§ 9. FIZIČKO-HEMIJSKA SVOJSTVA PROTEINA

Proteini su vrlo velike molekule, po veličini mogu biti inferiorne samo u odnosu na pojedinačne predstavnike nukleinskih kiselina i polisaharida. Tabela 4 prikazuje molekularne karakteristike nekih proteina.

Tabela 4

Molekularne karakteristike nekih proteina

	Relativna molekulska težina	Broj kola	Broj aminokiselinskih ostataka
Ribonukleaza
mioglobin
Chymotrypsin
Hemoglobin
Glutamat dehidrogenaza

Molekuli proteina mogu sadržavati vrlo različit broj aminokiselinskih ostataka - od 50 do nekoliko hiljada; relativne molekularne mase proteina također jako variraju - od nekoliko hiljada (insulin, ribonukleaza) do milion (glutamat dehidrogenaza) ili više. Broj polipeptidnih lanaca u proteinima može se kretati od jedne do nekoliko desetina ili čak hiljada. Dakle, protein virusa mozaika duhana sadrži 2120 protomera.

Poznavajući relativnu molekularnu težinu proteina, može se približno procijeniti koliko je aminokiselinskih ostataka uključeno u njegov sastav. Prosječna relativna molekulska težina aminokiselina koje formiraju polipeptidni lanac je 128. Kada se formira peptidna veza, molekul vode se odcijepi, stoga će prosječna relativna masa aminokiselinskog ostatka biti 128 - 18 = 110. Koristeći ove podatke, možemo izračunati da će se protein s relativnom molekularnom težinom od 100.000 sastojati od približno 909 aminokiselinskih ostataka.

Električna svojstva proteinskih molekula

Električna svojstva proteina određena su prisustvom pozitivno i negativno nabijenih aminokiselinskih ostataka na njihovoj površini. Prisustvo nabijenih proteinskih grupa određuje ukupni naboj proteinske molekule. Ako u proteinima prevladavaju negativno nabijene aminokiseline, tada će njegova molekula u neutralnoj otopini imati negativan naboj, ako prevladavaju pozitivno nabijene aminokiseline, molekul će imati pozitivan naboj. Ukupni naboj proteinskog molekula također ovisi o kiselosti (pH) podloge. S povećanjem koncentracije vodikovih iona (povećanje kiselosti), potiskuje se disocijacija karboksilnih grupa:

a istovremeno se povećava broj protoniranih amino grupa;

Dakle, s povećanjem kiselosti medija, broj negativno nabijenih grupa na površini proteinske molekule opada, a broj pozitivno nabijenih grupa raste. Sasvim drugačija slika se opaža sa smanjenjem koncentracije vodikovih iona i povećanjem koncentracije hidroksidnih iona. Povećava se broj disociranih karboksilnih grupa

a broj protoniranih amino grupa se smanjuje

Dakle, promjenom kiselosti medija može se promijeniti i naboj proteinskog molekula. Sa povećanjem kiselosti medija u proteinskoj molekuli, broj negativno nabijenih grupa se smanjuje, a broj pozitivno nabijenih grupa povećava, molekul postepeno gubi negativan i dobiva pozitivan naboj. Sa smanjenjem kiselosti otopine, uočava se suprotna slika. Očigledno, pri određenim pH vrijednostima, molekul će biti električno neutralan; broj pozitivno nabijenih grupa će biti jednak broju negativno nabijenih grupa, a ukupni naboj molekula će biti nula (slika 14).

pH vrijednost pri kojoj je ukupni naboj proteina nula naziva se izoelektrična točka i označava sepi.

Rice. 14. U stanju izoelektrične tačke, ukupni naboj proteinskog molekula je nula

Izoelektrična tačka za većinu proteina je u pH opsegu od 4,5 do 6,5. Međutim, postoje izuzeci. Ispod su izoelektrične tačke nekih proteina:

Na pH vrijednostima ispod izoelektrične točke, protein nosi ukupan pozitivan naboj, a iznad njega ukupan negativan naboj.

Na izoelektričnoj tački, topljivost proteina je minimalna, jer su njegove molekule u ovom stanju električno neutralne i između njih ne postoje sile međusobnog odbijanja, pa se mogu „zalijepiti“ zbog vodikovih i ionskih veza, hidrofobnih interakcija, van der Waalsove snage. Pri pH vrijednostima različitim od pI, proteinski molekuli će nositi isti naboj - bilo pozitivan ili negativan. Kao rezultat toga, između molekula će postojati elektrostatičke sile odbijanja, sprečavajući ih da se „lepe zajedno“, a rastvorljivost će biti veća.

Rastvorljivost proteina

Proteini su rastvorljivi i nerastvorljivi u vodi. Rastvorljivost proteina zavisi od njihove strukture, pH vrednosti, sastava soli rastvora, temperature i drugih faktora i određena je prirodom onih grupa koje se nalaze na površini proteinske molekule. Nerastvorljivi proteini uključuju keratin (kosa, nokti, perje), kolagen (tetive), fibroin (lužina, paučina). Mnogi drugi proteini su rastvorljivi u vodi. Rastvorljivost je određena prisustvom nabijenih i polarnih grupa na njihovoj površini (-COO -, -NH 3 +, -OH, itd.). Nabijene i polarne grupe proteina privlače molekule vode, a oko njih se formira hidratacijska ljuska (slika 15), čije postojanje određuje njihovu topljivost u vodi.

Rice. 15. Formiranje hidratacijske ljuske oko proteinske molekule.

Na rastvorljivost proteina utiče prisustvo neutralnih soli (Na 2 SO 4 , (NH 4) 2 SO 4 , itd.) u rastvoru. Pri niskim koncentracijama soli raste rastvorljivost proteina (slika 16), jer se u takvim uslovima povećava stepen disocijacije polarnih grupa i naelektrisane grupe proteinskih molekula su zaštićene, čime se smanjuje interakcija protein-protein, što doprinosi stvaranju agregati i taloženje proteina. Pri visokim koncentracijama soli, topljivost proteina se smanjuje (slika 16) zbog razaranja hidratacijske ljuske, što dovodi do agregacije proteinskih molekula.

Rice. 16. Ovisnost rastvorljivosti proteina o koncentraciji soli

Postoje proteini koji se otapaju samo u rastvorima soli, a ne rastvaraju se u čistoj vodi, takvi proteini se nazivaju globulini. Postoje i drugi proteini albumini, za razliku od globulina, vrlo su rastvorljivi u čistoj vodi.
Rastvorljivost proteina zavisi i od pH vrednosti rastvora. Kao što smo već napomenuli, proteini imaju minimalnu rastvorljivost na izoelektričnoj tački, što se objašnjava odsustvom elektrostatičkog odbijanja između proteinskih molekula.
Pod određenim uslovima, proteini mogu formirati gelove. Tokom formiranja gela, proteinski molekuli formiraju gustu mrežu, čija je unutrašnjost ispunjena rastvaračem. Gelovi formiraju, na primjer, želatin (ovaj protein se koristi za pravljenje želea) i mliječne proteine ​​u pripremi jogurta.
Temperatura takođe utiče na rastvorljivost proteina. Pod dejstvom visoke temperature, mnogi proteini se talože usled narušavanja njihove strukture, ali će o tome biti detaljnije reči u sledećem odeljku.

Denaturacija proteina

Razmotrimo dobro poznatu pojavu. Kada se bjelanjak zagrije, postepeno postaje zamućen, a zatim se formira čvrst ugrušak. Koagulirani bjelanjak - albumin jajeta - nakon hlađenja je nerastvorljiv, dok je prije zagrijavanja bjelanjak jako rastvorljiv u vodi. Isti fenomeni se javljaju kada se gotovo svi globularni proteini zagrijavaju. Promjene koje nastaju tokom zagrijavanja nazivaju se denaturacija. Proteini u svom prirodnom stanju se nazivaju native proteini, a nakon denaturacije - denaturisan.
Tokom denaturacije, nativna konformacija proteina je poremećena kao rezultat prekida slabih veza (jonske, vodikove, hidrofobne interakcije). Kao rezultat ovog procesa, kvartarne, tercijarne i sekundarne strukture proteina mogu biti uništene. Primarna struktura je očuvana (sl. 17).

Rice. 17. Denaturacija proteina

Prilikom denaturacije na površini se pojavljuju hidrofobni radikali aminokiselina, koji se nalaze u prirodnim proteinima u dubini molekula, kao rezultat toga stvaraju se uslovi za agregaciju. Agregati proteinskih molekula se talože. Denaturacija je praćena gubitkom biološke funkcije proteina.

Denaturacija proteina može biti uzrokovana ne samo povišenom temperaturom, već i drugim faktorima. Kiseline i alkalije mogu uzrokovati denaturaciju proteina: kao rezultat njihovog djelovanja, ionogene grupe se ponovno pune, što dovodi do prekida ionskih i vodikovih veza. Urea uništava vodonične veze, što rezultira gubitkom njihove prirodne strukture proteinima. Denaturirajuća sredstva su organski rastvarači i joni teških metala: organski rastvarači uništavaju hidrofobne veze, a joni teških metala formiraju nerastvorljive komplekse sa proteinima.

Uz denaturaciju, postoji i obrnuti proces - renaturacija. Uklanjanjem denaturirajućeg faktora moguće je vratiti izvornu nativnu strukturu. Na primjer, kada se otopina polako ohladi na sobnu temperaturu, obnavljaju se nativna struktura i biološka funkcija tripsina.

Proteini se također mogu denaturirati u ćeliji tokom normalnih životnih procesa. Sasvim je očigledno da je gubitak prirodne strukture i funkcije proteina krajnje nepoželjan događaj. S tim u vezi, treba spomenuti posebne proteine ​​- chaperones. Ovi proteini mogu prepoznati djelomično denaturirane proteine ​​i, vezanjem za njih, vratiti njihovu nativnu konformaciju. Šaperoni takođe prepoznaju proteine ​​koji su daleko od denaturacije i transportuju ih do lizozoma gde se razgrađuju. Šaperoni takođe igraju važnu ulogu u formiranju tercijarnih i kvartarnih struktura tokom sinteze proteina.

Zanimljivo je znati! Trenutno se često spominje bolest kao što je kravlje ludilo. Ovu bolest uzrokuju prioni. Oni također mogu uzrokovati druge neurodegenerativne bolesti kod životinja i ljudi. Prioni su proteinski infektivni agensi. Kada prion uđe u ćeliju, on uzrokuje promjenu u konformaciji svog ćelijskog parnjaka, koji i sam postaje prion. Ovako nastaje bolest. Prionski protein se razlikuje od ćelijskog proteina po svojoj sekundarnoj strukturi. Prionski oblik proteina je uglavnomb-naborana struktura, i ćelijska -a- spirala.

Donjeck srednja škola I - III stepena br. 21

"Vjeverice. Dobivanje proteina reakcijom polikondenzacije aminokiselina. Primarne, sekundarne i tercijarne strukture proteina. Hemijska svojstva proteina: sagorijevanje, denaturacija, hidroliza i reakcije boje. Biohemijske funkcije proteina".

Pripremljeno

nastavnik hemije

nastavnik - metodičar

Donjeck, 2016

“Život je način postojanja proteinskih tijela”

Tema lekcije. Vjeverice. Dobivanje proteina reakcijom polikondenzacije aminokiselina. Primarne, sekundarne i tercijarne strukture proteina. Hemijska svojstva proteina: sagorijevanje, denaturacija, hidroliza i reakcije boje. Biohemijske funkcije proteina.

Ciljevi lekcije. Upoznati učenike sa proteinima kao najvišim stepenom razvoja supstanci u prirodi koji su doveli do nastanka života; pokazati njihovu strukturu, svojstva i raznovrsnost bioloških funkcija; proširiti pojam reakcije polikondenzacije na primjeru dobijanja proteina, informisati školarce o higijeni hrane, o očuvanju njihovog zdravlja. Razvijati logičko mišljenje kod učenika.

Reagensi i oprema. Tabela "Primarne, sekundarne i tercijarne strukture proteina". Reagensi: HNO3, NaOH, CuSO4, pileći proteini, vuneni konac, hemijsko stakleno posuđe.

metod lekcije. Informacije i razvoj.

Vrsta lekcije. Lekcija o savladavanju novih znanja i vještina.

Tokom nastave

I. Organiziranje vremena.

II. Provjera domaćih zadataka, ažuriranje i ispravljanje osnovnih znanja.

Blitz anketa

1. Objasnite pojam "aminokiselina".

2. Navedite funkcionalne grupe koje čine aminokiseline.

3. Nomenklatura aminokiselina i njihova izomerija.

4. Zašto aminokiseline pokazuju amfoterna svojstva? Napišite jednadžbe hemijskih reakcija.

5. Zbog kojih svojstava aminokiseline formiraju polipeptide. Napišite reakciju polikondenzacije aminokiselina.

III. Poruka teme, ciljevi časa, motivacija obrazovnih aktivnosti.

IV. Percepcija i početna svijest o novom materijalu.

Učitelju.

“Gdje god sretnemo život, otkrivamo da je povezan s nekom vrstom proteinskog tijela”, napisao je F. Engels u svojoj knjizi “Anti-Dühring”. Nedostatak proteina u hrani dovodi do općeg slabljenja organizma, kod djece - do usporavanja mentalnog i fizičkog razvoja. Danas više od polovine čovečanstva ne dobija potrebnu količinu proteina iz hrane. Čovjeku je dnevno potrebno 115 g bjelančevina, proteini se ne pohranjuju u rezervi, za razliku od ugljikohidrata i masti, pa morate pratiti svoju ishranu. Poznat nam je keratin – protein koji čini kosu, nokte, perje, kožu – obavlja funkciju izgradnje; upoznati sa proteinom pepsinom – nalazi se u želučanom soku i sposoban je da uništi druge proteine ​​tokom probave; protein trombin je uključen u zgrušavanje krvi; hormon pankreasa - insulin - reguliše metabolizam glukoze; hemoglobin prenosi O2 do svih ćelija i tkiva u tijelu, itd.

Odakle dolazi ova beskrajna raznolikost proteinskih molekula, raznolikost njihovih funkcija i njihova posebna uloga u životnim procesima? Da bismo odgovorili na ovo pitanje, osvrnimo se na sastav i strukturu proteina.

Da li se proteini sastoje od atoma?

Da bismo odgovorili na ovo pitanje, uradimo zagrevanje. Pogodite zagonetke i objasnite značenje odgovora.

1. On je svuda i svuda:

U kamenu, u vazduhu, u vodi.

On je na jutarnjoj rosi

I plavo na nebu.

(kiseonik)

2. Ja sam najlakši element,

U prirodi, ni koraka bez mene.

A sa kiseonikom sam trenutno

3. U vazduhu, to je glavni gas,

Okružuje nas svuda.

Život biljaka blijedi

Bez toga, bez đubriva.

Živi u našim ćelijama

4. Školarci su išli na planinarenje

(Ovo je pristup hemijskom problemu).

Noću je mjesec palio vatru,

Pevale su se pesme o svetloj vatri.

Odbacite svoje osjećaje:

Koji su elementi izgorjeli u požaru?

(ugljenik, vodonik)

Da, tako je, ovo su glavni hemijski elementi koji čine protein.

Ova četiri elementa mogu se reći Šilerovim rečima: „Četiri elementa, stapajući se zajedno, daju život i grade svet“.

Proteini su prirodni polimeri koji se sastoje od ostataka α-aminokiselina povezanih peptidnim vezama.

Sastav proteina uključuje 20 različitih aminokiselina, pa otuda i ogromna raznolikost proteina u njihovim različitim kombinacijama. U ljudskom tijelu postoji do 100.000 proteina.

Istorijat.

Prva hipoteza o strukturi proteinske molekule predložena je 70-ih godina. 19. vek Ovo je bila ureidna teorija strukture proteina.

Godine 1903 Njemački naučnici izrazili su peptidnu teoriju, koja je dala ključ za misteriju strukture proteina. Fisher je sugerirao da su proteini polimeri aminokiselina povezanih peptidnim vezama.

Ideja da su proteini polimerne formacije izražena je već 70-88 godina. 19. vek , ruski naučnici. Ova teorija je potvrđena u savremenim radovima.

Već prvo upoznavanje s proteinima daje neku ideju o izuzetno složenoj strukturi njihovih molekula. Proteini se dobijaju reakcijom polikondenzacije aminokiselina:

https://pandia.ru/text/80/390/images/image007_47.gif" width="16" height="18">H - N - CH2 - C + H - N - CH2 - C →

https://pandia.ru/text/80/390/images/image012_41.gif" height="20">

NH2 - CH - C - N - CH - C - N - CH - C - ... + nH2O →

⸗ O ⸗ O ⸗ O

→ NH2 – CH – C + NH2 – CH – C + NH2 – CH – C + …

̀ OH ̀ OH ̀ OH

4. Nastavnik demonstrira iskustvo: spaljivanje vunenog konca; osjeća se miris spaljenog perja - tako možete razlikovati vunu od tkanina drugih vrsta.

V. Generalizacija i sistematizacija znanja.

1. Napravite osnovni sažetak proteina.

osnova života ← Proteini → polipeptidi

(C, H, O, N) ↓ ↓ ↓ \ proteinske strukture

hemijske funkcije boja

koja svojstva proteinskih reakcija

2. Napišite jednadžbe reakcije za formiranje dipeptida iz glicina i valina.

VI. Sumiranje lekcije, domaći zadatak.

Naučite §38 str. 178 - 184. Izvršite testne zadatke str. 183.

br. 1. Proteini: peptidna veza, njihova detekcija.

Proteini su makromolekule linearnih poliamida formiranih od a-aminokiselina kao rezultat reakcije polikondenzacije u biološkim objektima.

Vjeverice su makromolekularna jedinjenja izgrađena od amino kiseline. 20 aminokiselina učestvuje u stvaranju proteina. Oni se međusobno povezuju u dugačke lance koji čine okosnicu proteinske molekule velike molekularne težine.

Funkcije proteina u tijelu

Kombinacija posebnih hemijskih i fizičkih svojstava proteina daje ovoj posebnoj klasi organskih jedinjenja centralnu ulogu u fenomenima života.

Proteini imaju sljedeća biološka svojstva ili obavljaju sljedeće glavne funkcije u živim organizmima:

1. Katalitička funkcija proteina. Svi biološki katalizatori - enzimi su proteini. Do danas su okarakterisane hiljade enzima, od kojih su mnogi izolovani u kristalnom obliku. Gotovo svi enzimi su moćni katalizatori, koji povećavaju stopu reakcija najmanje milion puta. Ova funkcija proteina je jedinstvena, nije karakteristična za druge polimerne molekule.

2. Nutritivna (rezervna funkcija proteina). To su, prije svega, proteini namijenjeni za ishranu embriona u razvoju: mlečni kazein, ovalbumin jaja, proteini za skladištenje sjemena biljaka. Brojni drugi proteini se nesumnjivo koriste u tijelu kao izvor aminokiselina, koje su pak prekursori biološki aktivnih tvari koje reguliraju metabolički proces.

3. Transportna funkcija proteina. Mnogi mali molekuli i joni se prenose specifičnim proteinima. Na primjer, respiratornu funkciju krvi, odnosno transport kisika, obavljaju molekule hemoglobina, proteina u crvenim krvnim zrncima. Serumski albumini su uključeni u transport lipida. Brojni drugi proteini surutke formiraju komplekse sa mastima, bakrom, gvožđem, tiroksinom, vitaminom A i drugim jedinjenjima, obezbeđujući njihovu dostavu do odgovarajućih organa.

4. Zaštitna funkcija proteina. Glavnu funkciju zaštite obavlja imunološki sistem, koji obezbeđuje sintezu specifičnih zaštitnih proteina - antitela - kao odgovor na ulazak bakterija, toksina ili virusa (antigena) u organizam. Antitijela vezuju antigene u interakciji s njima i na taj način neutraliziraju njihov biološki učinak i održavaju normalno stanje organizma. Koagulacija proteina krvne plazme - fibrinogena - i stvaranje krvnog ugruška koji štiti od gubitka krvi tijekom ozljeda je još jedan primjer zaštitne funkcije proteina.

5. Kontraktilna funkcija proteina. Mnogi proteini su uključeni u čin kontrakcije i opuštanja mišića. Glavnu ulogu u ovim procesima imaju aktin i miozin - specifični proteini mišićnog tkiva. Kontraktilna funkcija je također inherentna proteinima supćelijskih struktura, što osigurava najfinije procese vitalne aktivnosti stanice,

6. Strukturna funkcija proteina. Proteini s ovom funkcijom zauzimaju prvo mjesto među ostalim proteinima u ljudskom tijelu. Strukturni proteini kao što je kolagen su široko raspoređeni u vezivnom tkivu; keratin u kosi, noktima, koži; elastin - u vaskularnim zidovima itd.

7. Hormonska (regulatorna) funkcija proteina. Metabolizam u tijelu reguliran je različitim mehanizmima. U ovoj regulativi značajno mjesto zauzimaju hormoni koje proizvode endokrine žlijezde. Brojni hormoni su predstavljeni proteinima ili polipeptidima, na primjer, hormoni hipofize, gušterače itd.

Peptidna veza

Formalno, formiranje proteinske makromolekule može se predstaviti kao reakcija polikondenzacije α-aminokiselina.

Sa hemijske tačke gledišta, proteini su visokomolekularna organska jedinjenja koja sadrže azot (poliamidi), čiji su molekuli izgrađeni od ostataka aminokiselina. Proteinski monomeri su α-amino kiseline, čija je zajednička karakteristika prisustvo karboksilne grupe -COOH i amino grupe -NH 2 na drugom atomu ugljika (α-ugljikov atom):

Na osnovu rezultata proučavanja proizvoda hidrolize proteina koje je iznio A.Ya. Ideje Danilevskog o ulozi peptidnih veza -CO-NH- u izgradnji proteinskog molekula, njemački naučnik E. Fischer je početkom 20. vijeka predložio peptidnu teoriju strukture proteina. Prema ovoj teoriji, proteini su linearni polimeri α-aminokiselina povezanih peptidom veza - polipeptidi:

U svakom peptidu, jedan terminalni aminokiselinski ostatak ima slobodnu α-amino grupu (N-terminus), a drugi ima slobodnu α-karboksilnu grupu (C-terminus). Struktura peptida obično se prikazuje počevši od N-terminalne aminokiseline. U ovom slučaju, aminokiselinski ostaci su označeni simbolima. Na primjer: Ala-Tyr-Leu-Ser-Tyr- - Cys. Ovaj unos označava peptid u kojem je N-terminalna α-amino kiselina ­ lyatsya alanin i C-terminal - cistein. Prilikom čitanja takvog zapisa završeci naziva svih kiselina, osim zadnjih, mijenjaju se u - "il": alanil-tirozil-leucil-seril-tirozil--cistein. Dužina peptidnog lanca u peptidima i proteinima koji se nalaze u tijelu kreće se od dvije do stotine i hiljade aminokiselinskih ostataka.

br. 2. Klasifikacija jednostavnih proteina.

To jednostavno (proteini) uključuju proteine ​​koji, kada se hidroliziraju, daju samo aminokiseline.

Proteinoidi ____jednostavni proteini životinjskog porekla, nerastvorljivi u vodi, rastvorima soli, razblaženim kiselinama i alkalijama. Obavljaju uglavnom potporne funkcije (na primjer, kolagen, keratin

protamine - pozitivno nabijeni nuklearni proteini, molekulske težine 10-12 kDa. Otprilike 80% se sastoji od alkalnih aminokiselina, što im omogućava interakciju s nukleinskim kiselinama putem jonskih veza. Oni učestvuju u regulaciji aktivnosti gena. Dobro rastvorljiv u vodi;

histons - nuklearni proteini koji igraju važnu ulogu u regulaciji aktivnosti gena. Nalaze se u svim eukariotskim stanicama, a podijeljene su u 5 klasa, koje se razlikuju po molekularnoj težini i aminokiselinama. Molekularna težina histona je u rasponu od 11 do 22 kDa, a razlike u sastavu aminokiselina odnose se na lizin i arginin, čiji sadržaj varira od 11 do 29%, odnosno od 2 do 14%;

prolamini - nerastvorljiv u vodi, ali rastvorljiv u 70% alkoholu, karakteristike hemijske strukture - puno prolina, glutaminske kiseline, bez lizina ,

glutelina - rastvorljiv u alkalnim rastvorima ,

globulini - proteini koji su netopivi u vodi i poluzasićenom rastvoru amonijum sulfata, ali rastvorljivi u vodenim rastvorima soli, lužina i kiselina. Molekularna težina - 90-100 kDa;

albumini - proteini životinjskih i biljnih tkiva, rastvorljivi u vodi i slanim rastvorima. Molekularna težina je 69 kDa;

skleroproteini - proteini potpornog tkiva životinja

Primjeri jednostavnih proteina su fibroin svile, albumin seruma jaja, pepsin itd.

Broj 3. Metode izolacije i precipitacije (prečišćavanja) proteina.

br. 4. Proteini kao polielektroliti. Izoelektrična tačka proteina.

Proteini su amfoterni polielektroliti, tj. pokazuju i kisela i bazična svojstva. To je zbog prisustva u proteinskim molekulima radikala aminokiselina sposobnih za jonizaciju, kao i slobodnih α-amino i α-karboksilnih grupa na krajevima peptidnih lanaca. Kisela svojstva proteina daju kisele aminokiseline (asparaginska, glutaminska), a alkalna svojstva - bazične aminokiseline (lizin, arginin, histidin).

Naboj proteinske molekule zavisi od jonizacije kiselih i baznih grupa aminokiselinskih radikala. Ovisno o odnosu negativnih i pozitivnih grupa, proteinska molekula kao cjelina poprima ukupan pozitivan ili negativan naboj. Kada se rastvor proteina zakiseli, stepen jonizacije anjonskih grupa se smanjuje, dok se povećava stepen ionizacije kationskih grupa; kada se alkalizira - obrnuto. Pri određenoj pH vrijednosti, broj pozitivno i negativno nabijenih grupa postaje isti, a pojavljuje se izoelektrično stanje proteina (ukupni naboj je 0). pH vrijednost na kojoj je protein u izoelektričnom stanju naziva se izoelektrična tačka i označava se kao pI, slično aminokiselinama. Za većinu proteina, pI je u rasponu od 5,5-7,0, što ukazuje na određenu dominaciju kiselih aminokiselina u proteinima. Međutim, postoje i alkalni proteini, na primjer, losos - glavni protein iz mljevenog lososa (pl=12). Osim toga, postoje proteini koji imaju vrlo nisku vrijednost pI, na primjer, pepsin, enzim želudačnog soka (pl=l). Na izoelektričnoj tački, proteini su vrlo nestabilni i lako se talože, imaju najmanju rastvorljivost.

Ako protein nije u izoelektričnom stanju, tada će se u električnom polju njegovi molekuli kretati prema katodi ili anodi, ovisno o predznaku ukupnog naboja i brzinom proporcionalnom njegovoj vrijednosti; ovo je suština metode elektroforeze. Ova metoda može odvojiti proteine ​​s različitim vrijednostima pI.

Iako proteini imaju puferska svojstva, njihov kapacitet pri fiziološkim pH vrijednostima je ograničen. Izuzetak su proteini koji sadrže mnogo histidina, jer samo histidinski radikal ima puferska svojstva u pH rasponu od 6-8. Ovih proteina je vrlo malo. Na primjer, hemoglobin, koji sadrži skoro 8% histidina, je moćan intracelularni pufer u crvenim krvnim zrncima, održavajući pH krvi na konstantnom nivou.

br. 5. Fizičko-hemijska svojstva proteina.

Proteini imaju različita hemijska, fizička i biološka svojstva, koja su određena sastavom aminokiselina i prostornom organizacijom svakog proteina. Hemijske reakcije proteina su vrlo raznolike, a nastaju zbog prisustva NH 2 -, COOH grupa i radikala različite prirode. To su reakcije nitracije, acilacije, alkilacije, esterifikacije, redoks i druge. Proteini imaju kiselo-bazna, puferska, koloidna i osmotska svojstva.

Acid-bazna svojstva proteina

Hemijska svojstva. Sa slabim zagrijavanjem vodenih otopina proteina dolazi do denaturacije. Ovo stvara talog.

Kada se proteini zagriju s kiselinama, dolazi do hidrolize i formira se mješavina aminokiselina.

Fizičko-hemijska svojstva proteina

Proteini imaju visoku molekularnu težinu.

Naboj proteinske molekule. Svi proteini imaju najmanje jednu slobodnu -NH i -COOH grupu.

Proteinske otopine- koloidne otopine različitih svojstava. Proteini su kiseli i bazični. Kiseli proteini sadrže mnogo glu i asp, koji imaju dodatne karboksilne i manje amino grupa. U alkalnim proteinima postoji mnogo lys-a i arg-ova. Svaki proteinski molekul u vodenom rastvoru okružen je hidratantnom ljuskom, budući da proteini imaju mnogo hidrofilnih grupa (-COOH, -OH, -NH 2, -SH) zbog aminokiselina. U vodenim rastvorima, proteinski molekul ima naelektrisanje. Naboj proteina u vodi može se mijenjati ovisno o pH vrijednosti.

Precipitacija proteina. Proteini imaju hidratantnu ljusku, naboj koji sprječava lijepljenje. Za taloženje, potrebno je ukloniti hidratnu školjku i napuniti.

1. Hidratacija. Proces hidratacije podrazumijeva vezivanje vode bjelančevinama, dok oni ispoljavaju hidrofilna svojstva: bubre, povećavaju se njihova masa i volumen. Oticanje proteina je praćeno njegovim djelomičnim otapanjem. Hidrofilnost pojedinih proteina zavisi od njihove strukture. Hidrofilne amidne (–CO–NH–, peptidna veza), aminske (NH2) i karboksilne (COOH) grupe prisutne u sastavu i smještene na površini proteinske makromolekule privlače molekule vode, striktno ih orijentirajući na površinu molekule . Oko proteinskih globula, hidratna (vodena) ljuska sprečava stabilnost proteinskih rastvora. Na izoelektričnoj tački, proteini imaju najmanju sposobnost da vežu vodu, hidrataciona ljuska oko proteinskih molekula je uništena, pa se kombinuju i formiraju velike agregate. Do agregacije proteinskih molekula dolazi i kada se dehidriraju nekim organskim rastvaračima, kao što je etil alkohol. To dovodi do taloženja proteina. Kada se pH medijuma promeni, proteinska makromolekula postaje naelektrisana, a njen kapacitet hidratacije se menja.

Reakcije precipitacije dijele se u dvije vrste.

Soljenje proteina: (NH 4)SO 4 - uklanja se samo hidratantna ljuska, protein zadržava sve vrste svoje strukture, sve veze, zadržava svoja nativna svojstva. Takvi proteini se zatim mogu ponovo rastvoriti i koristiti.

Taloženje sa gubitkom svojstava prirodnog proteina je nepovratan proces. Hidracijska ljuska i naboj se uklanjaju iz proteina, narušena su različita svojstva proteina. Na primjer, soli bakra, žive, arsena, željeza, koncentrisane neorganske kiseline - HNO 3 , H 2 SO 4 , HCl, organske kiseline, alkaloidi - tanini, živin jodid. Dodatak organskih rastvarača smanjuje stepen hidratacije i dovodi do taloženja proteina. Kao takav rastvarač koristi se aceton. Proteini se također talože uz pomoć soli, na primjer, amonijum sulfata. Princip ove metode zasniva se na činjenici da se povećanjem koncentracije soli u otopini komprimiraju ionske atmosfere koje formiraju protuioni proteina, što doprinosi njihovoj konvergenciji do kritične udaljenosti, na kojoj intermolekularne sile van der Waalsovo privlačenje nadmašuje Kulonove sile odbijanja protujona. To dovodi do adhezije proteinskih čestica i njihovog taloženja.

Prilikom ključanja, proteinski molekuli počinju se nasumično kretati, sudaraju se, naboj se uklanja, a hidratacijski omotač se smanjuje.

Za otkrivanje proteina u otopini koriste se sljedeće:

reakcije u boji;

reakcije precipitacije.

Metode izolacije i pročišćavanja proteina.

homogenizacija- ćelije se samelju do homogene mase;

ekstrakcija proteina vodom ili rastvorima vode i soli;

1. soljenje;

   elektroforeza;

   hromatografija: adsorpcija, cijepanje;

   ultracentrifugiranje.

Strukturna organizacija proteina.

Primarna struktura- određena redoslijedom aminokiselina u peptidnom lancu, stabiliziranih kovalentnim peptidnim vezama (insulin, pepsin, himotripsin).

sekundarna struktura- prostorna struktura proteina. Ovo je ili spirala ili preklapanje. Stvaraju se vodonične veze.

Tercijarna struktura globularnih i fibrilarnih proteina. Stabiliziraju vodonične veze, elektrostatičke sile (COO-, NH3+), hidrofobne sile, sulfidne mostove, određene su primarnom strukturom. Globularni proteini - svi enzimi, hemoglobin, mioglobin. Fibrilarni proteini - kolagen, miozin, aktin.

Kvartarna struktura- nalazi se samo u nekim proteinima. Takvi proteini su izgrađeni od nekoliko peptida. Svaki peptid ima svoju primarnu, sekundarnu, tercijarnu strukturu, nazvanu protomeri. Nekoliko protomera se spaja u jedan molekul. Jedan protomer ne funkcionira kao protein, već samo u sprezi s drugim protomerima.

primjer: hemoglobin \u003d -globula + -globule - nosi O 2 u agregatu, a ne odvojeno.

Protein se može regenerirati. Ovo zahtijeva vrlo kratko izlaganje agensima.

6) Metode za detekciju proteina.

Proteini su visokomolekularni biološki polimeri, čije su strukturne (monomerne) jedinice -aminokiseline. Aminokiseline u proteinima su međusobno povezane peptidnim vezama. do čijeg stvaranja dolazi zbog karboksilne grupe koja stoji na - atom ugljenika jedne aminokiseline i -aminska grupa druge aminokiseline sa oslobađanjem molekula vode. Monomerne jedinice proteina nazivaju se aminokiselinskim ostacima.

Peptidi, polipeptidi i proteini razlikuju se ne samo po količini, sastavu, već i po redoslijedu aminokiselinskih ostataka, fizičko-hemijskim svojstvima i funkcijama koje se obavljaju u tijelu. Molekularna težina proteina varira od 6 hiljada do 1 milion ili više. Hemijska i fizička svojstva proteina su posljedica hemijske prirode i fizičko-hemijskih svojstava radikala koji čine njihove aminokiselinske ostatke. Metode detekcije i kvantifikacije proteina u biološkim objektima i namirnicama, kao i njihovo izolovanje iz tkiva i bioloških tečnosti, zasnivaju se na fizičkim i hemijskim svojstvima ovih jedinjenja.

Proteini u interakciji sa određenim hemikalijama daju obojena jedinjenja. Formiranje ovih spojeva odvija se uz sudjelovanje radikala aminokiselina, njihovih specifičnih grupa ili peptidnih veza. Reakcije boja vam omogućavaju postavljanje prisustvo proteina u biološkom objektu ili rješenje i dokazati prisustvo određene aminokiseline u molekulu proteina. Na osnovu reakcija u boji razvijene su neke metode za kvantitativno određivanje proteina i aminokiselina.

Smatrajte univerzalnim reakcije biureta i ninhidrina, jer ih daju svi proteini. Ksantoproteinska reakcija, Fohl reakcija a drugi su specifični, jer nastaju zbog radikalnih grupa određenih aminokiselina u proteinskom molekulu.

Reakcije u boji omogućuju vam da utvrdite prisutnost proteina u materijalu koji se proučava i prisutnost određenih aminokiselina u njegovim molekulima.

Biuretna reakcija. Reakcija je zbog prisustva u proteinima, peptidima, polipeptidima peptidne veze, koji u alkalnom mediju oblikuje sa joni bakra(II). kompleksna jedinjenja obojena u ljubičaste (sa crvenom ili plavom nijansom) boje. Boja je posljedica prisustva najmanje dvije grupe u molekulu -CO-NH- direktno međusobno ili uz učešće atoma ugljika ili dušika.

Joni bakra (II) su povezani sa dvije jonske veze sa =C─O ˉ grupama i četiri koordinacione veze sa atomima dušika (=N−).

Intenzitet boje zavisi od količine proteina u rastvoru. Ovo omogućava korištenje ove reakcije za kvantitativno određivanje proteina. Boja obojenih rastvora zavisi od dužine polipeptidnog lanca. Proteini daju plavo-ljubičastu boju; proizvodi njihove hidrolize (poli- i oligopeptidi) su crvene ili ružičaste boje. Biuretsku reakciju daju ne samo proteini, peptidi i polipeptidi, već i biuret (NH 2 -CO-NH-CO-NH 2), oksamid (NH 2 -CO-CO-NH 2), histidin.

Kompleksno jedinjenje bakra (II) sa peptidnim grupama formiranim u alkalnom mediju ima sledeću strukturu:

Ninhidrinska reakcija. U ovoj reakciji, rastvori proteina, polipeptida, peptida i slobodnih α-amino kiselina, kada se zagreju sa ninhidrinom, daju plavu, plavo-ljubičastu ili ružičasto-ljubičastu boju. Boja u ovoj reakciji nastaje zbog α-amino grupe.

-aminokiseline vrlo lako reaguju sa ninhidrinom. Uz njih, Ruemanovu plavo-ljubičastu tvore i proteini, peptidi, primarni amini, amonijak i neka druga jedinjenja. Sekundarni amini, kao što su prolin i hidroksiprolin, daju žutu boju.

Reakcija ninhidrina se široko koristi za otkrivanje i kvantificiranje aminokiselina.

ksantoproteinska reakcija. Ova reakcija ukazuje na prisustvo ostataka aromatičnih aminokiselina u proteinima - tirozin, fenilalanin, triptofan. Zasnovan je na nitriranju benzenskog prstena radikala ovih aminokiselina uz stvaranje žuto obojenih nitro spojeva (grčki "Xanthos" - žuto). Koristeći tirozin kao primjer, ova reakcija se može opisati u obliku sljedećih jednačina.

U alkalnoj sredini, nitro derivati ​​aminokiselina formiraju soli kinoidne strukture, obojene narandžasto. Ksantoproteinsku reakciju daju benzen i njegovi homolozi, fenol i druga aromatična jedinjenja.

Reakcije na aminokiseline koje sadrže tiolnu grupu u reduciranom ili oksidiranom stanju (cistein, cistin).

Fohlova reakcija. Kada se prokuva sa alkalijom, sumpor se lako odvaja od cisteina u obliku sumporovodika, koji u alkalnom mediju stvara natrijum sulfid:

U tom smislu, reakcije za određivanje aminokiselina koje sadrže tiol u otopini dijele se u dvije faze:

Prelazak sumpora iz organskog u anorgansko stanje

Detekcija sumpora u rastvoru

Za otkrivanje natrijevog sulfida koristi se olovni acetat, koji se u interakciji s natrijevim hidroksidom pretvara u svoj plumbit:

Pb(CH 3 COO) 2 + 2NaOH Pb(ONa) 2 + 2CH 3 COOH

Kao rezultat interakcije iona sumpora i olova, nastaje crni ili smeđi olovni sulfid:

N / A 2 S + Pb(Na) 2 + 2 H 2 O PbS (crni talog) + 4NaOH

Da bi se odredile aminokiseline koje sadrže sumpor, u test otopinu se dodaje jednaka zapremina natrijevog hidroksida i nekoliko kapi otopine olovnog acetata. Kod intenzivnog ključanja 3-5 minuta tečnost postaje crna.

Prisustvo cistina se može odrediti pomoću ove reakcije, jer se cistin lako reducira u cistein.

Millonova reakcija:

Ovo je reakcija na aminokiselinu tirozin.

Slobodni fenolni hidroksili molekula tirozina, u interakciji sa solima, daju spojeve živine soli nitro derivata tirozina, obojene ružičasto crveno:

Paulijeva reakcija na histidin i tirozin . Paulijeva reakcija omogućava otkrivanje aminokiselina histidin i tirozin u proteinu, koji formiraju kompleksne spojeve višnje-crvene s diazobenzensulfonskom kiselinom. Diazobenzensulfonska kiselina nastaje u reakciji diazotizacije kada sulfanilna kiselina reaguje sa natrijum nitritom u kiseloj sredini:

Jednaka zapremina kiselog rastvora sulfanilne kiseline (pripremljene pomoću hlorovodonične kiseline) i dupla zapremina rastvora natrijum nitrita dodaju se ispitivanoj otopini, dobro promešaju i odmah se doda soda (natrijum karbonat). Nakon miješanja, smjesa postaje trešnja crvena, pod uslovom da su histidin ili tirozin prisutni u test otopini.

Adamkevich-Hopkins-Kohl (Schulz-Raspail) reakcija na triptofan (reakcija na indol grupu). Triptofan reagira u kiseloj sredini s aldehidima, stvarajući obojene kondenzacijske produkte. Reakcija se odvija zbog interakcije indolnog prstena triptofana s aldehidom. Poznato je da se formaldehid formira iz glioksilne kiseline u prisustvu sumporne kiseline:

R
Otopine koje sadrže triptofan u prisustvu glioksilne i sumporne kiseline daju crveno-ljubičastu boju.

Glioksilna kiselina je uvijek prisutna u malim količinama u glacijalnoj sirćetnoj kiselini. Stoga se reakcija može izvesti pomoću octene kiseline. Istovremeno se ispitnom rastvoru dodaje jednaka zapremina glacijalne (koncentrovane) sirćetne kiseline i lagano se zagreva dok se talog ne rastvori.Nakon hlađenja dodaje se zapremina koncentrovane sumporne kiseline jednaka dodanoj zapremini glioksilne kiseline. pažljivo miješajte duž zida (kako biste izbjegli miješanje tekućina). Nakon 5-10 minuta uočava se formiranje crveno-ljubičastog prstena na granici između dva sloja. Ako pomiješate slojeve, sadržaj posude će ravnomjerno postati ljubičast.

To

kondenzacija triptofana sa formaldehidom:

Produkt kondenzacije se oksidira u bis-2-triptofanilkarbinol, koji u prisustvu mineralnih kiselina stvara plavo-ljubičaste soli:

7) Klasifikacija proteina. Metode za proučavanje sastava aminokiselina.

Stroga nomenklatura i klasifikacija proteina još uvijek ne postoji. Nazivi proteina daju se nasumično, najčešće uzimajući u obzir izvor izolacije proteina ili uzimajući u obzir njegovu rastvorljivost u određenim rastvaračima, oblik molekula itd.

Proteini se klasifikuju prema sastavu, obliku čestica, rastvorljivosti, sastavu aminokiselina, porijeklu itd.

1. Kompozicija Proteini se dijele u dvije velike grupe: jednostavne i složene proteine.

Jednostavni (proteini) uključuju proteine ​​koji hidrolizom daju samo aminokiseline (proteinoidi, protamini, histoni, prolamini, glutelini, globulini, albumini). Primjeri jednostavnih proteina su fibroin svile, albumin seruma jaja, pepsin itd.

Složeni (proteidi) uključuju proteine ​​sastavljene od jednostavnog proteina i dodatne (prostetske) grupe neproteinske prirode. Grupa kompleksnih proteina podijeljena je u nekoliko podgrupa ovisno o prirodi neproteinske komponente:

Metaloproteini koji u svom sastavu sadrže metale (Fe, Cu, Mg, itd.) direktno povezane sa polipeptidnim lancem;

Fosfoproteini - sadrže ostatke fosforne kiseline, koji su vezani za proteinski molekul esterskim vezama na mjestu hidroksilnih grupa serina, treonina;

Glikoproteini - njihove prostetske grupe su ugljikohidrati;

Hromoproteini - sastoje se od jednostavnog proteina i obojenog neproteinskog spoja povezanog s njim, svi hromoproteini su biološki vrlo aktivni; kao prostetičke grupe, mogu sadržavati derivate porfirina, izoaloksazina i karotena;

Lipoproteini - lipidi prostetske grupe - trigliceridi (masti) i fosfatidi;

Nukleoproteini su proteini koji se sastoje od jednog proteina i nukleinske kiseline povezane s njim. Ovi proteini igraju kolosalnu ulogu u životu tijela i o njima će biti riječi u nastavku. Oni su dio bilo koje stanice, neki nukleoproteini postoje u prirodi u obliku posebnih čestica s patogenom aktivnošću (virusi).

2. Oblik čestica- proteini se dijele na fibrilarne (nitaste) i globularne (sferične) (vidi str. 30).

3. Po rastvorljivosti i karakteristikama sastava aminokiselina razlikuju se sljedeće grupe jednostavnih proteina:

Proteinoidi - proteini potpornih tkiva (kosti, hrskavice, ligamenti, tetive, kosa, nokti, koža, itd.). To su uglavnom fibrilarni proteini velike molekularne težine (>150.000 Da), nerastvorljivi u uobičajenim rastvaračima: voda, sol i mješavine vode i alkohola. Rastvaraju se samo u određenim rastvaračima;

Protamini (najjednostavniji proteini) - proteini koji su topljivi u vodi i sadrže 80-90% arginina i ograničen skup (6-8) drugih aminokiselina, prisutni su u mlijeku raznih riba. Zbog visokog sadržaja arginina, imaju osnovna svojstva, njihova molekularna težina je relativno mala i približno je jednaka 4000-12000 Da. Oni su proteinska komponenta u sastavu nukleoproteina;

Histoni su vrlo topljivi u vodi i razrijeđenim kiselim otopinama (0,1 N), imaju visok sadržaj aminokiselina: arginina, lizina i histidina (najmanje 30%) i stoga imaju bazična svojstva. Ovi proteini se nalaze u značajnim količinama u jezgrima stanica kao dio nukleoproteina i igraju važnu ulogu u regulaciji metabolizma nukleinskih kiselina. Molekularna težina histona je mala i iznosi 11000-24000 Da;

Globulini su proteini koji su netopivi u vodi i slanim otopinama s koncentracijom soli većom od 7%. Globulini se potpuno precipitiraju pri 50% zasićenosti rastvora amonijum sulfatom. Ove proteine ​​karakteriše visok sadržaj glicina (3,5%), njihova molekularna težina > 100.000 Da. Globulini su slabo kiseli ili neutralni proteini (p1=6-7,3);

Albumini su proteini koji su vrlo topljivi u vodi i jakim fiziološkim otopinama, a koncentracija soli (NH 4) 2 S0 4 ne smije prelaziti 50% zasićenosti. U većim koncentracijama albumini se isoljavaju. U poređenju sa globulinima, ovi proteini sadrže tri puta manje glicina i imaju molekulsku težinu od 40.000-70.000 Da. Albumini imaju višak negativnog naboja i kisela svojstva (pl=4,7) zbog visokog sadržaja glutaminske kiseline;

Prolamini su grupa biljnih proteina koji se nalaze u glutenu žitarica. Rastvorljivi su samo u 60-80% vodenom rastvoru etil alkohola. Prolamini imaju karakterističan sastav aminokiselina: sadrže dosta (20-50%) glutaminske kiseline i prolina (10-15%), zbog čega su i dobili ime. Njihova molekularna težina je preko 100.000 Da;

Glutelini - biljni proteini su nerastvorljivi u vodi, rastvorima soli i etanolu, ali rastvorljivi u razblaženim (0,1 N) rastvorima lužina i kiselina. Po sastavu aminokiselina i molekularnoj težini slični su prolaminima, ali sadrže više arginina i manje prolina.

Metode za proučavanje sastava aminokiselina

Proteini se razlažu na aminokiseline pomoću enzima u probavnim sokovima. Donesena su dva važna zaključka: 1) proteini sadrže aminokiseline; 2) metode hidrolize se mogu koristiti za proučavanje hemijskog, posebno aminokiselinskog sastava proteina.

Za proučavanje aminokiselinskog sastava proteina koristi se kombinacija kiselih (HCl), alkalnih [Ba(OH) 2 ] i, rjeđe, enzimske hidrolize, ili jedne od njih. Utvrđeno je da se prilikom hidrolize čistog proteina koji ne sadrži nečistoće oslobađa 20 različitih α-amino kiselina. Sve ostale aminokiseline otkrivene u tkivima životinja, biljaka i mikroorganizama (više od 300) postoje u prirodi u slobodnom stanju ili u obliku kratkih peptida ili kompleksa sa drugim organskim supstancama.

Prvi korak u određivanju primarne strukture proteina je kvalitativna i kvantitativna procjena aminokiselinskog sastava datog pojedinačnog proteina. Mora se imati na umu da za studiju morate imati određenu količinu čistog proteina, bez nečistoća drugih proteina ili peptida.

Kisela hidroliza proteina

Da bi se odredio sastav aminokiselina, potrebno je uništiti sve peptidne veze u proteinu. Analizirani protein se hidrolizira u 6 mol/l HC1 na temperaturi od oko 110 °C tokom 24 sata.Usljed ovog tretmana dolazi do razaranja peptidnih veza u proteinu, a u hidrolizatu su prisutne samo slobodne aminokiseline. Osim toga, glutamin i asparagin se hidroliziraju u glutaminsku i asparaginsku kiselinu (tj., amidna veza u radikalu se prekida i amino grupa se odvaja od njih).

Odvajanje aminokiselina hromatografijom za izmjenu jona

Smjesa aminokiselina dobivena kiselinskom hidrolizom proteina se odvaja u koloni s kationskom izmjenjivačkom smolom. Takva sintetička smola sadrži negativno nabijene grupe (na primjer, ostatke sulfonske kiseline -SO 3 -) jako povezane s njom, za koje su vezani ioni Na + (Sl. 1-4).

Smjesa aminokiselina se uvodi u kationski izmjenjivač u kiseloj sredini (pH 3,0), gdje su aminokiseline uglavnom kationi, tj. nose pozitivan naboj. Pozitivno nabijene aminokiseline vežu se za negativno nabijene čestice smole. Što je veći ukupni naboj aminokiseline, to je jača njena veza sa smolom. Tako se aminokiseline lizin, arginin i histidin najjače vezuju za kationski izmjenjivač, dok se asparaginska i glutaminska kiselina najslabije vezuju.

Oslobađanje aminokiselina iz kolone se vrši eluiranjem (eluiranjem) puferskim rastvorom sa povećanjem jonske snage (tj. sa povećanjem koncentracije NaCl) i pH. S povećanjem pH, aminokiseline gube proton, kao rezultat toga, njihov pozitivni naboj se smanjuje, a time i snaga veze s negativno nabijenim česticama smole.

Svaka aminokiselina izlazi iz kolone pri određenom pH i ionskoj snazi. Sakupljanjem rastvora (eluata) sa donjeg kraja kolone u obliku malih porcija mogu se dobiti frakcije koje sadrže pojedinačne aminokiseline.

(za više detalja o "hidrolizi" pogledajte pitanje #10)

8) Hemijske veze u strukturi proteina.

9) Koncept hijerarhije i strukturne organizacije proteina. (vidi pitanje #12)

10) Hidroliza proteina. Reakciona hemija (koračenje, katalizatori, reagensi, reakcioni uslovi) - kompletan opis hidrolize.

11) Hemijske transformacije proteina.

Denaturacija i renaturacija

Kada se rastvori proteina zagreju na 60-80% ili pod dejstvom reagensa koji razaraju nekovalentne veze u proteinima, tercijarna (kvaternarna) i sekundarna struktura proteinske molekule se uništava, ona poprima oblik nasumične zavojnice da bi se u većoj ili manjoj meri. Ovaj proces se naziva denaturacija. Kao denaturirajući reagensi mogu se koristiti kiseline, alkalije, alkoholi, fenoli, urea, gvanidin hlorid i dr. Suština njihovog djelovanja je da formiraju vodonične veze sa =NH i =CO - grupama peptidne kičme i sa kiselim grupama radikali aminokiselina, zamjenjujući vlastite intramolekularne vodikove veze u proteinu, zbog čega se mijenjaju sekundarne i tercijarne strukture. Tijekom denaturacije, topljivost proteina se smanjuje, on se "koagulira" (na primjer, prilikom kuhanja kokošjeg jajeta), a biološka aktivnost proteina se gubi. Na osnovu toga, na primjer, korištenje vodene otopine karbolne kiseline (fenola) kao antiseptika. Pod određenim uvjetima, uz sporo hlađenje otopine denaturiranog proteina, dolazi do renaturacije - obnavljanja izvorne (nativne) konformacije. Ovo potvrđuje činjenicu da je priroda savijanja peptidnog lanca određena primarnom strukturom.

Proces denaturacije pojedinačnog proteinskog molekula, koji dovodi do raspada njegove "krute" trodimenzionalne strukture, ponekad se naziva topljenjem molekula. Gotovo svaka primjetna promjena vanjskih uvjeta, kao što je zagrijavanje ili značajna promjena pH vrijednosti, dovodi do dosljednog narušavanja kvartarne, tercijarne i sekundarne strukture proteina. Obično je denaturacija uzrokovana povećanjem temperature, djelovanjem jakih kiselina i lužina, soli teških metala, određenih rastvarača (alkohola), zračenja itd.

Denaturacija često dovodi do procesa agregacije proteinskih čestica u veće u koloidnom rastvoru proteinskih molekula. Vizualno, ovo izgleda, na primjer, kao stvaranje "proteina" prilikom prženja jaja.

Renaturacija je obrnuti proces denaturacije, u kojem se proteini vraćaju svojoj prirodnoj strukturi. Treba napomenuti da nisu svi proteini u stanju da se renaturiraju; u većini proteina denaturacija je nepovratna. Ako su tokom denaturacije proteina fizičko-hemijske promjene povezane s prijelazom polipeptidnog lanca iz gusto zbijenog (uređenog) stanja u neuređeno, tada se tokom renaturacije manifestuje sposobnost samoorganiziranja proteina čiji je put unaprijed određen slijedom aminokiselina u polipeptidnom lancu, odnosno njegovom primarnom strukturom određenom nasljednom informacijom. U živim ćelijama, ova informacija je vjerovatno odlučujuća za transformaciju poremećenog polipeptidnog lanca tokom ili nakon njegove biosinteze na ribosomu u strukturu nativnog proteinskog molekula. Kada se dvolančani molekuli DNK zagriju na temperaturu od oko 100°C, vodikove veze između baza se prekidaju, a komplementarni lanci se razilaze - DNK denaturira. Međutim, nakon sporog hlađenja, komplementarni lanci se mogu ponovo povezati u regularnu dvostruku spiralu. Ova sposobnost DNK da se renaturira koristi se za proizvodnju umjetnih hibridnih molekula DNK.

Prirodna proteinska tijela su obdarena određenom, strogo definiranom prostornom konfiguracijom i imaju niz karakterističnih fizičko-hemijskih i bioloških svojstava na fiziološkim temperaturama i pH vrijednostima. Pod uticajem različitih fizičkih i hemijskih faktora, proteini se podvrgavaju koagulaciji i taloženju, gubeći svoja nativna svojstva. Dakle, denaturaciju treba shvatiti kao narušavanje općeg plana jedinstvene strukture nativnog proteinskog molekula, uglavnom njegove tercijarne strukture, što dovodi do gubitka njegovih karakterističnih svojstava (topljivost, elektroforetska pokretljivost, biološka aktivnost itd.). Većina proteina denaturira kada se njihovi rastvori zagreju iznad 50-60°C.

Vanjske manifestacije denaturacije svode se na gubitak rastvorljivosti, posebno na izoelektričnoj točki, povećanje viskoziteta proteinskih otopina, povećanje broja slobodnih funkcionalnih SH-grupa i promjenu prirode raspršenja rendgenskih zraka. . Najkarakterističniji znak denaturacije je naglo smanjenje ili potpuni gubitak proteinske biološke aktivnosti (katalitičke, antigenske ili hormonalne). Tokom denaturacije proteina uzrokovane 8M ureom ili drugim agensom, uglavnom se razaraju nekovalentne veze (posebno hidrofobne interakcije i vodonične veze). Disulfidne veze se kidaju u prisustvu redukcionog agensa merkaptoetanola, dok peptidne veze okosnice samog polipeptidnog lanca nisu pogođene. U ovim uslovima, globule nativnih proteinskih molekula se razvijaju i formiraju se nasumične i neuređene strukture (Sl.

Denaturacija proteinskog molekula (šema).

a - početno stanje; b - početak reverzibilnog kršenja molekularne strukture; c - ireverzibilno raspoređivanje polipeptidnog lanca.

Denaturacija i renaturacija ribonukleaze (prema Anfinsenu).

a - raspoređivanje (urea + merkaptoetanol); b - ponovno savijanje.

1. Hidroliza proteina: H+

[− NH2─CH─ CO─NH─CH─CO − ]n +2nH2O → n NH2 − CH − COOH + n NH2 ─ CH ─ COOH

│ │ ‌‌│ │

Aminokiselina 1 aminokiselina 2

2. Taloženje proteina:

a) reverzibilan

Protein u rastvoru ↔ proteinski precipitat. Nastaje pod dejstvom rastvora soli Na+, K+

b) nepovratna (denaturacija)

Prilikom denaturacije pod uticajem spoljašnjih faktora (temperatura; mehaničko delovanje - pritisak, trljanje, tresenje, ultrazvuk; dejstvo hemijskih agenasa - kiselina, lužina itd.) dolazi do promene u sekundarnoj, tercijarnoj i kvartarnoj strukturi proteina. makromolekula, odnosno njena nativna prostorna struktura. Primarna struktura, a samim tim i hemijski sastav proteina se ne mijenja.

Tokom denaturacije, fizička svojstva proteina se mijenjaju: rastvorljivost se smanjuje, biološka aktivnost se gubi. Istovremeno se povećava aktivnost nekih hemijskih grupa, olakšava se dejstvo proteolitičkih enzima na proteine, a samim tim i lakše se hidrolizira.

Na primjer, albumin - bjelanjak - na temperaturi od 60-70 ° taloži se iz otopine (koagulira), gubeći sposobnost rastvaranja u vodi.

Šema procesa denaturacije proteina (uništavanje tercijarne i sekundarne strukture proteinskih molekula)

3. Spaljivanje proteina

Proteini sagorevaju stvaranjem dušika, ugljičnog dioksida, vode i nekih drugih tvari. Pečenje je praćeno karakterističnim mirisom spaljenog perja.

4. Boja (kvalitativne) reakcije na proteine:

a) ksantoproteinska reakcija (za aminokiselinske ostatke koji sadrže benzenske prstenove):

Protein + HNO3 (konc.) → žuta boja

b) biuret reakcija (za peptidne veze):

Protein + CuSO4 (sat) + NaOH (konc) → svijetlo ljubičasta boja

c) reakcija cisteina (za aminokiselinske ostatke koji sadrže sumpor):

Protein + NaOH + Pb(CH3COO)2 → Crno bojenje

Proteini su osnova cijelog života na Zemlji i obavljaju različite funkcije u organizmima.

Soljenje proteina

Soljenje je proces izolacije proteina iz vodenih rastvora neutralnim rastvorima koncentrisanih soli alkalnih i zemnoalkalnih metala. Kada se u otopinu proteina dodaju visoke koncentracije soli, dolazi do dehidracije proteinskih čestica i uklanjanja naboja, dok se proteini talože. Stepen taloženja proteina zavisi od jonske snage taložnog rastvora, veličine čestica proteinskog molekula, veličine njegovog naboja i hidrofilnosti. Različiti proteini precipitiraju pri različitim koncentracijama soli. Stoga se u sedimentima dobivenim postupnim povećanjem koncentracije soli pojedini proteini nalaze u različitim frakcijama. Soljenje proteina je reverzibilan proces, a nakon što se sol ukloni, protein vraća svoja prirodna svojstva. Stoga se soljenje koristi u kliničkoj praksi za odvajanje proteina krvnog seruma, kao i za izolaciju i pročišćavanje različitih proteina.

Dodati anjoni i kationi uništavaju hidratiziranu proteinsku ljusku proteina, što je jedan od faktora stabilnosti proteinskih otopina. Najčešće se koriste otopine Na i amonijum sulfata. Mnogi proteini se razlikuju po veličini hidratacijske ljuske i veličini naboja. Svaki protein ima sopstvenu zonu isoljavanja. Nakon uklanjanja agensa za soljenje, protein zadržava svoju biološku aktivnost i fizičko-hemijska svojstva. U kliničkoj praksi metoda isoljavanja se koristi za odvajanje globulina (uz dodatak 50% amonijum sulfata (NH4)2SO4 a taloži se talog) i albumina (uz dodatak 100% amonijum sulfata (NH4)2SO4 precipitat).

Na soljenje utiču:

1) prirodu i koncentraciju soli;

2) pH sredine;

3) temperatura.

Glavnu ulogu igraju valencije jona.

12) Osobine organizacije primarne, sekundarne, tercijarne strukture proteina.

Trenutno je eksperimentalno dokazano postojanje četiri nivoa strukturne organizacije proteinskog molekula: primarne, sekundarne, tercijarne i kvartarne strukture.

Sastav aminokiselina i prostorna organizacija svakog proteina određuju njegova fizičko-hemijska svojstva. Proteini imaju kiselo-bazna, puferska, koloidna i osmotska svojstva.

Proteini kao amfoterni makromolekuli

Proteini su amfoterni polielektroliti, tj. kombinuju, poput aminokiselina, kisela i bazična svojstva. Međutim, priroda grupa koje daju amfoterna svojstva proteinima daleko je od toga da bude ista kao kod aminokiselina. Kiselinsko-bazna svojstva aminokiselina prvenstveno su posljedica prisustva α-amino i α-karboksilnih grupa (kiselina-bazni par). U proteinskim molekulima ove grupe učestvuju u stvaranju peptidnih veza, a amfoterne proteine ​​daju kiselo-bazne grupe bočnih radikala aminokiselina koje čine protein. Naravno, u svakom prirodnom proteinskom molekulu (polipeptidnom lancu) postoji najmanje jedna terminalna α-amino i α-karboksilna grupa (ako protein ima samo tercijarnu strukturu). U proteinu sa kvaternarnom strukturom, broj krajnjih grupa -NH2 i -COOH jednak je broju podjedinica, odnosno protomera. Međutim, tako mali broj ovih grupa ne može objasniti amfoternu prirodu proteinskih makromolekula. Budući da se većina polarnih grupa nalazi na površini globularnih proteina, one određuju kiselo-bazna svojstva i naboj proteinske molekule. Kisela svojstva proteina daju kisele aminokiseline (asparaginska, glutaminska i aminolimunska), a alkalna svojstva bazične aminokiseline (lizin, arginin, histidin). Što više kiselih aminokiselina sadrži protein, to su njegova kiselinska svojstva izraženija, a što je više bazičnih aminokiselina uključeno u protein, to se jače ispoljavaju njegova bazična svojstva. Slaba disocijacija SH grupe cisteina i fenolne grupe tirozina (mogu se smatrati slabim kiselinama) gotovo da nema uticaja na amfoternost proteina.

Svojstva bafera. Iako proteini imaju puferska svojstva, njihov kapacitet pri fiziološkim pH vrijednostima je ograničen. Izuzetak su proteini koji sadrže mnogo histidina, jer samo bočna grupa histidina ima puferska svojstva u pH rasponu bliskom fiziološkom. Ovih proteina je vrlo malo. Hemoglobin je gotovo jedini protein koji sadrži do 8% histidina, koji je snažan intracelularni pufer u eritrocitima, održava pH krvi na konstantnom nivou.

Naboj proteinske molekule ovisi o sadržaju kiselih i baznih aminokiselina u njoj, odnosno o ionizaciji kiselih i baznih grupa bočnog radikala ovih aminokiselina. Disocijacija COOH grupa kiselih aminokiselina uzrokuje pojavu negativnog naboja na površini proteina, a bočni radikali alkalnih aminokiselina nose pozitivan naboj (zbog dodavanja H+ glavnim grupama). U nativnom proteinskom molekulu, naboji su raspoređeni asimetrično u zavisnosti od prostornog rasporeda polipeptidnog lanca. Ako u proteinu prevladavaju kisele aminokiseline nad bazičnimi, onda je proteinska molekula općenito elektronegativna, odnosno polianion, i obrnuto, ako prevladavaju bazične aminokiseline, tada je pozitivno nabijena, tj. ponaša se kao a polication.

Ukupni naboj proteinske molekule, naravno, ovisi o pH medija: u kiseloj sredini je pozitivan, u alkalnom je negativan. pH vrijednost pri kojoj protein ima neto naboj od nule naziva se izoelektrična tačka proteina. U ovom trenutku, protein nema pokretljivost u električnom polju. Izoelektrična tačka svakog proteina određena je omjerom kiselih i baznih grupa bočnih radikala aminokiselina: što je veći omjer kiselih/baznih aminokiselina u proteinu, to je niža njegova izoelektrična točka. Kiseli proteini imaju pH 1< 7, у нейтральных рН 1 около 7, а у основных рН 1 >7. Na pH vrijednostima ispod svoje izoelektrične tačke, protein će nositi pozitivan naboj, a iznad - negativan naboj. Prosječna izoelektrična tačka svih citoplazmatskih proteina je unutar 5,5. Stoga, pri fiziološkom pH (oko 7,0 - 7,4), ćelijski proteini imaju ukupni negativni naboj. Višak negativnih naboja proteina unutar ćelije uravnotežen je, kao što je već spomenuto, neorganskim kationima.

Poznavanje izoelektrične tačke je veoma važno za razumevanje stabilnosti proteina u rastvorima, jer su proteini najmanje stabilni u izoelektričnom stanju. Nenabijene proteinske čestice mogu se zalijepiti i taložiti.

Koloidna i osmotska svojstva proteina

Ponašanje proteina u rastvorima ima neke posebnosti. Obične koloidne otopine su stabilne samo u prisustvu stabilizatora koji sprječava taloženje koloida na granici otapala i otapala.

Vodeni rastvori proteina su stabilni i uravnoteženi, ne talože se (ne koaguliraju) tokom vremena i ne zahtevaju prisustvo stabilizatora. Proteinske otopine su homogene i, u suštini, mogu se klasificirati kao prave otopine. Međutim, visoka molekularna težina proteina daje njihovim otopinama mnoga svojstva koloidnih sistema:

• karakteristična optička svojstva (opalescencija otopina i njihova sposobnost da rasipaju zrake vidljive svjetlosti) [prikaži] .

  Optička svojstva proteina. Rastvori proteina, posebno koncentrirani, imaju karakterističnu opalescenciju. Kada se proteinski rastvor osvijetli postrance, svjetlosni zraci u njemu postaju vidljivi i formiraju svjetleći stožac ili traku - Tyndallov efekat (u visoko razrijeđenim proteinskim otopinama, opalescencija nije vidljiva i svijetleći Tyndall konus je gotovo odsutan). Ovaj efekat rasipanja svetlosti objašnjava se difrakcijom svetlosnih zraka na proteinskim česticama u rastvoru. Vjeruje se da se u protoplazmi ćelije protein nalazi u obliku koloidne otopine - sola. Sposobnost proteina i drugih bioloških molekula (nukleinske kiseline, polisaharidi, itd.) da raspršuju svjetlost koristi se u mikroskopskom proučavanju ćelijskih struktura: u tamnom polju mikroskopa koloidne čestice su vidljive kao svijetle mrlje u citoplazmi.

  Sposobnost raspršivanja svjetlosti proteina i drugih makromolekularnih supstanci koristi se za njihovo kvantitativno određivanje nefelometrijom, upoređujući intenzitet raspršenja svjetlosti suspendovanim česticama testa i standardnog sola.

• niska brzina difuzije [prikaži] .

  Niska brzina difuzije. Difuzija je spontano kretanje molekula otopljene tvari zbog gradijenta koncentracije (od područja visoke koncentracije do područja niske koncentracije). Proteini imaju ograničenu brzinu difuzije u poređenju sa običnim molekulima i jonima, koji se kreću stotine do hiljade puta brže od proteina. Brzina difuzije proteina ovisi više o obliku njihovih molekula nego o njihovoj molekularnoj težini. Globularni proteini u vodenim rastvorima su pokretljiviji od fibrilarnih proteina.

  Difuzija proteina je neophodna za normalno funkcionisanje ćelije. Sinteza proteina u bilo kojem dijelu ćelije (gdje postoje ribozomi) mogla bi, u nedostatku difuzije, dovesti do nakupljanja proteina na mjestu njihovog formiranja. Intracelularna distribucija proteina odvija se difuzijom. Budući da je brzina difuzije proteina niska, ona ograničava brzinu procesa koji zavise od funkcije difuznog proteina u odgovarajućem području ćelije.

• nemogućnost prodiranja kroz polupropusne membrane [prikaži] .

  Osmotska svojstva proteina. Proteini, zbog svoje velike molekularne težine, ne mogu difundirati kroz polupropusnu membranu, dok male molekularne tvari lako prolaze kroz takve membrane. Ovo svojstvo proteina se u praksi koristi za prečišćavanje njihovih rastvora od niskomolekularnih nečistoća. Ovaj proces se naziva dijaliza.

  Nesposobnost proteina da difundiraju kroz polupropusne membrane uzrokuje pojavu osmoze, odnosno kretanje molekula vode kroz polupropusnu membranu u otopinu proteina. Ako je rastvor proteina odvojen od vode celofanskom membranom, tada, u težnji za postizanjem ravnoteže, molekuli vode difunduju u rastvor proteina. Međutim, kretanje vode u prostor u kojem se nalazi protein povećava hidrostatički pritisak u njemu (pritisak vodenog stuba), što sprečava dalju difuziju molekula vode do proteina.

  Pritisak ili sila koja se mora primijeniti da bi se zaustavio osmotski tok vode naziva se osmotski tlak. Osmotski tlak u vrlo razrijeđenim otopinama proteina proporcionalan je molarnoj koncentraciji proteina i apsolutnoj temperaturi.

  Biološke membrane su također nepropusne za proteine, tako da osmotski tlak koji stvara protein ovisi o njegovoj koncentraciji unutar i izvan ćelije. Osmotski pritisak zbog proteina naziva se i onkotički pritisak.

• rješenja visokog viskoziteta [prikaži] .

  Visoko viskozne proteinske otopine. Visoka viskoznost je tipična ne samo za otopine proteina, već općenito za otopine makromolekularnih spojeva. S povećanjem koncentracije proteina, viskoznost otopine se povećava, jer se povećavaju sile adhezije između proteinskih molekula. Viskoznost zavisi od oblika molekula. Otopine fibrilarnih proteina su uvijek viskoznije od otopina globularnih proteina. Na viskoznost rastvora snažno utiču temperatura i prisustvo elektrolita. Kako temperatura raste, viskoznost proteinskih otopina opada. Dodaci nekih soli, kao što je kalcij, povećavaju viskoznost promicanjem adhezije molekula uz pomoć kalcijevih mostova. Ponekad se viskoznost otopine proteina toliko poveća da gubi fluidnost i prelazi u stanje poput gela.

• sposobnost želiranja [prikaži] .

  Sposobnost proteina da formiraju gelove. Interakcija između proteinskih makromolekula u otopini može dovesti do formiranja strukturnih mreža unutar kojih su zarobljene molekule vode. Takvi strukturirani sistemi se nazivaju gelovi ili žele. Vjeruje se da protein protoplazme stanice može prijeći u gelasto stanje. Tipičan primjer - tijelo meduze je poput živog želea, čiji je sadržaj vode do 90%.

  Geliranje se lakše odvija u rastvorima fibrilarnih proteina; njihov štapićasti oblik doprinosi boljem kontaktu krajeva makromolekula. To je dobro poznato iz svakodnevne prakse. Želeći za hranu se pripremaju od proizvoda (kosti, hrskavice, meso) koji sadrže velike količine fibrilarnih proteina.

  U procesu života organizma, gelasto stanje proteinskih struktura ima veliki fiziološki značaj. Proteini kolagena kostiju, tetiva, hrskavice, kože i dr. imaju visoku čvrstoću, čvrstoću i elastičnost, jer su u gelastom stanju. Taloženje mineralnih soli tokom starenja smanjuje njihovu čvrstoću i elastičnost. U obliku gela ili želatine, aktomiozin se nalazi u mišićnim stanicama, koji obavlja kontraktilnu funkciju.

  U živoj ćeliji se javljaju procesi koji nalikuju sol-gel tranziciji. Protoplazma ćelije je viskozna tečnost nalik solnoj tečnosti, u kojoj se nalaze ostrva gelolikih struktura.

Hidratacija proteina i faktori koji utiču na njihovu rastvorljivost

Proteini su hidrofilne supstance. Ako otopite suhi protein u vodi, tada on u početku, kao i svaki hidrofilni visokomolekularni spoj, nabubri, a zatim proteinski molekuli počinju postupno prelaziti u otopinu. Tokom bubrenja, molekuli vode prodiru u protein i vezuju se za njegove polarne grupe. Gusto pakiranje polipeptidnih lanaca je olabavljeno. Natečeni protein se može smatrati povratnim rastvorom, odnosno rastvorom molekula vode u supstanci visoke molekularne težine - proteinu. Daljnja apsorpcija vode dovodi do odvajanja proteinskih molekula iz ukupne mase i rastvaranja. Ali otok ne vodi uvijek do rastvaranja; neki proteini, kao što je kolagen, ostaju natečeni nakon što apsorbuju velike količine vode.

Otapanje je povezano sa hidratacijom proteina, odnosno vezivanjem molekula vode za proteine. Hidrirana voda je tako snažno vezana za makromolekulu proteina da ju je teško odvojiti. Ovo ne ukazuje na jednostavnu adsorpciju, već na elektrostatičko vezivanje molekula vode sa polarnim grupama bočnih radikala kiselih aminokiselina koje nose negativan naboj i bazičnih aminokiselina koje nose pozitivan naboj.

Međutim, dio vode hidratacije vezan je peptidnim grupama, koje formiraju vodikove veze s molekulima vode. Na primjer, polipeptidi s nepolarnim bočnim grupama također bubre, tj. vezuju vodu. Dakle, velika količina vode veže kolagen, iako ovaj protein sadrži pretežno nepolarne aminokiseline. Voda, vezujući se za peptidne grupe, razdvaja izdužene polipeptidne lance. Međutim, međulančane veze (mostovi) ne dozvoljavaju proteinskim molekulima da se odvoje jedan od drugog i pređu u otopinu. Kada se sirovine koje sadrže kolagen zagriju, međulančani mostovi u kolagenim vlaknima pucaju i oslobođeni polipeptidni lanci prelaze u otopinu. Ova frakcija djelomično hidroliziranog rastvorljivog kolagena naziva se želatina. Želatin je po hemijskom sastavu sličan kolagenu, lako nabubri i otapa se u vodi, formirajući viskozne tečnosti. Karakteristično svojstvo želatine je sposobnost geliranja. Vodene otopine želatine se široko koriste u medicinskoj praksi kao sredstvo za zamjenu plazme i hemostatsko sredstvo, a sposobnost geliranja - u proizvodnji kapsula u farmaceutskoj praksi.

Faktori koji utiču na rastvorljivost proteina. Rastvorljivost različitih proteina uvelike varira. Određuje se njihovim aminokiselinskim sastavom (polarne aminokiseline daju veću rastvorljivost od nepolarnih), organizacionim karakteristikama (globularni proteini su obično bolje rastvorljivi od fibrilarnih) i svojstvima rastvarača. Na primjer, biljni proteini - prolamini - otapaju se u 60-80% alkohola, albumini - u vodi i slabim otopinama soli, a kolagen i keratini su netopivi u većini rastvarača.

Proteinske otopine su stabilne zbog naboja proteinske molekule i hidratacijske ljuske. Svaka makromolekula pojedinog proteina ima ukupan naboj istog predznaka, što sprečava njihovo lepljenje u rastvoru i taloženje. Sve što doprinosi očuvanju naboja i hidratacijske ljuske olakšava topljivost proteina i njegovu stabilnost u otopini. Postoji bliska veza između naboja proteina (ili broja polarnih aminokiselina u njemu) i hidratacije: što je više polarnih aminokiselina u proteinu, to se više vode vezuje (po 1 g proteina). Hidracijska ljuska proteina ponekad dostiže veliku veličinu, a voda hidratacije može biti i do 1/5 njegove mase.

Istina, neki proteini su više hidratizirani i manje topljivi. Na primjer, kolagen veže vodu više od mnogih visoko topivih globularnih proteina, ali se ne otapa. Njegovu rastvorljivost ometaju strukturne karakteristike - poprečne veze između polipeptidnih lanaca. Ponekad suprotno nabijene proteinske grupe formiraju mnoge ionske (solne) veze unutar proteinske molekule ili između proteinskih molekula, što sprječava stvaranje veza između molekula vode i nabijenih proteinskih grupa. Uočen je paradoksalan fenomen: u proteinu postoji mnogo anjonskih ili kationskih grupa, a njegova rastvorljivost u vodi je niska. Intermolekularni mostovi soli uzrokuju da se proteinski molekuli drže zajedno i talože.

Koji faktori okoline utiču na rastvorljivost proteina i njihovu stabilnost u rastvorima?

• Utjecaj neutralnih soli [prikaži] .

  Neutralne soli u malim koncentracijama povećavaju topljivost čak i onih proteina koji su netopivi u čistoj vodi (na primjer, euglobulini). To je zbog činjenice da ioni soli, u interakciji sa suprotno nabijenim grupama proteinskih molekula, uništavaju mostove soli između proteinskih molekula. Povećanje koncentracije soli (povećanje jonske snage otopine) ima suprotan učinak (vidi dolje - isoljavanje).

• Utjecaj pH medija [prikaži] .

  pH medijuma utiče na naboj proteina i, posljedično, na njegovu rastvorljivost. Najmanje stabilan protein je u izoelektričnom stanju, odnosno kada je njegov ukupni naboj jednak nuli. Uklanjanje naboja omogućava proteinskim molekulima da se lako približe jedni drugima, zalijepe se i talože. To znači da će rastvorljivost i stabilnost proteina biti minimalna pri pH koji odgovara izoelektričnoj tački proteina.

• Temperaturni efekat [prikaži] .

  Ne postoji stroga veza između temperature i prirode rastvorljivosti proteina. Neki proteini (globulini, pepsin, mišićna fosforilaza) u vodenim ili fiziološkim rastvorima se bolje otapaju sa povećanjem temperature; drugi (mišićna aldolaza, hemoglobin, itd.) su lošiji.

• Utjecaj različito nabijenih proteina [prikaži] .

  Ako se protein koji je polikation (bazni protein) doda u otopinu proteina koji je polianion (kiseli protein), onda oni formiraju agregate. U tom slučaju se gubi stabilnost zbog neutralizacije naboja i proteini se talože. Ponekad se ova karakteristika koristi za izolaciju željenog proteina iz mješavine proteina.

soljenje

Otopine neutralnih soli se široko koriste ne samo za povećanje topljivosti proteina, na primjer, kada se izoliraju iz biološkog materijala, već i za selektivno taloženje različitih proteina, odnosno njihovo frakcioniranje. Proces taloženja proteina neutralnim fiziološkim rastvorima naziva se soljenje. Karakteristična karakteristika proteina dobivenih soljenjem je da zadržavaju svoja nativna biološka svojstva nakon uklanjanja soli.

Mehanizam isoljavanja je da dodani anioni i kationi fiziološkog rastvora uklanjaju hidratacionu ljusku proteina, što je jedan od faktora njegove stabilnosti. Moguće je da se istovremeno dešava neutralizacija proteinskih naboja jonima soli, što takođe doprinosi taloženju proteina.

Sposobnost soljenja je najizraženija kod aniona soli. Prema jačini isoljavanja anjoni i kationi su raspoređeni u sljedeće redove:

• SO 4 2-> C 6 H 5 O 7 3-> CH 3 COO - > Cl - > NO 3 - > Br - > I - > CNS -
• Li + >Na + > K + > Pb + > Cs +

Ove serije se nazivaju liotropne.

Sulfati u ovoj seriji imaju snažan efekat zasoljenja. U praksi se za soljenje proteina najčešće koriste natrijum i amonijum sulfat. Osim soli, proteini se talože i organskim sredstvima za uklanjanje vode (etanol, aceton, metanol, itd.). U stvari, ovo je isto soljenje.

Soljenje se široko koristi za odvajanje i pročišćavanje proteina, budući da se mnogi proteini razlikuju po veličini hidratantne ljuske i veličini njihovog naboja. Svaki od njih ima svoju zonu isoljavanja, odnosno koncentraciju soli koja omogućava dehidraciju i taloženje proteina. Nakon uklanjanja agensa za soljenje, protein zadržava sva svoja prirodna svojstva i funkcije.

Denaturacija (denativacija) i renaturacija (renativacija)

Pod dejstvom različitih supstanci koje narušavaju najviše nivoe organizacije proteinskog molekula (sekundarne, tercijarne, kvaternarne) uz zadržavanje primarne strukture, protein gubi svoja prirodna fizičko-hemijska i, što je najvažnije, biološka svojstva. Ova pojava se naziva denaturacija (denativacija). Karakteristično je samo za molekule koji imaju složenu prostornu organizaciju. Sintetički i prirodni peptidi nisu sposobni za denaturaciju.

Tokom denaturacije prekidaju se veze koje stabilizuju kvartarne, tercijarne, pa čak i sekundarne strukture. Polipeptidni lanac se odvija i nalazi se u rastvoru ili u nesavijenom obliku ili u obliku nasumične zavojnice. U tom slučaju gubi se hidratantna ljuska i protein se taloži. Međutim, istaloženi denaturirani protein razlikuje se od istog proteina precipitiranog soljenjem, jer u prvom slučaju gubi svoja nativna svojstva, dok u drugom zadržava. To ukazuje da je mehanizam djelovanja tvari koje uzrokuju denaturaciju i soljenje različit. Prilikom soljenja, nativna struktura proteina je očuvana, a tokom denaturacije se uništava.

Faktori denaturiranja se dijele na

• fizički [prikaži] .

  Fizički faktori uključuju: temperaturu, pritisak, mehanički uticaj, ultrazvučno i jonizujuće zračenje.

  Termička denaturacija proteina je proces koji se najviše proučava. Smatralo se jednom od karakterističnih osobina proteina. Odavno je poznato da kada se zagrije, protein koagulira (koagulira) i taloži. Većina proteina je termolabilna, ali je poznato da su proteini vrlo otporni na toplinu. Na primjer, tripsin, kimotripsin, lizozim, neki biološki membranski proteini. Proteini bakterija koje žive u toplim izvorima posebno su otporni na temperaturu. Očigledno, u termostabilnim proteinima, termičko kretanje polipeptidnih lanaca uzrokovano zagrijavanjem nije dovoljno da razbije unutrašnje veze proteinskih molekula. Na izoelektričnoj tački, proteini se lakše denaturiraju toplotom. Ova tehnika se koristi u praktičnom radu. Neki proteini, s druge strane, denaturiraju na niskim temperaturama.

• hemijski [prikaži] .

  Hemijski faktori koji uzrokuju denaturaciju su: kiseline i alkalije, organski rastvarači (alkohol, aceton), deterdženti (deterdženti), neki amidi (urea, soli gvanidina, itd.), alkaloide, teške metale (soli žive, bakra, barija, cinka , kadmijum, itd.). Mehanizam denaturirajućeg dejstva hemikalija zavisi od njihovih fizičko-hemijskih svojstava.

  Kiseline i alkalije se široko koriste kao precipitanti proteina. Mnogi proteini denaturiraju pri ekstremnim pH vrijednostima ispod 2 ili iznad 10-11. Ali neki proteini su otporni na kiseline i lužine. Na primjer, histoni i protamini ne denaturiraju čak ni pri pH 2 ili pH 10. Jake otopine etanola i acetona također imaju denaturirajući učinak na proteine, iako se za neke proteine ​​ovi organski rastvarači koriste kao sredstva za soljenje.

  Teški metali, alkaloidi su se dugo koristili kao precipitanti; formiraju jake veze sa polarnim grupama proteina i time razbijaju sistem vodoničnih i jonskih veza.

  Posebnu pažnju treba obratiti na soli uree i gvanidina, koje se u visokim koncentracijama (za ureu 8 mol/l, za gvanidin hidrohlorid 2 mol/l) nadmeću sa peptidnim grupama za stvaranje vodoničnih veza. Kao rezultat, dolazi do disocijacije na podjedinice u proteinima s kvaternarnom strukturom, a zatim do odvijanja polipeptidnih lanaca. Ovo svojstvo uree je toliko upečatljivo da se naširoko koristi za dokazivanje prisustva kvartarne proteinske strukture i važnosti njene strukturne organizacije u implementaciji fiziološke funkcije.

Osobine denaturiranih proteina . Najtipičnije za denaturirane proteine ​​su sljedeće karakteristike.

• Povećanje broja reaktivnih ili funkcionalnih grupa u odnosu na nativni proteinski molekul (funkcionalne grupe su grupe bočnih radikala aminokiselina: COOH, NH 2, SH, OH). Neke od ovih grupa se obično nalaze unutar proteinske molekule i ne otkrivaju se posebnim reagensima. Razmatranje polipeptidnog lanca tokom denaturacije otkriva ove dodatne, ili skrivene, grupe.
• Smanjena rastvorljivost i taloženje proteina (povezano sa gubitkom hidratantne ljuske, odvijanjem proteinske molekule sa "izlaganjem" hidrofobnih radikala i neutralizacijom naelektrisanja polarnih grupa).
• Promjena konfiguracije proteinske molekule.
• Gubitak biološke aktivnosti uzrokovan kršenjem prirodne strukturne organizacije molekula.
• Lakše cijepanje proteolitičkim enzimima u odnosu na nativni protein, prijelaz kompaktne nativne strukture u nesavijeni labavi oblik olakšava pristup enzima peptidnim vezama proteina, koje oni uništavaju.

Potonji kvalitet denaturiranog proteina je nadaleko poznat. Termička ili druga obrada proizvoda koji sadrže proteine ​​(uglavnom mesa) doprinosi njihovoj boljoj probavi uz pomoć proteolitičkih enzima gastrointestinalnog trakta. U želucu ljudi i životinja stvara se prirodni denaturirajući agens - hlorovodonična kiselina, koja denaturacijom proteina pomaže u njihovoj razgradnji enzimima. Međutim, prisustvo hlorovodonične kiseline i proteolitičkih enzima ne dozvoljava upotrebu proteinskih lekova kroz usta, jer se oni denaturišu i odmah cepaju, gubeći svoju biološku aktivnost.

Također napominjemo da se denaturirajuće tvari koje talože proteine ​​koriste u biohemijskoj praksi u druge svrhe osim za soljenje. Soljenje kao tehnika se koristi za izolaciju određenog proteina ili grupe proteina, a denaturacija se koristi za oslobađanje mješavine bilo koje tvari iz proteina. Uklanjanjem proteina može se dobiti rastvor bez proteina ili se efekat ovog proteina može eliminisati.

Dugo se vjerovalo da je denaturacija nepovratna. Međutim, u nekim slučajevima, uklanjanje denaturirajućeg agensa (takvi eksperimenti su napravljeni pomoću uree) obnavlja biološku aktivnost proteina. Proces obnavljanja fizičko-hemijskih i bioloških svojstava denaturiranog proteina naziva se renaturacija ili renativacija. Ako se denaturirani protein (nakon uklanjanja denaturirajućih supstanci) reorganizira u prvobitnu strukturu, tada se obnavlja njegova biološka aktivnost.

Stranica 4

ukupno stranica: 7

Oblik proteinske molekule. Istraživanja nativne konformacije proteinskih molekula su pokazala da ove čestice u većini slučajeva imaju manje-više asimetričan oblik. U zavisnosti od stepena asimetrije, odnosno odnosa između duge (b) i kratke (a) ose proteinskog molekula, razlikuju se globularni (sferični) i fibrilarni (filamentni) proteini.

Globularni su proteinski molekuli u kojima je presavijanje polipeptidnih lanaca dovelo do formiranja sferne strukture. Među njima su striktno sferni, eliptični i štapićasti. Razlikuju se po stepenu asimetrije. Na primjer, albumin jaja ima b/a = 3, gliadin pšenice ima 11, a zein kukuruza ima 20. Mnogi proteini u prirodi su globularni.

Fibrilarni proteini formiraju dugačke, visoko asimetrične filamente. Mnogi od njih imaju strukturnu ili mehaničku funkciju. To su kolagen (b/a - 200), keratini, fibroin.

Proteini svake grupe imaju svoja karakteristična svojstva. Mnogi globularni proteini su topljivi u vodi i razrijeđenim slanim otopinama. Rastvorljive fibrilarne proteine ​​karakteriziraju vrlo viskozne otopine. Globularni proteini, po pravilu, imaju dobru biološku vrijednost - apsorbuju se tokom probave, dok mnogi fibrilarni proteini nisu.

Ne postoji jasna granica između globularnih i fibrilarnih proteina. Brojni proteini zauzimaju srednju poziciju i kombinuju karakteristike globularnih i fibrilarnih. Takvi proteini uključuju, na primjer, mišićni miozin (b/a = 75) i fibrinogen u krvi (b/a = 18). Miozin ima štapićast oblik, sličan obliku fibrilarnih proteina, međutim, kao i globularni proteini, topiv je u fiziološkim otopinama. Otopine miozina i fibrinogena su viskozne. Ovi proteini se apsorbuju tokom varenja. Istovremeno, aktin, globularni mišićni protein, se ne apsorbira.

Denaturacija proteina. Prirodna konformacija proteinskih molekula nije kruta, prilično je labilna (lat. "labilis" - klizanje) i može biti ozbiljno poremećena pod brojnim uticajima. Kršenje prirodne konformacije proteina, praćeno promjenom njegovih prirodnih svojstava bez prekida peptidnih veza, naziva se denaturacija (latinski "denaturare" - lišavanje prirodnih svojstava) proteina.

Denaturacija proteina može biti uzrokovana različitim razlozima koji dovode do narušavanja slabih interakcija, kao i do prekida disulfidnih veza koje stabiliziraju njihovu nativnu strukturu.

Zagrevanje većine proteina na temperature iznad 50°C, kao i ultraljubičasto i druge vrste visokoenergetskog zračenja, povećavaju vibracije atoma polipeptidnog lanca, što dovodi do prekida različitih veza u njima. Čak i mehaničko mućkanje može uzrokovati denaturaciju proteina.

Do denaturacije proteina dolazi i zbog hemijskog napada. Jake kiseline ili lužine utiču na ionizaciju kiselih i baznih grupa, uzrokujući prekid ionskih i nekih vodoničnih veza u proteinskim molekulima. Urea (H 2 N-CO-NH 2) i organski rastvarači - alkoholi, fenoli itd. - razbijaju sistem vodoničnih veza i slabe hidrofobne interakcije u proteinskim molekulima (urea - zbog narušavanja strukture vode, organskih rastvarača - zbog uspostavljanja kontakata sa nepolarnim radikalima aminokiselina). Merkaptoetanol uništava disulfidne veze u proteinima. Joni teških metala remete slabe interakcije.

Tokom denaturacije dolazi do promjene svojstava proteina i prije svega smanjenja njegove rastvorljivosti. Na primjer, kada se prokuhaju, proteini se koaguliraju i talože iz otopina u obliku ugrušaka (kao kod kuhanja kokošjeg jajeta). Do taloženja proteina iz rastvora dolazi i pod uticajem proteinskih taložnika, koji se koriste kao trihloroctena kiselina, Barnsteinov reagens (smjesa natrijum hidroksida sa bakar sulfatom), rastvor tanina itd.

Tokom denaturacije smanjuje se sposobnost proteina da apsorbuje vodu, odnosno njegova sposobnost bubrenja; mogu se pojaviti nove hemijske grupe, na primer: kada su izložene merama kaptoetanola - SH-grupe. Kao rezultat denaturacije, protein gubi svoju biološku aktivnost.

Iako denaturacija ne utječe na primarnu strukturu proteina, promjene su nepovratne. Međutim, na primjer, postupnim uklanjanjem uree dijalizom iz otopine denaturiranog proteina, dolazi do njezine renaturacije: obnavlja se nativna struktura proteina, a zajedno s njom, u jednom ili drugom stupnju, njegova nativna svojstva. Takva denaturacija se naziva reverzibilnom.

Do nepovratne denaturacije proteina dolazi tokom starenja organizama. Stoga, na primjer, sjeme biljaka, čak i pod optimalnim uvjetima skladištenja, postepeno gubi sposobnost klijanja.

Do denaturacije proteina dolazi prilikom pečenja hleba, sušenja testenina, povrća, tokom kuvanja itd. Kao rezultat toga, biološka vrednost ovih proteina se povećava, jer se denaturisani (delimično uništeni) proteini lakše apsorbuju tokom varenja.

Izoelektrična tačka proteina. Proteini sadrže različite bazične i kisele grupe koje imaju sposobnost jonizacije. U jako kiseloj sredini, glavne grupe (amino grupe itd.) se aktivno protoniraju i proteinski molekuli dobijaju ukupni pozitivan naboj, au jako alkalnom mediju karboksilne grupe se lako disociraju, a proteinski molekuli dobijaju ukupni negativni naboj.

Izvori pozitivnog naboja u proteinima su bočni radikali lizina, arginina i histidina, te a-amino grupa N-terminalnog aminokiselinskog ostatka. Izvori negativnog naboja su bočni radikali ostataka asparaginske i glutaminske kiseline, te α-karboksilna grupa C-terminalnog aminokiselinskog ostatka.

Pri određenoj pH vrijednosti medija postoji jednakost pozitivnih i negativnih naboja na površini proteinske molekule, odnosno njen ukupni električni naboj ispada nula. Ova pH vrijednost otopine, pri kojoj je proteinski molekul električno neutralan, naziva se izoelektrična tačka proteina (pi).

Izoelektrične tačke su karakteristične konstante proteina. One su određene njihovim sastavom i strukturom aminokiselina: brojem i rasporedom kiselih i baznih aminokiselinskih ostataka u polipeptidnim lancima. Izoelektrične tačke proteina, u kojima dominiraju kiseli ostaci aminokiselina, nalaze se u pH oblasti.<7, а белков, в которых преобладают остатки основных аминокислот - в области рН>7. Izoelektrične tačke većine proteina su u blago kiseloj sredini.

U izoelektričnom stanju, proteinske otopine imaju minimalni viskozitet. To je zbog promjene oblika proteinske molekule. U izoelektričnoj tački, suprotno nabijene grupe se privlače jedna drugoj, a proteini se uvijaju u kuglice. Kada se pH pomjeri od izoelektrične točke, grupe s istim nabojem se međusobno odbijaju, a proteinski molekuli se razvijaju. U nesavijenom stanju, proteinski molekuli daju otopinama veći viskozitet nego umotani u kuglice.

Na izoelektričnoj tački, proteini imaju minimalnu rastvorljivost i lako se talože.

Međutim, precipitacija proteina na izoelektričnoj tački još uvijek ne dolazi. To je spriječeno strukturiranim molekulima vode koji zadržavaju značajan dio hidrofobnih aminokiselinskih radikala na površini proteinskih globula.

Proteini se mogu istaložiti upotrebom organskih rastvarača (alkohol, aceton), koji remete sistem hidrofobnih kontakata u proteinskim molekulima, kao i visoke koncentracije soli (satting out), koje smanjuju hidrataciju proteinskih globula. U potonjem slučaju, dio vode odlazi na otapanje soli i prestaje da učestvuje u rastvaranju proteina. Takvo rješenje zbog nedostatka rastvarača postaje prezasićeno, što podrazumijeva taloženje njegovog dijela u talog. Molekule proteina počinju da se lepe zajedno i, formirajući sve veće čestice, postepeno se talože iz rastvora.

Optička svojstva proteina. Otopine proteina imaju optičku aktivnost, odnosno sposobnost rotacije ravni polarizacije svjetlosti. Ovo svojstvo proteina je zbog prisutnosti asimetričnih elemenata u njihovim molekulima - asimetričnih atoma ugljika i desne a-heliksa.

Kada je protein denaturiran, njegova optička svojstva se mijenjaju, što je povezano s uništavanjem a-heliksa. Optička svojstva potpuno denaturiranih proteina zavise samo od prisutnosti asimetričnih atoma ugljika u njima.

Razlikom u ispoljavanju optičkih svojstava proteina pre i posle denaturacije može se odrediti stepen njegove spiralizacije.

Kvalitativne reakcije na proteine. Proteine ​​karakteriziraju reakcije boje zbog prisustva određenih kemijskih grupa u njima. Ove reakcije se često koriste za otkrivanje proteina.

Kada se u otopinu proteina dodaju bakar sulfat i alkalija, pojavljuje se lila boja, povezana s stvaranjem kompleksa bakrenih jona sa peptidnim grupama proteina. Pošto ova reakcija daje biuret (H 2 N-CO-NH-CO-NH 2), naziva se biuret. Često se koristi za kvantitativno određivanje proteina, zajedno sa metodom I. Kjeldahla, jer je intenzitet dobijene boje proporcionalan koncentraciji proteina u rastvoru.

Kada se proteinske otopine zagrijavaju koncentriranom dušičnom kiselinom, pojavljuje se žuta boja zbog stvaranja nitro derivata aromatskih aminokiselina. Ova reakcija se zove ksantoprotein(grčki "xanthos" - žuto).

Mnoge otopine proteina, kada se zagrijavaju, reagiraju s nitratnom otopinom žive, koja stvara grimizna kompleksna jedinjenja s fenolima i njihovim derivatima. Ovo je kvalitativni Millonov test na tirozin.

Kao rezultat zagrijavanja većine proteinskih otopina olovnim acetatom u alkalnom mediju, taloži se crni talog olovnog sulfida. Ova reakcija se koristi za otkrivanje aminokiselina koje sadrže sumpor i naziva se Fohlova reakcija.