Faze izolacije čiste kulture aeroba Mikrobiologija. Fiziologija mikroorganizama: kulturološka svojstva bakterija, izolacija čistih kultura mikroorganizama

Uzgoj mikroorganizama, pored sastava hranljive podloge, zavisi i od fizičko-hemijskih faktora (temperatura, kiselost, aeracija, svetlost i dr.). Istovremeno, kvantitativni pokazatelji svakog od njih nisu isti i određeni su posebnostima metabolizma svake grupe bakterija. Postoje metode za uzgoj mikroorganizama na čvrstim i tečnim hranljivim podlogama u aerobnim, anaerobnim i drugim uslovima.

Metode izolacije čistih kultura aerobnih mikroorganizama. Kako bi se dobile izolovane kolonije, materijal se tokom primjene raspoređuje tako da se bakterijske ćelije odvajaju jedna od druge. Da bi se dobila čista kultura, koriste se dvije glavne grupe metoda:

a) metode zasnovane na principu mehaničkog odvajanja mikroorganizama;

b) metode zasnovane na biološkim svojstvima mikroorganizama.

Metode zasnovane na principu mehaničkog odvajanja mikroorganizama

Prosijavanje lopaticom po Drygalskom. Uzmite 3 Petrijeve posude sa hranljivom podlogom. Kap ispitnog materijala nanosi se na 1. posudu pomoću petlje ili pipete i utrlja lopaticom po cijeloj površini hranjivog agara. Zatim se lopatica prenosi u 2. šolju i kultura koja je ostala na lopatici se utrlja u površinu hranljive podloge. Zatim se lopatica prenosi u 3. čašu i inokulira na isti način. Na 1. šolji raste maksimalan broj kolonija, na 3. - minimalan. U zavisnosti od sadržaja mikrobnih ćelija u ispitivanom materijalu, na jednoj od posuda rastu odvojene kolonije, pogodne za izolovanje čiste kulture mikroorganizma.

Pasteurova metoda (metoda razrjeđivanja). Od ispitivanog materijala u tečnom sterilnom mediju ili fiziološkom rastvoru u epruvetama priprema se niz serijskih, češće desetostrukih serijskih razblaženja. Zatim se materijal sije travnjakom, 0,5 ml iz svake epruvete. Pretpostavlja se da će u nekim epruvetama ostati onaj broj mikroorganizama koji se može izbrojati kada se posade na podlogu za ploče. Ova metoda omogućava izračunavanje mikrobnog broja u ispitivanom materijalu. (Mikrobni broj je broj kolonija na posljednjoj ploči s rastom mikroorganizama, pomnožen sa stepenom razblaženja materijala).

Prosijavanje sa petljom (sjetva s potezima). Uzmite jednu Petrijevu posudu s hranjivim agarom i podijelite je na 4 sektora, crtajući linije razgraničenja na vanjskoj strani dna posude. Materijal koji se proučava se uvodi u prvi sektor petljom i njime se povlače paralelne linije po cijelom sektoru na udaljenosti od oko 5 mm jedna od druge. Sa istom petljom, bez promjene njenog položaja u odnosu na agar, iste linije se povlače na drugim sektorima posude. Na mjestu gdje je veliki broj mikrobnih ćelija pao na agar, rast mikroorganizama će biti u obliku kontinuiranog udara. Odvojene kolonije rastu na sektorima s malim brojem ćelija. Također je moguće sipati razrijeđene otopine miješane kulture na površinu čvrstih podloga u posudama.

Metoda filtriranja. Zasniva se na propuštanju ispitnog materijala kroz posebne filtere sa određenim prečnikom pora i odvajanju mikroorganizama sadržanih po veličini. Ova metoda se uglavnom koristi za prečišćavanje virusa od bakterija, kao i za dobijanje faga i toksina (u filtratu - čisti fag, prečišćeni toksin).

Metode zasnovane na biološkim svojstvima mikroorganizama

Stvaranje optimalnih uslova za reprodukciju

Stvaranje optimalnog temperaturnog režima za selektivno suzbijanje razmnožavanja prateće mikroflore na niskim temperaturama i proizvodnju kultura psihrofilnih ili termofilnih bakterija. Većina mikroba se dobro razvija na 35-37°C, Yersinia dobro raste na 22°C, leptospira se uzgaja na 30°C. Termofilne bakterije rastu na temperaturama koje su izvan temperaturnih režima drugih povezanih bakterijskih vrsta (na primjer, Campylobacter se uzgaja na 42°C).
Stvaranje uslova za aerobiozu ili anaerobiozu. Većina mikroorganizama dobro raste u prisustvu atmosferskog kiseonika. Obavezni anaerobi rastu u uslovima koji isključuju prisustvo atmosferskog kiseonika (uzročnici tetanusa, botulizma, bifidumbakterije, bakteroidi itd.). Mikroaerofilni mikroorganizmi rastu samo pri niskom sadržaju kiseonika i visokom sadržaju CO2 (Campylobacter, Helicobacter).
metoda obogaćivanja. Ispitni materijal se inokulira na elektivne hranjive podloge koje pospješuju rast određene vrste mikroorganizama.

Metode za izolaciju čistih kultura mikroorganizama

Pošto mikrobi rastu difuzno u tečnim medijima, tj. lako se distribuiraju po okolini, teško je izolovati jednu mikrobnu ćeliju od druge. Dakle, Pasteurova metoda ne daje uvijek čistu kulturu. Stoga se trenutno ova metoda uglavnom koristi za preliminarno smanjenje koncentracije mikroorganizama u materijalu prije inokulacije u gustom mediju kako bi se dobile izolirane kolonije.

Metode mehaničkog odvajanja mikroorganizama pomoću gustih hranjivih podloga. Ove metode uključuju Kochovu metodu i metodu Drygalskyja.

Koch metoda (metoda duboke sjetve).

Ispitni materijal se unosi bakteriološkom petljom ili Pasteurovom pipetom u epruvetu s rastopljenim gustim hranjivim podlogom. Ravnomjerno promiješajte sadržaj epruvete rotirajući je između dlanova. Kap razrijeđenog materijala prenosi se u drugu epruvetu, iz druge u treću i tako dalje. Sadržaj svake epruvete, počevši od prve, sipa se u sterilne Petrijeve posude. Nakon stvrdnjavanja podloge u čašama, one se stavljaju u termostat za uzgoj.

Za izolaciju anaerobnih mikroorganizama Koch metodom potrebno je ograničiti pristup kisika kulturi.

U tu svrhu se površina dubokog zasijavanja u Petrijevoj posudi napuni sterilnom mješavinom parafina i vazelina (1:1). Takođe možete ostaviti inokulum, dobro pomešan sa agar medijumom, direktno u epruveti.

Istovremeno, pamučni čep se zamjenjuje gumenim ili se površina agara prelije mješavinom parafina i vazelinskog ulja. Da bi se izdvojile narasle kolonije anaerobnih mikroorganizama, epruvete se lagano zagrijavaju brzim rotiranjem iznad plamena plamenika. Agar uz zidove se topi i kolona lako klizi u pripremljenu Petrijevu posudu. Zatim se kolona agara reže sterilnim skalpelom, kolonije se uklanjaju sterilnom petljom ili sterilnim kapilarnim rezom i prebacuju u tečni medij.

Metoda Drygalskog se zasniva na mehaničkom odvajanju mikrobnih ćelija na površini gustog hranljivog medija u Petrijevim posudama.

Svaka mikrobna stanica, fiksirajući se na određenom mjestu, počinje se razmnožavati, formirajući koloniju.

Za sjetvu prema Drygalsky metodi koristi se nekoliko Petrijevih zdjela, napunjenih gustim hranjivim podlogom.

Kap ispitivanog materijala stavlja se na površinu podloge.

Zatim se sterilnom lopaticom ova kap raspoređuje po cijelom hranjivom mediju (sjetva travnjakom).

Zasijavanje se takođe može vršiti u nizu pomoću bakteriološke petlje. S istom lopaticom ili petljom, sjetva se vrši u drugom, trećem itd. čaše. U pravilu se mikrobni rast u obliku kontinuirane prevlake pojavljuje u prvoj ploči nakon uzgoja usjeva, u sljedećim pločama se sadržaj mikroba smanjuje i formiraju se izolirane kolonije iz kojih se čista kultura može lako izolirati prosijavanjem.

Tako se postiže kontinuirani rast u prvim sektorima, a izolovane kolonije će rasti duž narednih poteza, koje su potomci jedne ćelije.

Da biste uštedjeli podloge i pribor, možete koristiti jednu posudu, podijelivši je na sektore, i inokulirati ih uzastopno potezom (metoda iscrpljivanja).

Da bi se to učinilo, materijal se uzima petljom i njime se povlači niz paralelnih poteza, prvo preko površine prvog sektora, a zatim se svi ostali sektori zasijavaju tako da ćelije ostaju na petlji.

Sa svakim narednim udarom, broj zasijanih ćelija se smanjuje.

Metoda za izolaciju čistih kultura upotrebom hemikalija koristi se za izolaciju kultura mikroorganizama otpornih na određene kemikalije.

Na primjer, ova metoda se može koristiti za izolaciju čiste kulture mikobakterije tuberkuloze koja je otporna na kiseline, baze i alkohol. U tom slučaju se ispitni materijal prije sjetve prelije sa 15% rastvorom kiseline ili antiformina i drži u termostatu 3-4 sata.

Nakon izlaganja kiselini ili lužini, ćelije bacila tuberkuloze ostaju žive, a svi ostali mikroorganizmi sadržani u ispitivanom materijalu umiru. Nakon kisele ili alkalne neutralizacije, tretirani materijal se sije na čvrstu podlogu i dobije se izolirane kolonije uzročnika tuberkuloze.

Biološke metode za izolaciju čistih kultura patogenih mikroorganizama temelje se na infekciji testnim materijalom laboratorijskih životinja osjetljivih na ovu vrstu patogena.

Ako se u ispitivanom objektu nalazi patogeni mikroorganizam, tada se laboratorijska životinja razbolijeva i umire. Nakon obdukcije pale životinje, unutrašnji organi se sije na posebne podloge, na kojima rastu čiste kulture izolovanih mikroba.

Prethodna567891011121314151617181920Sljedeća

VIDI VIŠE:

Izolacija čiste bakterijske kulture

Čista kultura je kultura koja sadrži mikroorganizme iste vrste i dobijena kao potomstvo jedne ćelije. Čiste kulture se mogu dobiti iz originalne mikrobne ćelije izolovane pomoću mikromanipulatora, ili iz izolovanih kolonija subkulturacijom u odvojenim epruvetama sa hranljivim medijumom.

Za izolaciju čiste kulture koriste se sljedeće metode.

1. Metoda Drygalskog. U ovoj metodi, rastopljeni hranljivi medij se sipa u 3 Petrijeve posude. Jedna kap ispitivanog materijala se dodaje u prvu čašu i sterilnom lopaticom razmazuje po površini hranljive podloge. Zatim se lopatica prenosi u drugu, a zatim u treću čašu, trljajući materijal koji je na njoj ostao u površinu hranjivog medija.

Prilikom sjetve ovom metodom, izolirane kolonije rastu na drugoj i trećoj ploči. Rezultirajuće pojedinačne kolonije se subkulturiraju u epruvete sa hranljivim medijumom da bi se dobila čista kultura mikroorganizma.

2. Metoda paralelnih poteza. Ovom metodom materijal se raspoređuje po površini agara uz pomoć bakteriološke petlje u paralelnim potezima u jednom smjeru.

Zatim, okrećući čašu za 90 °, potezi se povlače u smjeru okomitom na prve poteze. Kod ovog načina sjetve materijal u petlji se postupno troši, a izolirane kolonije mikroba rastu duž linija poteza primijenjenih na kraju sjetve.

3. Kochova metoda (metoda prosijavanja u dubinu podloge). Ovom metodom se jedna bakteriološka petlja ispitivanog materijala unosi u epruvetu sa agarom, rastopi se i ohladi na 43-45°C, te dobro promiješa.

Nakon toga se jedna omča materijala prenosi iz ove epruvete u drugu epruvetu, a zatim iz nje u treću epruvetu. Pripremljena razblaženja bakterija se izlivaju iz epruveta u sterilne Petrijeve posude. Nakon stvrdnjavanja medijuma, čaše se stavljaju u termostat. Broj kolonija u pločama za kulturu opada kako se materijal razrjeđuje.

Kontrolna pitanja na temu lekcije:

1. Priroda rasta bakterija u tečnim, polutečnim i gustim hranljivim medijima.

Karakterizacija kolonija mikroorganizama.

3. Pigmenti bakterija i njihova uloga za mikroorganizme.

4. Metode za izolaciju čistih bakterijskih kultura.

Literatura za pripremu za lekciju:

Glavna literatura:

1. Medicinska mikrobiologija, virologija i imunologija. Ed. AA.

Vorobyov. M., 2004.

Dodatna literatura:

1. L.B. Borisov. Medicinska mikrobiologija, virologija, imunologija. M., 2002.

2. O.K. Pozdeev. Medicinska mikrobiologija.

M., GEOTAR-MEDIA, 2005.

3. Medicinska mikrobiologija. Imenik. Ed. IN AND. Pokrovski i O.K. Pozdeeva. M., GEOTAR-MED, 1998.

AKTIVNOST 5

TEMA ČASA: Enzimi bakterija. Proučavanje enzimske aktivnosti mikroorganizama. Bakterijsko disanje. Metode uzgoja i izolacije čiste kulture anaeroba.

CILJ UČENJA: Upoznajte se sa bakterijskim enzimima.

Proučiti metode za određivanje enzimske aktivnosti mikroorganizama. Naučite o bakterijskom disanju. Proučiti metode uzgoja i izolacije čiste kulture anaeroba.

CILJEVI LEKCIJE:

1. Upoznajte se sa bakterijskim enzimima.

Proučiti metode za određivanje enzimske aktivnosti mikroorganizama.

3. Upoznajte se sa procesima disanja bakterija.

4. Proučiti metode uzgoja i izolacije čiste kulture anaeroba.

bakterijskih enzima

Svi biohemijski procesi u ćeliji mikroorganizama povezani sa metabolizmom, rastom i reprodukcijom odvijaju se uz učešće enzima (enzima).

Enzime sintetiše sama mikrobna ćelija i imaju složenu strukturu. Oni su ili samo protein visoke molekularne težine (tripsin, pepsin, itd.), ili se sastoje od proteina (apoenzima) povezanog sa kofaktorom (koenzim). Koenzim može biti neorganska (metalna) ili organska supstanca male molekularne mase.

Klasifikacija enzima se zasniva na tipovima reakcija koje katalizuju.

Svi enzimi su podijeljeni u šest klasa:

1). Oksidoreduktaza- Enzimi za prijenos elektrona. Ovi enzimi katalizuju redoks reakcije. To uključuje dehidrogenaze (NAD, NADP, FAD), katalaze, citokrome.

Transferaze- enzimi za prijenos grupa između molekula s jednog spoja na drugo. To uključuje acetiltransferazu, fosfotransferazu, aminotransferazu.

3). Hidrolaze- enzimi za prenos funkcionalnih grupa uz učešće vode. Ova klasa enzima uključuje peptidne hidrolaze, glukozidazu, amilaze, esteraze, lipazu, fosfatazu.

4). Liase- enzimi koji cijepaju ili dodaju različite spojeve s dvostrukom vezom bez sudjelovanja vode.

Ovi enzimi uključuju piruvat dekarboksilazu i aldolazu.

5). Izomeraze- enzimi koji prenose grupe unutar molekula sa formiranjem izomernih oblika. Ovi enzimi uključuju triizofosfat izomerazu, glukozofosfat izomerazu.

ligaze (sintetaze)- enzimi koji kombinuju dva molekula uz istovremeno razbijanje fosfatnih veza koristeći energiju ATP-a. Ligaze uključuju enzime koji kataliziraju sintezu složenih organskih tvari iz jednostavnih spojeva (asparagin sintetaza, kokarboksilaze).

Aktivnost enzima se mjeri u međunarodnim jedinicama (ME). 1 IU odgovara količini enzima koja pretvara jedan mikromol supstrata u 1 minutu pod standardnim uslovima.

Bakterije se dijele na endoenzime i egzoenzime.

Endoenzimi nalaze se unutar bakterijske ćelije, katalizuju intracelularne metaboličke procese. Egzoenzimi oslobađaju se u vanjsko okruženje i obavljaju funkciju cijepanja složenih nutrijenata.

Enzimi agresije. Patogene bakterije imaju posebnu grupu egzoenzima tzv enzimi agresije. Obavljaju funkcije olakšavanja prodiranja i širenja bakterija u tkiva tijela domaćina i slabljenja njegovih zaštitnih svojstava.

Enzimi agresije uključuju: hijaluronidazu, neuraminidazu, kolagenazu, proteaze, fibrinolizin, hemolizin, leukocidin.

Konstitutivni i inducibilni enzimi. Enzimi koje ćelija sintetiše konstantnom brzinom, bez obzira na prisustvo supstrata u okolini, nazivaju se konstitutivni. inducibilan(adaptivni) enzimi nastaju samo u prisustvu odgovarajućeg supstrata u okruženju.

Na primjer, enzim beta-galaktozidaza počinje se sintetizirati tek kada se u hranljivu podlogu doda ugljikohidrat laktoza, koju ovaj enzim razgrađuje u glukozu i galaktozu.

Metode za određivanje enzimske aktivnosti mikroba

Obavezni uslov za identifikaciju izolirane čiste kulture bakterija je određivanje enzimske aktivnosti u odnosu na ugljikohidrate i proteine (biohemijski "pasoš" vrste).

Identificirati enzime koji razgrađuju ugljikohidrate (saharolitički enzimi) koristiti diferencijalno dijagnostičke medije Giss-a.

Hiss medij sadrži peptonsku vodu, pH indikator, plovak za hvatanje plina i jedan od ugljikohidrata (glukoza, laktoza, maltoza, manitol, saharoza, škrob, itd.). Ako bakterije razgrađuju ugljikohidrate, nastaje kiselina i mijenja se boja podloge zbog pH indikatora koji je prisutan u njemu. Većina patogenih bakterija razgrađuje ugljikohidrate i stvara samo kiseline; neke vrste fermentiraju ugljikohidrate za proizvodnju kiseline i plina (CO2).

U tom slučaju se mijenja boja medija i u plovku se pojavljuje mjehur plina.

Proteolitička aktivnost bakterija. Indikatori dubokog cijepanja proteina su stvaranje indola, amonijaka, vodonik sulfida. Za identifikaciju ovih plinovitih tvari, čiste kulture bakterija se inokuliraju na mesno-peptonsku juhu ili peptonsku vodu u epruvetama sa posebnim papirnim indikatorima.

U prisustvu proizvoda cijepanja, boja odgovarajućeg indikatora se mijenja.

Proteolitička aktivnost bakterija se također određuje inokulacijom čiste kulture injekcijom u kolonu želatine prisutnošću i prirodom razrjeđenja podloge, na primjer, u obliku obrnutog božićnog drvca, nokta, lijevak itd.

energetski metabolizam

To je skup biokemijskih reakcija čiji je rezultat stvaranje (akumulacija energije) i cijepanje (potrošnja energije) makroergijskih veza u molekulima ATP-a.

U bakterijama se ATP može sintetizirati kao rezultat procesa fermentacije i disanja.

Fermentacija. Stariji, neefikasan način generiranja energije, u kojem se 2 molekula ATP-a formiraju kao rezultat razgradnje molekula glukoze. Krajnji proizvodi fermentacije su CO2, voda, alkoholi i organske kiseline.

Proces se odvija bez učešća kiseonika.

Disanje nazvan proces oksidativne fosforilacije ugljikohidrata sa stvaranjem ATP, CO2 i molekula vode. Kada se jedan molekul glukoze razbije, oslobađa se 12 elektrona koji prolaze kroz lanac respiratornih enzima dajući energiju za sintezu 36 molekula ATP-a. Oslobađanje respiratornog lanca od elektrona vrši se supstancama tzv akceptori elektrona.

Ove supstance uključuju kiseonik, sulfate, nitrate, karbonate. Ako je konačni akceptor elektrona molekularni kisik, naziva se disanje aerobna. U slučaju konačnog prihvatanja elektrona drugim jedinjenjima, naziva se disanje anaerobni.

Prema vrsti disanja bakterije se dijele u četiri glavne grupe:

1. Obavezni (strogi) aerobi rastu uz slobodan pristup kiseoniku (uzročnik tuberkuloze).

mikroaerofili rastu pri niskoj (do 1%) koncentraciji kisika i povećanoj koncentraciji ugljičnog dioksida (Hemophilus influenzae).

Fakultativni anaerobi može rasti i u prisustvu kiseonika i u anaerobnim uslovima (E. coli).

4. Obavezni (strogi) anaerobi mogu rasti samo u potpunom odsustvu kisika u okolišu (uzročnici tetanusa, botulizma, plinske gangrene).

Pročitajte također:

Izolacija čistih kultura mikroorganizama

Čista kultura je kultura koja sadrži mikroorganizme jedne vrste. Izolacija čistih kultura bakterija je obavezna faza bakterioloških istraživanja u laboratorijskoj dijagnostici zaraznih bolesti, u proučavanju mikrobne kontaminacije različitih objekata okoliša i općenito u svakom radu s mikroorganizmima.

Proučavani materijal (gnoj, ispljuvak, izmet, krv i drugi materijal pacijenata; voda, tlo, zrak, hrana, životinjski i ljudski leševi, vektori) obično sadrži asocijacije mikroba.

Izolacija čiste kulture omogućava proučavanje morfoloških, kulturnih, biohemijskih, antigenskih i drugih karakteristika, čija ukupnost određuje vrstu i tip patogena, odnosno identifikuje ga.

Za izolaciju čistih kultura mikroorganizama koriste se metode koje se mogu podijeliti u nekoliko grupa.

Pasteur metoda- sekvencijalno razblaživanje ispitivanog materijala u tečnom hranljivom mediju do koncentracije od jedne ćelije po zapremini (ima istorijski značaj).

2. Kochova metoda ("ožičenje ploča")- uzastopno razblaživanje ispitivanog materijala u rastopljenom agaru (temperatura 48-500C), nakon čega sledi izlivanje u Petrijeve posude, gde se agar stvrdnjava.

Inokulacije se po pravilu rade iz posljednja tri-četiri razrjeđenja, gdje je malo bakterija, a u budućnosti, rastom na Petrijevim zdjelicama, nastaju izolirane kolonije, formirane iz jedne izvorne matične stanice. Iz izoliranih kolonija u dubini agara dobiva se čista kultura bakterija subkulturom na svježe podloge.

Šukevič metoda- koristi se za dobijanje čiste kulture Proteusa i drugih mikroorganizama sa "puzajućim" rastom. Inokulacija test materijala se vrši u kondenzacionoj vodi na bazi kosog agara. Pokretni mikrobi (Proteus) su u stanju da se uzdignu uz kos agara, stacionarni oblici ostaju da rastu na dnu mesta inokulacije.

Ponovnim zasijavanjem gornjih rubova kulture može se dobiti čista kultura.

4. Metoda Drygalskog- ima široku primjenu u bakteriološkoj praksi, dok se materijal za ispitivanje razrjeđuje u epruveti sa sterilnom fiziološkom otopinom ili bujonom.

Jedna kap materijala se dodaje u prvu čašu i sterilnom staklenom lopaticom razmazuje po površini medijuma. Zatim se istom lopaticom (bez spaljivanja u plamenu gorionika) vrši ista setva u drugu i treću čašu. Svakim zasijavanjem bakterija na lopaticu je sve manje, a kod sjetve na treću čašu bakterije će se distribuirati po površini hranljive podloge odvojeno jedna od druge.

Nakon 1-7 dana držanja posuda u termostatu (u zavisnosti od brzine rasta mikroorganizama), na trećoj posudi svaka bakterija daje klon ćelija, formirajući izolovanu koloniju, koja se subkultivira na kosom agaru kako bi se akumulirala. čista kultura.

5. Weinbergova metoda. Posebne poteškoće nastaju u izolaciji čistih kultura obveznih anaerobnih.

Ako kontakt s molekularnim kisikom ne izazove odmah ćelijsku smrt, tada se sjetva provodi po metodi Drygalsky, ali se nakon toga čašice odmah stavljaju u anaerostat. Međutim, metoda uzgoja se češće koristi. Njegova suština leži u činjenici da se razrjeđivanje ispitivanog materijala vrši u rastopljenom i ohlađenom na 45-500C agar hranjivom mediju. Napraviti 6-10 uzastopnih razblaženja, zatim se podloga u epruvetama brzo ohladi i površina prekrije slojem mešavine parafina i vazelinskog ulja kako bi se sprečilo prodiranje vazduha u debljinu hranljive podloge.

Ponekad se hranjivi medij, nakon inokulacije i miješanja, prenosi u sterilne Burri epruvete ili Pasteurove kapilarne pipete, čiji su krajevi zapečaćeni. Uspješnim razrjeđivanjem u epruvetama, Burri epruvetama, Pasteurovim pipetama rastu izolirane kolonije anaeroba.

Kako bi izolirane kolonije bile jasno vidljive, koriste se pročišćene hranjive podloge. Da bi se izdvojile izolirane anaerobne kolonije, epruveta se lagano zagrijava rotacijom iznad plamena, dok se agar uz stijenke topi i sadržaj epruvete u obliku kolone agara sklizne u sterilnu Petrijevu posudu.

Kolona agara se reže sterilnom pincetom, a kolonije se uklanjaju petljom. Ekstrahovane kolonije se stavljaju u tečnu podlogu pogodnu za razvoj izolovanih mikroorganizama (npr. Kitt-Tarozzi medijum). Agar podloga se ispušta iz Burri epruvete propuštanjem gasa kroz pamučni čep.

6. Hungate metoda- kada žele dobiti izolirane kolonije bakterija s posebno visokom osjetljivošću na kisik (strogi aerobni), koriste Hungate metodu rotirajućih epruveta.

Da bi se to postiglo, rastopljeni agar medij se inokulira bakterijama jednosmjernom strujom kroz epruvetu s inertnim plinom oslobođenim nečistoća kisika. Zatim se epruveta zatvara gumenim čepom i postavlja horizontalno u stezaljku koja rotira epruvetu, dok se medij ravnomerno raspoređuje po zidovima epruvete i stvrdnjava u tankom sloju. Upotreba tankog sloja u epruveti napunjenoj mješavinom plina omogućava dobivanje izoliranih kolonija koje su jasno vidljive golim okom.

Izolacija pojedinačnih ćelija mikromanipulatorom. Mikromanipulator je uređaj koji omogućava uklanjanje jedne ćelije iz suspenzije pomoću posebne mikropipete ili mikropetlje. Ova operacija se kontroliše pod mikroskopom. Na stubu mikroskopa je ugrađena mokra komora u koju se stavlja preparat "viseća kap".

U držačima operativnih postolja učvršćene su mikropipete (mikropetlje), čije se kretanje u vidnom polju mikroskopa vrši s mikronskom tačnošću zahvaljujući sistemu vijaka i poluga.

Istraživač, gledajući kroz mikroskop, mikropipetama izdvaja pojedinačne ćelije i prenosi ih u epruvete sa sterilnim tečnim medijumom da bi dobio ćelijski klon.

Prethodna17181920212223242526272829303132Sljedeća

VIDI VIŠE:

Metode izolacije čistih kultura aerobnih bakterija

a) Pasteur metoda– je od istorijskog značaja, omogućava sekvencijalno razblaživanje ispitivanog materijala u tečnom hranljivom mediju metodom valjanja

b) Kochova metoda- metoda rasporeda ploča - zasnovana na sekvencijalnom razrjeđivanju ispitivanog materijala mesno-pepton agarom, nakon čega slijedi sipanje epruveta s razrijeđenim materijalom u Petrijeve zdjelice

u) Metoda Drygalskog- kod setve materijala koji je obilno zasejan mikroflorom koristiti 2-3 šolje za uzastopnu setvu sa lopaticom.

G) Setva u petlju sa paralelnim potezima.

biološke metode na osnovu bioloških svojstava patogena.

a) Biološki- infekcija visoko osjetljivih životinja, gdje se mikrobi brzo razmnožavaju i akumuliraju.

U nekim slučajevima, ova metoda je jedina koja omogućava izolaciju kulture patogena od bolesne osobe (na primjer, kod tularemije), u drugim slučajevima je osjetljivija (na primjer, izolacija pneumokoka kod bijelih miševa ili uzročnika tuberkuloze kod zamoraca).

b) Hemijski– na osnovu otpornosti mikobakterija na kiselinu. Da bi se materijal oslobodio prateće flore, it
tretirana rastvorom kiseline.

Raste samo bacili tuberkuloze, jer kiselina tolerantne mikrobe ubija.

u) fizička metoda na osnovu otpornosti spora na toplotu. Izolirati kulture bakterija koje stvaraju spore
mješavine, materijal se zagrijava na 80°C i inokulira na hranjivu podlogu. Samo spore bakterije će rasti, jer su njihove spore ostale žive i dale rast.

G) Šukevičeva metoda- zasnovano na visokoj pokretljivosti vulgarnog proteusa, sposobnog za puzeći rast.

Metoda prenošenja sa kolonija na kosi agar i BCH:

a) Prebacivanje iz kolonija u agar kosi

Poklopac čaše se lagano otvori, kalciniranom ohlađenom omčom odstranjuje dio pojedinačne kolonije, otvara se epruveta sa sterilnim kosim agarom držeći je lijevom rukom u nagnutom položaju, tako da površina medij se može posmatrati.

Petlja sa kulturom se prenosi u epruvetu ne dodirujući zidove, trlja preko hranljive podloge, klizeći po površini od jednog kraja epruvete do drugog, podižući poteze do vrha podloge - setvu sa moždani udar. Epruveta se zatvori i, bez puštanja, potpisuje se naziv zasijanog mikroba i datum sjetve.

b) Prelazak iz kolonije u mesno-peptonsku juhu

Tehnika ponovne sjetve na MPB je u osnovi ista kao kod sjetve na gustu podlogu.

Prilikom sjetve na BCH, petlja sa materijalom na njoj se uranja u podlogu. Ako je materijal viskozan i nije uklonjen iz petlje, utrlja se na zid posude, a zatim se ispere tekućim medijem. Tečni materijal sakupljen sterilnom Pasteurom ili graduiranom pipetom ulijeva se u hranjivi medij.

Kao rezultat samostalnog rada student treba da zna:

Metode za izolaciju čiste kulture mikroorganizama

2. Metode uzgoja mikroorganizama

biti u mogućnosti da:

1. Osposobljenost za poštivanje pravila protivepidemijskog režima i sigurnosnih mjera opreza

Dezinfikujte materijal, dezinfikujte ruke

3. Pripremiti preparate od kolonija bakterija

4. Mikroskopirajte kolonije

5. Mikroorganizmi boje po Gramu

AKTIVNOST 8

TEMA.

Metode za izolaciju čistih kultura (nastavak). Enzimska aktivnost bakterija i metode za njeno proučavanje.

Pasteurova metoda (metoda ograničavanja razrjeđenja). Sastoji se u činjenici da se od ispitivanog materijala pravi niz uzastopnih razrjeđivanja u tekućem hranljivom mediju. Za to se u epruvetu sa sterilnom tečnom podlogom unese kap inokuluma, iz koje se kap prenese u sljedeću epruvetu i tako inokulira do 8-10 epruveta. Sa svakim razrjeđivanjem, broj mikrobnih stanica koje ulaze u podlogu će se smanjivati, te je moguće dobiti takvo razrjeđenje u kojem će u cijeloj epruveti sa podlogom biti samo jedna mikrobna ćelija iz koje se dobija čista kultura mikroorganizma. će se razviti. Pošto mikrobi rastu difuzno u tečnim medijima, tj. lako se distribuiraju po okolini, teško je izolovati jednu mikrobnu ćeliju od druge. Dakle, Pasteurova metoda ne daje uvijek čistu kulturu. Stoga se trenutno ova metoda uglavnom koristi za preliminarno smanjenje koncentracije mikroorganizama u materijalu prije inokulacije u gustom mediju kako bi se dobile izolirane kolonije.

Metode mehaničkog odvajanja mikroorganizama pomoću gustih hranjivih podloga. Ove metode uključuju Kochovu metodu i metodu Drygalskyja.

Koch metoda (metoda duboke sjetve). Ispitni materijal se unosi bakteriološkom petljom ili Pasteurovom pipetom u epruvetu s rastopljenim gustim hranjivim podlogom. Ravnomjerno promiješajte sadržaj epruvete rotirajući je između dlanova. Kap razrijeđenog materijala prenosi se u drugu epruvetu, iz druge u treću i tako dalje. Sadržaj svake epruvete, počevši od prve, sipa se u sterilne Petrijeve posude. Nakon stvrdnjavanja podloge u čašama, one se stavljaju u termostat za uzgoj.

Za izolaciju anaerobnih mikroorganizama Koch metodom potrebno je ograničiti pristup kisika kulturi. U tu svrhu se površina dubokog zasijavanja u Petrijevoj posudi napuni sterilnom mješavinom parafina i vazelina (1:1). Takođe možete ostaviti inokulum, dobro pomešan sa agar medijumom, direktno u epruveti. Istovremeno, pamučni čep se zamjenjuje gumenim ili se površina agara prelije mješavinom parafina i vazelinskog ulja. Da bi se izdvojile narasle kolonije anaerobnih mikroorganizama, epruvete se lagano zagrijavaju brzim rotiranjem iznad plamena plamenika. Agar uz zidove se topi i kolona lako klizi u pripremljenu Petrijevu posudu. Zatim se kolona agara reže sterilnim skalpelom, kolonije se uklanjaju sterilnom petljom ili sterilnim kapilarnim rezom i prebacuju u tečni medij.

Metoda Drygalskog se zasniva na mehaničkom odvajanju mikrobnih ćelija na površini gustog hranljivog medija u Petrijevim posudama. Svaka mikrobna stanica, fiksirajući se na određenom mjestu, počinje se razmnožavati, formirajući koloniju.

Za sjetvu prema Drygalsky metodi koristi se nekoliko Petrijevih zdjela, napunjenih gustim hranjivim podlogom. Kap ispitivanog materijala stavlja se na površinu podloge. Zatim se sterilnom lopaticom ova kap raspoređuje po cijelom hranjivom mediju (sjetva travnjakom).

Tako se postiže kontinuirani rast u prvim sektorima, a izolovane kolonije će rasti duž narednih poteza, koje su potomci jedne ćelije.

Da biste uštedjeli podloge i pribor, možete koristiti jednu posudu, podijelivši je na sektore, i inokulirati ih uzastopno potezom (metoda iscrpljivanja). Da bi se to učinilo, materijal se uzima petljom i njime se povlači niz paralelnih poteza, prvo preko površine prvog sektora, a zatim se svi ostali sektori zasijavaju tako da ćelije ostaju na petlji. Sa svakim narednim udarom, broj zasijanih ćelija se smanjuje.

Metoda za izolaciju čistih kultura upotrebom hemikalija koristi se za izolaciju kultura mikroorganizama otpornih na određene kemikalije. Na primjer, ova metoda se može koristiti za izolaciju čiste kulture mikobakterije tuberkuloze koja je otporna na kiseline, baze i alkohol. U tom slučaju se ispitni materijal prije sjetve prelije sa 15% rastvorom kiseline ili antiformina i drži u termostatu 3-4 sata. Nakon izlaganja kiselini ili lužini, ćelije bacila tuberkuloze ostaju žive, a svi ostali mikroorganizmi sadržani u ispitivanom materijalu umiru. Nakon kisele ili alkalne neutralizacije, tretirani materijal se sije na čvrstu podlogu i dobije se izolirane kolonije uzročnika tuberkuloze.

široko se koristi za određivanje broja živih mikroorganizama u tlu i drugim prirodnim supstratima. Njegova primjena omogućava ne samo uzimanje u obzir broja mikroorganizama, već i procjenu njihove raznolikosti prema morfologiji kolonija.

Uzorci tla uzimaju se sterilnom kašikom, studija se vrši na dan uzorkovanja. Suština metode leži u sjetvi ispitivanog uzorka tla na gustu podlogu u Petrijeve zdjelice i naknadnom prebrojavanju izraslih kolonija. Vjeruje se da je svaka kolonija rezultat reprodukcije jedne ćelije. Rad se odvija u tri faze: priprema razrjeđenja, sjetva u čaše, brojanje naraslih kolonija.

Inokulacija se vrši iz razblaženja suspenzije u zavisnosti od očekivanog broja mikroorganizama u ispitivanom supstratu. Razblaženja se rade u sterilnoj vodi iz slavine ili izotoničnom rastvoru natrijum hlorida. Tokom eksperimenta korišćen je konstantni faktor razblaženja. Najčešće se rade decimalna razrjeđenja.

Uzorak analiziranog tla (1-10 g) stavi se u tikvicu sa 100 ml sterilne vode i promućka. Zatim sterilnom pipetom prenesite 1 ml ispitivanog materijala u epruvetu sa 9 ml sterilne vode. Ako je ispitni materijal već razrijeđen 100 puta, dobiva se razrjeđenje 1:1000. Suspenzija ovog razblaženja se temeljito promiješa, unese se u pipetu i dobijena suspenzija se ispusti iz nje. Zatim istom pipetom uzmite 1 ml dobivenog razrjeđenja i prenesite ga u drugu epruvetu - dobije se razrjeđenje 1: 10 000. Naredna razrjeđenja pripremaju se na isti način. Stepen razblaženja je određen očekivanim brojem mikroorganizama u uzorku: broj razblaženja je veći, što je više mikroorganizama u originalnom supstratu.

Sjetva se vrši na agar podloge u Petrijeve posude. Meso-peptonski ili riblje-peptonski agar (MPA, RPA) se koristi za određivanje ukupnog broja mikroorganizama, agar od sladovine (SA) se koristi za određivanje sadržaja gljivica u zemljištu, odgovarajućim hranljivim podlogama se utvrđuje broj razne fiziološke grupe i sanitarni indikativni mikroorganizmi. Agarizovani medijum otopljen u vodenom kupatilu sipa se u sterilne Petrijeve posude, po 20-30 ml. Ploče se ostavljaju na horizontalnoj površini dok se agar ne stvrdne. Sa sterilnom pipetom, određena zapremina (obično 0,1-0,5 ml) odgovarajućeg razblaženja, prethodno dobro promešana, nanosi se na površinu agar ploče u Petrijevoj posudi. Ovaj volumen se sterilnom lopaticom širi po površini medijuma. Zatim se ovom lopaticom provodi po cijeloj površini podloge u drugoj i trećoj čaši, gdje inokulum nije unesen (metoda deplecione inokulacije).

Iz svakog razblaženja se pravi 4-6 paralelnih setva. Kod paralelnih useva istog razblaženja može se koristiti jedna sterilna pipeta i jedna lopatica. Čaše sa inokuliranim podlogama stavljaju se u termostat podešen na temperaturu pogodnu za razvoj organizama koji se otkrivaju. Bakterije se broje tokom uzgoja na temperaturi od 30°C nakon tri dana, na sobnoj temperaturi - nakon sedam dana. Brojanje kvasca i gljivica - na sobnoj temperaturi nakon 310 dana (na temperaturi od 25°C, period posmatranja gljiva može se smanjiti na 2-3 dana).

Broj kolonija uzgojenih u Petrijevoj posudi se broji i preračunava na 1 g. Rezultati paralelnog zasijavanja se sumiraju i izračunava se prosječan broj kolonija uzgojenih kada se zasije iz ovog razrjeđenja. Kolonije se broje bez otvaranja Petrijevih zdjela.

Točnost metode ovisi o broju prebrojanih kolonija, a ne o broju ponavljanja. Najboljim uzgojem smatra se da, kada se sije na gustu hranjivu podlogu, od 50 do 100 kolonija. Ako je broj uzgojenih kolonija manji od 10, ovi rezultati se odbacuju i ne koriste se za izračunavanje broja ćelija u originalnom supstratu. Poželjno je da ukupan broj izbrojanih kolonija kada se sije iz ovog razblaženja bude najmanje 300.

Broj mikroorganizama u 1 g (1 ml) početnog supstrata izračunava se po formuli:

T = a x b x c / d,

gdje je T broj mikroorganizama u 1 g, a je broj izbrojanih kolonija, b je razrjeđenje od kojeg je napravljena inokulacija, c - 10 (ako je 0,1 ml suspenzije inokulirano na ploče), d je masa supstrata (tla) uzetog za analizu

Statistička obrada rezultata je moguća samo uz minimalnu tehničku grešku, tako da metoda ploče zahtijeva veliku čistoću i tačnost u svim operacijama. Potrebno je pažljivo zaštititi pipete i medije od kontaminacije stranim mikroorganizmima, jer slučajno unesena ćelija može precijeniti broj mikroorganizama u test suspenziji. Priprema razblaženja i setvu vršiti u kutiju.

Opisani metod je primenljiv za obračun aerobnih i fakultativnih anaeroba. Da bi se uzeli u obzir strogi anaerobi, Petrijeve zdjelice se nakon inokulacije stavljaju u anaerobne uslove.

Ekološke metode za proučavanje mikroorganizama u tlu

Kochova metoda se koristi za određivanje ukupnog broja bakterija. U praznu sterilnu Petrijevu posudu sipajte 1 ml ispitivanog materijala iz odgovarajućeg razblaženja i sipajte 10 - 15 ml rastopljene i ohlađene na 45 0 C MPA, pomešajte sa tečnošću, rotirajući šolju po površini stola.

Nakon kultivacije usjeva, broje se kolonije izrasle na površini i u dubini agara. Da biste to učinili, čaša se stavlja naopako na crnu podlogu, svaka izbrojana kolonija je označena markerom na staklu. Procijenite samo ona jela koja su narasla od 30 do 300 kolonija. Ako je na posudi naraslo više od 300 kolonija, a analiza se ne može ponoviti, onda se kolonije mogu prebrojati pod jakim bočnim osvjetljenjem pomoću lupe i posebne ploče s rešetkom.

Broj kolonija se broji u najmanje 20 kvadrata od 1 cm 2 na različitim mjestima posude. Izračunava se prosječan broj kolonija u 1 cm 2, koji se množi s površinom posude.

Prilikom brojanja kolonija može se koristiti poseban uređaj za brojanje bakterija, PSB.

Rezultat brojanja kolonija u svakoj posudi je broj bakterija po 1 ml (cm 3) ili 1 g ispitivanog materijala, uzimajući u obzir razrjeđenje. Za konačni broj bakterija uzima se aritmetička sredina rezultata brojanja kolonija na pločama sa inokulacijom dva susjedna razrjeđenja.

primjer: uzgoj 10 -1 - 250 kolonija, uzgoj 10 -2 - 23 kolonije.

Ukupan broj bakterija = 250 x 10 + 23 x 100 / 2 = 2400 cfu / ml = 2,4 x 10 2 cfu / ml (jedinice koje formiraju kolonije po 1 ml).

Rezultat istraživanja može se zaokružiti na 2 - 3 značajne brojke.

Metoda titracije.

Koristi se za određivanje broja PSD-ova.

1. faza: homogenizacija materijala. Po potrebi priprema suspenzije za prevođenje mikroorganizama u tečnu fazu.

2. faza: priprema serije razblaženja.

3. faza: inokulacija odabranih zapremina ispitnog materijala (100, 10, 1 ml) i njegovih razblaženja od 1 ml u tečni hranljivi medij. Da bi se poboljšala tačnost metode, svaki volumen se može sijati paralelno u nekoliko porcija hranljivog medija (dvoredna, troredna, petoredna). Optimalno je trostruko ponavljanje (dovoljna pouzdanost uz relativno nisku cijenu).

4. faza: uzimajući u obzir prisustvo rasta na tečnom hranljivom mediju i zasijavanje iz pozitivnih zapremina na čvrstu hranljivu podlogu.

5. faza: identifikacija mikroorganizama uzgojenih na čvrstom hranljivom mediju. Istovremeno se uzimaju u obzir kulturološka svojstva i po potrebi se provode dodatne studije (proučavanje tinktorijalnih, morfoloških, biohemijskih i seroloških svojstava).

Ako se koristi metoda jednog reda, rezultat se obično izražava kao titar ciljnog mikroorganizma, koji se uzima kao najmanja zapremina (najveće razrjeđenje) u kojoj je još pronađen.

Ako je korištena višeredna metoda, rezultati se bilježe pomoću posebnih tabela koje omogućavaju, na osnovu kombinacije pozitivnih volumena koji su doveli, da se odredi titar, indeks (MP).

Uvod u praksu anilinskih boja

Upotreba imersionog sistema i kondenzatora u mikroskopiji

Razvoj metode uzgoja na biološkim tekućinama i gustim hranjivim podlogama

Razvoj metode frakcijske subsetve

Otkriće uzročnika antraksa, kolere, tuberkuloze i tuberkulina

Otprilike iste godine formirana je i uspješno radila Njemačka škola mikrobiologa, na čijem je čelu bio ROBERT KOCH (1843 - 1910). Koch je započeo svoja istraživanja u vrijeme kada je uloga mikroorganizama u etiologiji zaraznih bolesti bila pod ozbiljnim sumnjama. Da bi se to dokazalo, bili su potrebni jasni kriterijumi koje je formulisao Koh i koji su ušli u istoriju pod imenom "Henle-Koch trijade". Suština trijade je bila sledeća:

1) navodni mikrob-uzročnik uvek treba da se otkrije samo u ovoj bolesti, a ne izolovan od drugih bolesti i od zdravih osoba;

2) patogen mora biti izolovan u čistoj kulturi;

3) čista kultura ovog mikroba treba da izazove oboljenje eksperimentalno zaraženih životinja sa kliničkom i patološkom slikom sličnom bolesti kod ljudi.

Praksa je pokazala da su sve tri točke od relativnog značaja, jer je daleko od uvijek moguće izolirati uzročnika bolesti u čistoj kulturi i izazvati bolest čovjeka kod eksperimentalnih životinja. Uz to, patogeni su pronađeni kod zdravih ljudi, posebno nakon bolesti. Ipak, u ranim fazama razvoja i formiranja medicinske mikrobiologije, kada su iz tijela pacijenata izolirani mnogi mikroorganizmi koji nisu bili srodni ovoj bolesti, trijada je odigrala važnu ulogu u utvrđivanju pravog uzročnika bolesti. Na osnovu svog koncepta, Koch je konačno dokazao da mikroorganizam koji je ranije pronađen kod životinja sa antraksom ispunjava zahtjeve trijade i pravi je uzročnik ove bolesti. Usput je Koch ustanovio sposobnost bakterija antraksa da formiraju spore.

Kochova uloga u razvoju osnovnih metoda za proučavanje mikroorganizama je velika. Tako je u mikrobiološku praksu uveo metodu izolacije čistih kultura bakterija na čvrstim hranjivim podlogama, prvi je koristio anilinske boje za bojenje mikrobnih stanica, a za njihovo mikroskopsko proučavanje koristio imerzione leće i mikrofotografiju.

Koch je 1882. dokazao da je mikroorganizam koji je izolirao uzročnik tuberkuloze, koja je kasnije nazvana Kochov bacil. Godine 1883. Koch i njegovi saradnici izolirali su uzročnika kolere, vibrio cholerae (Kochov vibrio).

Od 1886. Koch je čitavo svoje istraživanje posvetio potrazi za lijekovima efikasnim za liječenje ili prevenciju tuberkuloze. U toku ovih studija dobio je prvi lek protiv tuberkuloze - tuberkulin, koji je ekstrakt iz kulture bakterija tuberkuloze. Iako tuberkulin nema ljekovito djelovanje, uspješno se koristi za dijagnosticiranje tuberkuloze.

Kochov naučni rad dobio je svjetsko priznanje, a 1905. godine dobio je Nobelovu nagradu za medicinu.

Koristeći metode koje je razvio Koch, francuski i njemački bakteriolozi otkrili su mnoge bakterije, spirohete i protozoe - uzročnike zaraznih bolesti kod ljudi i životinja. Među njima su uzročnici gnojnih i ranskih infekcija: stafilokoki, streptokoki, klostridije anaerobne infekcije, Escherichia coli i uzročnici crijevnih infekcija (tifusne i paratifusne bakterije, bakterije dizenterije Shiga), uzročnik infekcije krvne groznice - respirlao uzročnici respiratornih i mnogih drugih infekcija, uključujući i broj uzrokovanih protozoama (plazmodija malarija, dizenterijske amebe, lajšmanija). Ovaj period se naziva "zlatno doba" mikrobiologije.

Uloga domaćih naučnika u razvoju mikrobiološke nauke (I.I. Mečnikov, D.I. Ivanovski, G.N. Gabričevski, S.N. Vinogradski, V.D. Timakov, N.F. Gamaleja, L.A.P.F. Zdrodovsky, Z.V. Ermoljeva).

Jedan od osnivača imunologije bio je I. I. MECHNIKOV (1845-1916) - tvorac fagocitne, ili ćelijske, teorije imuniteta. Godine 1888. Mečnikov je prihvatio Pasteurov poziv i vodio laboratoriju u njegovom institutu. Međutim, Mechniov nije prekinuo bliske veze sa svojom domovinom. U više navrata dolazio je u Rusiju, a mnogi ruski doktori radili su u njegovoj laboratoriji u Parizu. Među njima su Ya. Yu. Bardakh, V. A. Barykin, A. M. Bezredka, M. V. Veinberg, G. N. Gabrichevsky, V. I. L. A. Tarasevich, V. A. Khavkin, Ts. V. Tsiklinskaya, F. Ya. Chistovich i drugi koji su dali značajan doprinos razvoju. domaća i svjetska mikrobiologija, imunologija i patologija.

Unatoč značajnom napretku na polju stvaranja antiinfektivnog imuniteta, o mehanizmima njegovog razvoja nije se znalo praktički ništa. Prekretnica je bila otkriće I.I. Mečnikov (1845-1916), koju je izradio u Mesini 1882. proučavajući reakciju larve morske zvijezde na unošenje u nju trna ruže. Bila je to ona srećna prilika kada je slučajno zapažanje palo na pripremljeni um i dovelo I.I. Mečnikova stvaranju doktrine fagocitoze, upale i ćelijskog imuniteta.

Godine 1892. Mečnikov je objavio svoja Predavanja o komparativnoj patologiji upale, u kojima je, kao izvanredan mislilac, razmatrao patološke procese sa stanovišta evolucijske teorije. Godine 1901. pojavila se njegova nova knjiga "Imunitet na zarazne bolesti" u kojoj su sumirani rezultati dugogodišnjeg istraživanja u oblasti imuniteta.

Diskusija koja se odvijala između Mečnikova i njegovih pristalica sa sljedbenicima humoralne teorije, koji su u djelovanju antitijela vidjeli osnovu imuniteta, dobila je veliki stvaralački značaj. Početak proučavanja antitela postavili su radovi P. Ehrlicha, a potom J. Bordeta, izvedeni u poslednjoj deceniji 19. veka.

Doprinos PAUL EHRLICH-a (1854-1915) razvoju imunologije, kao i uspostavljanju i razvoju hemoterapije, neprocjenjiv je. Ovaj naučnik je bio prvi koji je formulisao koncept aktivnog i pasivnog imuniteta i bio je autor sveobuhvatne teorije humoralnog imuniteta, koja je objasnila kako poreklo antitela tako i njihovu interakciju sa antigenima. Ehrlichovo predviđanje postojanja ćelijskih receptora koji su u specifičnoj interakciji sa određenim grupama antigena kritizirano je dugi niz godina. Međutim, oživljen je u drugoj polovini 20. stoljeća u Burnetovoj teoriji i na molekularnom nivou dobio univerzalno priznanje.

II Mečnikov je bio jedan od prvih koji je shvatio da se humoralna i fagocitna teorija imuniteta međusobno ne isključuju, već samo nadopunjuju. Godine 1908. Mečnikov i Erlih su zajedno dobili Nobelovu nagradu za svoj rad na polju imunologije.

Ehrlichova otkrića:

1. upotreba metilenskog plavog u liječenju malarije

2. Upotreba tripan crvenog za liječenje tripanosoma

3. otkriće salvarsana (1907.)

4. Razvoj metode za određivanje aktivnosti antitoksičnih seruma i proučavanje interakcije antigen-antitijelo

5. teorija humoralnog imuniteta.

Kraj 19. vijeka obilježeno je epohalnim otkrićem kraljevstva Vira. Prvi predstavnik ovog kraljevstva bio je virus mozaika duhana, koji inficira listove duhana, a otkrio ga je 12. februara 1892. D. I. IVANOVSKIM, zaposlenik Odsjeka za botaniku St. i P. Froshem. Međutim, ta otkrića se u to vrijeme nisu mogla dostojno cijeniti i ostala su jedva primjećena na pozadini briljantnih uspjeha bakteriologije.

O privatnom trošku otvoren je šef Moskovske bakteriološke škole i jedan od vođa ruskih bakteriologa G. N. GABRIČEVSKI (1860-1907), koji je 1895. vodio Bakteriološki institut na Moskovskom univerzitetu. Radio je u oblasti specifičnog liječenja i prevencije šarlaha, povratne groznice. Njegova streptokokna teorija o poreklu šarlaha na kraju je dobila opšte prihvatanje. Gabričevski je autor Vodiča za kliničku bakteriologiju za doktore i studente (1893) i udžbenika Medicinska bakteriologija, koji je doživeo četiri izdanja. G.N. Gabričevski (1860-1907) uveo je seroterapiju u Rusiju, proučavao mehanizme imuniteta na povratnu groznicu, difteriju i šarlah.

Institut za eksperimentalnu medicinu postao je glavni centar Pererburške bakteriološke škole. S.N.VINOGRADSKY, koji je stekao svetsku slavu svojim radom u oblasti opšte mikrobiologije, odobren je za šefa bakteriološkog odeljenja. Uz pomoć metode izbornih kultura koju je razvio. Vinogradsky je otkrio bakterije sumpora i željeza, nitrifikacijske bakterije - uzročnike procesa nitrifikacije u tlu. Utemeljio je ulogu mikroorganizama u poljoprivredi.

V.D. Timakov (1905-1977) je jedan od osnivača teorije mikoplazmi i L-oblika bakterija, bavio se genetikom mikroorganizama, bakteriofagijom i prevencijom zaraznih bolesti.

Godine 1934. V.D. Timakov je pozvan u Turkmenski institut za mikrobiologiju i epidemiologiju, gdje je vodio odjel za proizvodnju vakcina i seruma. Učestalost crijevnih infekcija je u to vrijeme u republici još uvijek bila visoka. V.D. Timakov brani doktorsku tezu o profilaktičkim lijekovima protiv crijevnih infekcija. Mladi naučnik takođe sprovodi svoje prvo istraživanje o proučavanju bakteriofaga i virusa koji se mogu filtrirati u Turkmenistanu.

Pod rukovodstvom V.D. Timakova, počelo je stvaranje nove sekcije medicinske mikrobiologije, proučavanja L-oblika bakterija i mikoplazmi. Ovaj pravac je bio logičan nastavak proučavanja filterskih formi, iz kojih je V.D. Timakov je započeo svoju naučnu aktivnost. Za seriju studija za rasvjetljavanje uloge L-oblika bakterija i porodice mikoplazme u zaraznim bolestima, V.D. Timakov zajedno sa profesorom G.Ya. Kagan je 1974. godine dobio Lenjinovu nagradu.
Jedna od glavnih oblasti naučne delatnosti V.D. Timakov je posvećen genetici mikroorganizama. V.D. Timakov je smatrao da je neophodno koristiti genetske metode analize za rješavanje medicinski značajnih mikrobioloških i epidemioloških problema. A trenutno je pravac rada na genetici bakterija glavni u Institutu za epidemiologiju i mikrobiologiju. Gamaleya. Aktivnosti V.D. Timakova o rekonstrukciji genetike nije bila ograničena na provođenje vlastitog istraživanja. Učinio je izuzetno mnogo na rekreiranju genetike širom naše zemlje.
Osim što je bio strastven prema svom poslu, Vladimira Dmitrijeviča su odlikovali bistar um, razumijevanje života i hrabrost. Potonji kvalitet u potpunosti se očitovao u njegovoj borbi protiv antiznanstvenih "velikih" otkrića, poput onih koja su tvrdila da se virusi mogu pretvoriti u bakterije.

Izvanredni ruski mikrobiolog N.F.GAMALEYA (1859-1949), koji je još 1886. radio za Pasteura na bjesnilu, zajedno sa Mečnikovim i Bardakhom osnovao je prvu bakteriološku stanicu u Rusiji, gdje je proizvedena vakcina protiv bjesnila i vakcinisani ljudi protiv bjesnila. . N.F. Gamaleya je autor mnogih naučnih radova posvećenih bjesnilu, koleri i drugim problemima mikrobiologije i imunologije.

LA ZILBER (1894-1966) je osnivač virusne teorije nastanka tumora, izolovao je uzročnika dalekoistočnog krpeljnog encefalitisa.

Napredak u proučavanju tumorskih antigena inspiriše L.A. Zilbera da pokuša antitumorsku vakcinaciju, koju je započeo oko 1950. zajedno sa Z. L. Baydakovom i R. M. Radzikhovskom na dva modela: Brown-Pierceov tumor kod zečeva i spontani rak dojke kod miševa.

P.F. ZDRODOVSKY (1890-1976) bavio se problemom rikecioze, malarije, bruceloze i regulacije imuniteta.

Zinaida Vissarionovna YERMOLYEVA - tvorac prvog domaćeg antibiotika. Od svih dostignuća naučnog i tehnološkog napretka, otkriće antibiotika, a prije svega penicilina, nesumnjivo je od najveće važnosti za očuvanje zdravlja ljudi i produženje njihovog životnog vijeka. Među istaknutim naučnicima naše zemlje koji su dali veliki doprinos razvoju ove oblasti medicine jedno od vodećih mjesta s pravom pripada tvorcu prvog domaćeg antibiotika, izvanrednom mikrobiologu, talentovanom organizatoru zdravstvene zaštite, dobrom poznata javna ličnost, divan učitelj, akademik Akademije medicinskih nauka SSSR-a, zaslužni naučnik RSFSR-a, laureat Državne nagrade SSSR-a Zinaida Vissarionovna Yermolyeva. Zajedno sa drugim naučnicima, stajala je na početku medicinske bakteriohemije i proučavanja antibiotika u našoj zemlji, bila je ličnost velikog organizacionog talenta i nepresušne energije, čija je neumorna aktivnost i izuzetni lični kvaliteti zaslužili opšte poštovanje i priznanje.

Jedno od važnih područja naučne aktivnosti Zinaide Vissarionovne je proučavanje kolere. Na osnovu dubokih, sveobuhvatnih studija morfologije i biologije kolere i vibrija sličnih koleri, ZV Ermoljeva je predložila novu metodu za diferencijalnu dijagnozu ovih mikroorganizama.

Godine 1942. objavljena je monografija Z. V. Ermoljeve "Kolera" u kojoj su sumirani rezultati skoro 20 godina proučavanja vibrio kolere. U ovoj monografiji date su nove metode laboratorijske dijagnostike, liječenja i prevencije kolere.
Zinaida Vissarionovna posvetila je značajan dio svog naučnog rada izolaciji i proučavanju supstanci koje imaju antibakterijski učinak. Prvu takvu supstancu pod nazivom "lizozim" izolovala je Z. V. Ermoljeva zajedno sa I. S. Buyanovskaya još 1929. godine. Kako su pokazali rezultati daljih istraživanja, lizozim se nalazi u mnogim tkivima, kako životinjskog tako i biljnog porekla.

Grupa naučnika na čelu sa Z. V. Ermoljevom je 1960. godine prvi put u našoj zemlji dobila antivirusni lek interferon. Ovaj lijek je prvi put korišten za liječenje teške gripe 1962. godine i kao profilaktičko sredstvo. Lijek se trenutno koristi za prevenciju gripe i drugih akutnih respiratornih virusnih infekcija, kao i za liječenje niza virusnih bolesti u očnoj i kožnoj praksi.

Više od 30 godina svog života (1942-1974) Zinaida Vissarionovna posvetila je proučavanju antibiotika.

Ime Z. V. Ermolyeva neraskidivo je povezano sa stvaranjem prvog domaćeg penicilina, razvojem nauke o antibioticima i njihovom širokom upotrebom u našoj zemlji. Veliki broj ranjenika u prvom periodu Velikog otadžbinskog rata zahtevao je intenzivan razvoj i hitno uvođenje u medicinsku praksu visoko efikasnih lekova za suzbijanje infekcije rana. U to vrijeme (1942.) ZV Ermoljeva i njeni saradnici sa Svesaveznog instituta za epidemiologiju i mikrobiologiju pronašli su aktivnog proizvođača penicilina i izolovali prvi domaći penicilin, crustosin. Već 1943. laboratorija je počela pripremati penicilin za klinička ispitivanja.

Kasnije, pod vodstvom Z. V. Ermolyeve, stvoreni su i uvedeni u proizvodnju mnogi novi antibiotici i njihovi oblici doze, uključujući ekmolin, ekmonovocilin, bicilin, streptomicin, tetraciklin; kombinovani preparati antibiotika (dipasfen, ericiklin itd.). Treba naglasiti da je Zinaida Vissarionovna oduvijek aktivno sudjelovala u organizovanju industrijske proizvodnje antibiotika u našoj zemlji.