу Міхаеліса

(моль/л), яка дорівнюєРівняння Міхаеліса – Ментен

(4.2)

, що виражає кількісне співвідношення між швидкістю ферментативної реакції та концентрацією субстрату, має вигляд Це рівняння відповідає графіку залежності швидкості реакції концентрації субстрату. Принизьких концентраціях субстрату V = V, коли [S] набагато нижче К М, max [S] / К М, тобто швидкість реакції прямо пропорційна концентрації субстрату. Привисоких концентраціях субстрату V = V max, тобто швидкість реакції максимальна і не залежить від концентрації субстрату.

Якщо [S] = К М, то V = V max/2.

Таким чином, К М дорівнює концентрації субстрату, при якій швидкість реакції становить половину максимальної.

Константа Міхаеліса (К М) та максимальна швидкість реакції ( V max) - важливі характеристики швидкості при різних концентраціях субстрату. V max – величина постійна кожному ферменту дозволяє оцінити ефективність його дії.

Константа Міхаеліса показує спорідненість субстрату до ферменту (у разі, коли У 1913 р. Л. Міхаеліс та М. Ментен запропонували просту модель, яка пояснювала таку кінетику. Згідно з цією моделлю, утворення специфічного фермент-субстратного комплексу є необхідним проміжним етапом каталізу. 2 >> У 1913 р. Л. Міхаеліс та М. Ментен запропонували просту модель, яка пояснювала таку кінетику. Згідно з цією моделлю, утворення специфічного фермент-субстратного комплексу є необхідним проміжним етапом каталізу. 3): чим менше К М, тим більша спорідненість і вища швидкість реакції, і навпаки. Кожен субстрат характеризується своєю величиною К М для даного ферменту і за їх значеннями можна судити про субстратну специфічність ферменту. Константа Міхаеліса залежить від природи субстрату, температури, рН, іонної сили розчину та наявності інгібіторів.

У зв'язку з тим, що визначення V max та К М безпосередньо з графічної залежності Міхаеліса – Ментен (рис.4.5) є неоднозначним, вдаються до лінеаризації даного рівняння. Для цього його перетворять на таку форму, щоб графічно воно виражалося прямою. Існує кілька методів лінеаризації, серед яких найчастіше застосовують методи Лайнуівера – Берка та Еді – Хофсті.

Перетворення Лайнуівера – Берка має вигляд

(4.3)

Будують графік залежності 1/ V = f(1/[S]) і отримують пряму лінію, перетин якої з віссю ординат дає величину 1/ V max; відрізок, що відсікається прямий на осі абсцис дає величину -1/К М, а тангенс кута нахилу прямої до осі абсцис дорівнює К М / V max (рис. 4.6). Цей графік дозволяє точніше визначати V max. Як ми побачимо нижче, з цього графіка можна отримати цінну інформацію, що стосується інгібування активності ферменту.

Мал. 4.6. Метод лінеаризації рівняння Міхаеліса – Ментен

(по Лайнуіверу - Берку)

Метод Еді – Хофсті заснований на перетворенні рівняння Міхаеліса - Ментен шляхом множення обох його частин на V max:

(4.4)

Графік у координатах Vі V/[S] являє собою пряму лінію, перетин якої з віссю ординат дає величину V max, а відрізок, що відсікається прямий на осі абсцис - величину V max/К М (рис. 4.7). Він дозволяє дуже просто визначати К М і V max , а також виявляти можливі відхилення від лінійності, які не виявляються на попередньому графіку.

Мал. 4.7. Метод лінеаризації рівняння Міхаеліса – Ментен

(за Еді - Хофсті)

Інгібування активності ферментів.Дія ферментів можна повністю або частково придушити певними хімічними речовинами. інгібіторами . За характером своєї дії інгібітори поділяються на оборотні та необоротні. В основі такого поділу лежить міцність зв'язування інгібітора з ферментом.

Зворотні інгібітори – це сполуки, які нековалентно взаємодіють із ферментом і за їх видаленні активність ферменту відновлюється. Оборотне інгібування може бути конкурентним, неконкурентним і безконкурентним.

прикладом конкурентного інгібуванняє дія структурних аналогів субстрату, які можуть зв'язуватися з активним центром ферменту схожим способом, як і субстрат, не перетворюючись проте на продукт і перешкоджаючи взаємодії ферменту з істинним субстратом, тобто має місце конкуренція між субстратом та інгібатором за зв'язування з активним центром ферменту . В результаті утворення комплексів фермент-інгібітор (EI) концентрація ES-комплексів зменшується і, як наслідок, знижується швидкість реакції. Іншими словами, конкурентний інгібітор зменшує швидкість каталізу шляхом зниження частки молекул ферменту, що зв'язали субстрат.

Вимірювання швидкостей реакцій за різних концентрацій субстрату дозволяє відрізняти конкурентне інгібування від неконкурентного. При конкурентному інгібуванні на графіку залежності 1/ V=f(1/[S]) прямі перетинають вісь ординат в одній точці 1/ V max незалежно від присутності інгібітора, але в присутності інгібітора збільшується тангенс кута нахилу прямої осі до абсцис, тобто. V max не змінюється, а К М збільшується, що свідчить про зменшення спорідненості субстрату до ферменту у присутності інгібітору (рис. 4.8). Отже, при досить високій концентрації субстрату в умовах конкуренції за активний центр ферменту, коли субстрат витісняє інгібітор з активного центру, інгібування може бути усунуто, і швидкість реакції, що каталізується, відновлюється. При цьому рівняння Міхаеліса – Ментен має вигляд

(4.5)

де [I] – концентрація інгібітору; K i - Константа інгібування.

Константа інгібування характеризує спорідненість ферменту до інгібітора і є константою дисоціації ЕI-комплексу:

(4.6)

У присутності конкурентного інгібітора тангенс кута нахилу прямої до осі абсцис збільшується на величину (1 + [I]/ K i).

Мал. 4.8. Конкурентне інгібування:

а – схема; б – графічний вислів по Лайнуіверу – Берку

При неконкурентне інгібуванняінгібітор відрізняється за структурою від субстрату та зв'язується не з активним, а з алостеричним центром ферменту. Це призводить до зміни конформації активного центру ферменту, що супроводжується зниженням каталітичної активності ферменту. Причому інгібітор може зв'язуватися не тільки з вільним ферментом (Е+I→EI), а й із фермент-субстратним комплексом (ES+I→ESI). Обидві форми EI та ESI не активні. Субстрат та інгібітор можуть бути одночасно пов'язані молекулою ферменту, але ділянки їх зв'язування не перекриваються. Дія неконкурентного інгібітора полягає у зменшенні кількості оборотів ферменту, а не в зниженні частки молекул ферменту, що зв'язали субстрат. Інгібітор не перешкоджає утворенню ES-комплексів, але гальмує перетворення субстрату на продукт. Внаслідок цього V max зменшується, тобто в присутності інгібітора перетин прямий з віссю ординат відбудеться у вищій точці (рис. 4.9). У тій же мірі зростає і тангенс кута нахилу прямої до осі абсцис, що дорівнює К М / V max I. К М на відміну від V max не змінюється, тому неконкурентне пригнічення не може бути усунене збільшенням концентрації субстрату.

Мал. 4.9. Неконкурентне інгібування:

а – схема; б – графічний вислів по Лайнуіверу – Берку

Максимальна швидкість реакції V max I у присутності неконкурентного інгібітора описується рівнянням

(4.7)

В окремому випадку безконкурентного інгібуванняколи інгібітор зв'язується тільки з ES-комплексом і не зв'язується з вільним ферментом, на графіку залежності 1/ V = f(1/[S]) прямі паралельні один одному і перетинають осі ординат та абсцис у різних точках (рис. 4.10).

Мал. 4.10. Безконкурентне інгібування:

а – схема; б – графічний вислів по Лайнуіверу – Берку

Необоротні інгібітори – це високореакційні сполуки різної хімічної природи, які можуть взаємодіяти з функціонально важливими групами активного центру, утворюючи міцні ковалентні зв'язки. Це призводить до безповоротної втрати активності ферменту. У зв'язку з цим теорія Міхаеліса – Ментен, заснована на припущенні, що приєднання інгібітора до ферменту має оборотний характер, у разі непридатна.

Прикладом незворотного інгібування служить взаємодія ферментів з іонами важких металів, які приєднуються до сульфгідрильних груп цистеїнових залишків ферменту і утворюють при цьому меркаптиди - практично недисоціюючі сполуки або ковалентна модифікація ферменту під дією алкілуючих агентів.

(Активатори - підвищують, інгібітори - знижують) Білкові ферменти синтезуються на рибосомах, а РНК - в ядрі.

Терміни «фермент» та «ензим» давно використовують як синоніми (перший переважно в російській та німецькій науковій літературі, другий – в англо- та франкомовній).
Наука про ферменти називається ензимологією, а не ферментологією (щоб не змішувати коріння слів латинської та грецької мов).

Історія вивчення

Термін ферментзапропонований у XVII столітті хіміком ван Гельмонтом під час обговорення механізмів травлення.

В кін. ХVІІІ – поч. ХІХ ст. вже було відомо, що м'ясо перетравлюється шлунковим соком, а крохмаль перетворюється на цукор під дією слини. Однак механізм цих явищ був невідомий

Ферменти широко використовуються у народному господарстві – харчовій, текстильній промисловості, у фармакології.

Класифікація ферментів

За типом каталізованих реакцій ферменти поділяються на 6 класів згідно з ієрархічною класифікацією ферментів (КФ - Enzyme Comission code). Класифікацію було запропоновано Міжнародним союзом біохімії та молекулярної біології (International Union of Biochemistry and Molecular Biology). Кожен клас містить підкласи, тому фермент описується сукупністю чотирьох чисел, розділених точками. Наприклад, пепсин має назву ЄС 3.4.23.1. Перше число грубо описує механізм реакції, що каталізується ферментом:

• КФ 1: Оксидоредуктази, що каталізують окиснення або відновлення. Приклад: каталаза, алкогольдегідрогеназа
• КФ 2: Трансферази, що каталізують перенесення хімічних груп з однієї молекули субстрату на іншу Серед трансфераз особливо виділяють кінази, що переносять фосфатну групу, як правило, з молекули АТФ.
• КФ 3: Гідролази, що каталізують гідроліз хімічних зв'язків. Приклад: естерази, пепсин, трипсин, амілаза, ліпопротеїнліпаза
• КФ 4: Ліазикаталізують розрив хімічних зв'язків без гідролізу з утворенням подвійного зв'язку в одному з продуктів.
• КФ 5: Ізомерази, що каталізують структурні або геометричні зміни в молекулі субстрату
• КФ 6: Лігази, що каталізують утворення хімічних зв'язків між субстратами за рахунок гідролізу АТФ Приклад: ДНК-полімераза

Кінетичні дослідження

Крива насичення хімічної реакції, що ілюструє співвідношення між концентрацією субстрату [S] та швидкістю реакції v

Найпростішим описом кінетики односубстратних ферментативних реакцій є рівняння Міхаеліса – Ментен (див. рис.). Сьогодні описано кілька механізмів дії ферментів. Наприклад, дія багатьох ферментів описується схемою механізму пінг-понг.

Структура та механізм дії ферментів

Активність ферментів визначається їхньою тривимірною структурою.

Як і всі білки, ферменти синтезуються у вигляді лінійного ланцюжка амінокислот, яка згортається певним чином. Кожна послідовність амінокислот згортається особливим чином, і виходить молекула (білкова глобула) має унікальні властивості. Декілька білкових ланцюгів можуть об'єднуватися в білковий комплекс. Третинна структура білків руйнується при нагріванні чи дії деяких хімічних речовин.

Щоб каталізувати реакцію, фермент має зв'язатися з одним чи кількома субстратами. Білковий ланцюг ферменту згортається таким чином, що на поверхні глобули утворюється щілина або западина, де зв'язуються субстрати. Ця область називається сайтом зв'язування субстрату. Зазвичай він збігається з активним центром ферменту або знаходиться поблизу нього. Деякі ферменти містять сайти зв'язування кофакторів або іонів металів.

У деяких ферментів є сайти зв'язування малих молекул, вони можуть бути субстратами або продуктами метаболічного шляху, до якого входить фермент. Вони зменшують або збільшують активність ферменту, що створює можливість зворотного зв'язку.

Для активних центрів деяких ферментів характерне явище кооперативності.

Специфіка

Ферменти зазвичай виявляють високу специфічність стосовно своїх субстратів. Це досягається частковою комплементарністю форми, розподілу зарядів та гідрофобних областей на молекулі субстрату та у центрі зв'язування субстрату на ферменті. Ферменти демонструють високий рівень стереоспецифічності, регіоселективності та хемоселективності.

Модель «ключ-замок»

Гіпотеза Кошланда про індуковану відповідність

Більш реалістична ситуація у разі індукованої відповідності. Неправильні субстрати – надто великі чи надто маленькі – не підходять до активного центру

У 1890 р. Еміль Фішер припустив, що специфічність ферментів визначається точною відповідністю форми ферменту та субстрату. Таке припущення називається моделлю "ключ-замок". Фермент з'єднується з субстратом з утворенням короткоживучого фермент-субстратного комплексу. Проте, хоча ця модель пояснює високу специфічність ферментів, вона пояснює явища стабілізації перехідного стану, що спостерігається практично.

Модель індукованої відповідності

У 1958 р. Деніел Кошланд запропонував модифікацію моделі «ключ-замок». Ферменти, переважно, - не жорсткі, а гнучкі молекули. Активний центр ферменту може змінити конформацію після зв'язування субстату. Бічні групи амінокислот активного центру приймають таке положення, що дозволяє ферменту виконати свою функцію каталітичну. У деяких випадках молекула субстрату змінює конформацію після зв'язування в активному центрі. На відміну від моделі «ключ-замок», модель індукованої відповідності пояснює як специфічність ферментів, а й стабілізацію перехідного стану.

Модифікації

Багато ферментів після синтезу білкового ланцюга зазнають модифікації, без яких фермент не виявляє своєї активності повною мірою. Такі модифікації називаються посттрансляційними модифікаціями (процесингом). Один із найпоширеніших типів модифікації - приєднання хімічних груп до бічних залишків поліпептидного ланцюга. Наприклад, приєднання залишку фосфорної кислоти називається фосфорилюванням, воно каталізується ферментом кіназою. Багато ферментів еукаріотів глікозильовані, тобто модифіковані олігомерами вуглеводної природи.

Ще один поширений тип посттранляційних модифікацій – розщеплення поліпептидного ланцюга. Наприклад, хімотрипсин (протеаза, що бере участь у травленні), виходить при вищепленні поліпептидної ділянки з хімотрипсиногену. Хімотрипсиноген є неактивним попередником хімотрипсину і синтезується в підшлунковій залозі. Неактивна форма транспортується на шлунок, де перетворюється на хімотрипсин. Такий механізм необхідний для того, щоб уникнути розщеплення підшлункової залози та інших тканин до надходження ферменту до шлунка. Неактивний попередник ферменту називають також "зимогеном".

Кофактори ферментів

Деякі ферменти виконують каталітичну функцію власними силами, без будь-яких додаткових компонентів. Однак є ферменти, яким для здійснення каталізу необхідні компоненти небілкової природи. Кофактори можуть бути як неорганічними молекулами (іони металів, залізо-сірчані кластери та ін), так і органічними (наприклад,

1. Особливості ферментативних реакцій

2. Вплив температури на активність ферментів

3. Вплив рН на активність ферментів

4. Активатори та інгібітори ферментів

I. Усі ферментативні реакції мають 4 особливості

· Висока активність ферментів;

· Оборотність дії ферментів;

· Специфіка дії ферментів;

· Лабільність (чутливість).

Висока активність ферментів.Ферменти зумовлюють високу швидкість ферментативної реакції, що характеризується числом оборотів ферментів – це кількість молекул субстрату, що перетворюється на продукти реакції при дії однієї молекули ферменту за одиницю часу. Наприклад, алкогольдегідрогеназа має активність 4700 од., фосфорилаза – 50000 од., a-амілаза – 16000 од.

Оборотність дії ферментіввстановив Данилевський. Під оборотністю впливу ферментів розуміють освіту комплексу ES та її розпад, тобто. реакції за участю ферменту можуть йти як в один бік (біосинтез), так і у зворотний (розпад).

Специфіка дії ферментів- кожен фермент діє лише на свій певний субстрат чи групу родинних субстратів. Наприклад, інвертаза діє сахарозу; a-амілаза – тільки на крохмаль та декстрини; протеази – на білки.

Існує дві точки зору, що пояснюють специфічність дії ферментів. За образним уявленням Еге. Фішера “фермент підходить до субстрату як ключі до замку”, тобто. топографія активного центру ферменту як високоупорядкована, а й жорстко закріплена. Активний центр ферменту відповідає топографії лише одного єдиного субстрату. Друга думка, запропонована Д. Кошландом - теорія індукованого відповідності ферменту та субстрату: конформація ферменту, особливо його активного центру, здатна до певних модифікацій. Залежно від конформаційної рухливості активного центру фермент здатний взаємодіяти або з небагатьма, або з різними субстратами. Іншими словами, в момент утворення комплексу ЕS відбуваються зміни в структурі як ферменту, так і субстрату. Внаслідок чого вони адаптуються один до одного.

Специфічність ферментів відіграє важливу роль у процесі обміну речовин у живому організмі. (Якби фермент не мав унікальних властивостей, то в живому організмі не було б обміну речовин)

За ознакою специфічності ферменти поділяються на 2 групи:

· Абсолютна специфічність - фермент діє тільки на одну-єдину речовину або каталізує тільки певне перетворення цієї речовини;

· Відносна або групова специфічність - ферменти діють відразу на багато субстратів, що мають ряд загальних структурних властивостей.

Лабільність (чутливість) -всі ферменти чутливі до підвищення температури та низьких значень рН, у яких відбувається втрата активності ферментів.

II. Найважливішим чинником, якого залежить активність ферментів, є температура.

Графічно залежність швидкості ферментативної реакції від температури виглядає так:

При 0°С, а тим більше при температурах нижче 0°С, дія більшості ферментів припиняється. Підвищення температури (крива 1) вище 0°С сприяє збільшенню активності ферментів (збільшується кількість зіткнень речовин, що реагують). За певної температури фермент проявляє максимальну активність. Більшість ферментів оптимальною температурою дії є 40-50°С. Подальше підвищення температури призводить до інактивації ферментів (зменшення активності) внаслідок термічної денатурації білкової молекули (крива 2).

Зміна швидкості реакції при підвищенні температури на кожні 10°З виражають температурним коефіцієнтом Q 10 . Температурний коефіцієнт є відношенням швидкість реакції при даній температурі v t +10 до швидкості реакції при температурі на 10°С нижче даної:

Розмір Q 10 для хімічних реакцій лежить у межах 2-4, для ферментативної реакції – між 1 і 2; Q 10 ферментативних реакцій помітно знижується при підвищенні температури.

III. Кожен фермент виявляє свою дію в межах досить тонкої зони рН. Графічна залежність активності ферменту від рН має вигляд:

У кислому середовищі, при низьких значеннях рН, має форму ЕН 2+, у такій формі він малоактивний. При оптимумі рН фермент має максимальну активність і знаходиться у формі ЕН; при підлужуванні середовища, фермент набуває форми Е - .

Оптимальній активності відповідає певна область рН, причому кожен фермент має своє оптимальне значення рН дії (наприклад, бактеріальна a-амілаза має рН оптимум при 6, а a-амілаза мікроскопічних грибів - 4,7). Оптимальне значення рН пов'язані з амінокислотним складом ферментів.

Дзвоноподібна форма кривої пояснюється амфотерною природою ферментів; висхідна та низхідна гілки цієї кривої є типовими кривими титрування та визначається значеннями рК іонних груп, які знаходяться в активному центрі ферментів.

Для визначення функціональних груп, що входять до активного центру ферменту, необхідно визначити залежності активності цього ферменту від рН за різних температур і визначити значення рК. Знаючи значення ΔрК для кислої та лужної гілки залежності v = f(pH) знаходять функціональні групи, які відповідають цьому значенню.

IV. Всі речовини, що супроводжують фермент у процесі реакції, можна підрозділити на активатори, інгібітори та нейтральні сполуки.

Активатори– хімічні сполуки, що підвищують дію ферментів (наприклад, глютатіон активізує дію протеаз, NaCl збільшує активність амілаз); інгібітори– сполуки, що пригнічують їхню активність (наприклад, група –CN пригнічує активність дихальних ферментів, що знаходяться в цитохромній системі) та нейтральні сполукине впливають на ферменти.

Процес інгібування може бути оборотнимі незворотнім.

Зворотні інгібітори бувають:

· Конкурентної дії – інгібітор взаємодіє з функціональними групами активного центру ферментів. Інгібування у разі залежить від концентрації субстрату: якщо [S] велика, то вплив інгібітора [I] може проявлятися; якщо ж [S] мала, то інгібітор може витіснити субстрат із сполуки з ферментом, дія якого при цьому загальмовується. Потрійний комплекс ЕSI при конкурентному інгібуванні ніколи не утворюється.

· Безконкурентне інгібування спостерігається в тому випадку, коли інгібітор не здатний приєднуватися до ферменту, не може зв'язуватися з фермент-субстратним комплексом, переводячи його в неактивну форму.

· При змішаному пригніченні інгібітор діє як на ділянку зв'язування ES, так і на каталітичний центр ферменту.