Mjerenje enzimske aktivnosti. Metabolizam i enzimi

Koncept enzima

enzimi (enzimi) koji se nazivaju rastvorljivi ili membranski vezani proteini koji imaju katalitičku aktivnost. ( Pored proteina, neke RNK (ribozimi) i antitela (abzimi) mogu da ispolje katalitičku aktivnost u telu, ali su hiljade puta manje efikasni od enzima.) Ova imena potiču od latinskog „fermentatio“ - fermentacija i grčkog „ en zym” - unutar startera. Oni podsjećaju na prve izvore enzima. Biohemija, koja proučava enzime, zove se enzimologija. Na dijagramima i u jednadžbama reakcije, molekule enzima su označene sa - E. Supstance koje kataliziraju enzimi nazivaju se podloge (S). Proizvodi enzimska reakcija označava - R. Pošto su enzimi proteini, dobijaju se u homogenom obliku na isti način kao i ostali proteini. Enzime karakteriziraju fizičko-hemijska svojstva svojstvena proteinima.

Razlika između enzima i anorganskih katalizatora:

a) mnogo efikasnije ubrzati reakcije;

b) obdarena visokom specifičnošću djelovanja;

c) regulisani su u fiziološkim uslovima;

d) rade u blagim uslovima.

Struktura enzima

Enzimi mogu biti jednostavni i složeni (konjugirani) proteini, koji mogu uključivati lipide, ugljikohidrate, ione metala, dušične baze, derivate vitamina. U tijelu enzimi mogu funkcionirati kako u rastvorljivom stanju, tako iu obliku nerastvorljivih kompleksa ili biti dio bioloških membrana.

Prepoznatljiva karakteristika enzima je prisustvo aktivni centar. Active Center - to je jedinstvena kombinacija aminokiselinskih ostataka koji se graniče sa prostorom koja obezbeđuje:

a) prepoznavanje molekula supstrata,

b) vezivanje supstrata za enzim,

c) sprovođenje katalitičke transformacije (u slučaju kompleksnog enzima u činu katalize učestvuje i koenzim koji je deo aktivnog centra).

Aktivno mjesto nastaje kada se protein savija i preuzima svoju nativnu (aktivnu) konformaciju. Struktura aktivnog centra može se promijeniti u interakciji sa supstratom. Prema figurativnom izrazu D. Koshlanda, supstrat se približava aktivnom centru kao ruka rukavici.

Jedna molekula enzima, posebno ako se sastoji od nekoliko podjedinica, može sadržavati više od jednog aktivnog mjesta.

U aktivnom centru postoje dvije lokacije. Prvo mjesto je odgovorno za prepoznavanje i vezivanje supstrata. Zove se mjesto vezivanja supstrata ili područje sidrenja. Drugi dio se naziva katalitički, sastoji se od aminokiselinskih ostataka koji učestvuju u činu katalize.

Enzimi su proteini koji se jako razlikuju u molekularnoj težini i strukturnoj složenosti. Primjer enzima male molekule je ribonukleaza, koja se sastoji od jedne podjedinice s molekulskom težinom od 13.700 Da. (Određena je aminokiselinska sekvenca ribonukleaze. Godine 1969. sintetizirana je ribonukleaza u laboratoriji B. Merrifielda u New Yorku.) Mnogi enzimi se sastoje od nekoliko podjedinica, na primjer, laktat dehidrogenaza se sastoji od četiri podjedinice dva tipa. Do danas je poznato nekoliko multienzimskih kompleksa koji se sastoje od desetina različitih podjedinica i nekoliko vrsta koenzima. Na primjer, kompleks piruvat dehidrogenaze sastoji se od 60 podjedinica tri tipa i pet tipova kofaktora. Molekularna težina takvog kompleksa je 2,3 * 10 6 - 10 * 10 6 Da, ovisno o izvoru enzima. Molekul enzima može biti manji od molekula supstrata. Na primjer: molekuli enzima amilaze i ribonukleaze manji su od molekula njihovih supstrata - škroba i RNK.

Proteinski dio kompleksnih enzima je katalitički neaktivan i tzv apoenzim. Vezanje apoenzima za neproteinsku komponentu dovodi do stvaranja katalitički aktivnog enzima (holoenzima):

Mnogi enzimi sadrže ion metala u svom sastavu, koji može obavljati različite funkcije:

a) učestvuje u vezivanju supstrata i procesu njegove katalitičke konverzije;

b) podstiču vezivanje koenzima za molekul enzima;

c) stabiliziraju tercijarnu strukturu enzima (npr. Ca 2+ u amilazi);

d) vezivanjem za supstrat formiraju pravi supstrat, na koji enzim deluje.

Mnogi koenzimi su derivati vitamina, pa su metabolički poremećaji u nedostatku vitamina posljedica smanjenja aktivnosti određenih enzima.

Neki enzimi, osim aktivnog mjesta, sadrže alosterični (regulatorni) centar - region proteinske globule, izvan aktivnog centra, gde se mogu vezati supstance koje regulišu enzimsku aktivnost. Ove supstance se nazivaju alosterične efektori (alosterični aktivatori ili inhibitori). Kao rezultat vezivanja efektora za alosterični centar, dolazi do promjene strukture proteina, što dovodi do promjene prostornog rasporeda aminokiselinskih ostataka u aktivnom centru i kao rezultat toga do promjene enzimskog aktivnost.

Enzimi koji se javljaju u istom organizmu i katalizuju istu hemijsku reakciju, ali sa različitom primarnom strukturom proteina, nazivaju se izoenzimi. Izoenzimi se međusobno razlikuju po fizičko-hemijskim svojstvima kao što su molekularna težina, termička stabilnost, specifičnost supstrata, elektroforetska pokretljivost. Priroda pojave izoenzima je raznolika, ali najčešće zbog razlika u strukturi gena koji kodiraju ove izoenzime ili njihove podjedinice. Na primjer, enzim laktat dehidrogenaza (LDH), koji katalizuje reverzibilnu oksidaciju laktata u piruvat, ima četiri podjedinice dva tipa M i H, kombinacija ovih podjedinica je u osnovi formiranja pet LDH izoenzima (slika 1). Za dijagnosticiranje bolesti srca i jetre potrebno je proučavati izoenzimski spektar LDH u krvnom serumu, jer su LDH 1 i LDH 2 aktivni u srčanom mišiću i bubrezima, a LDH 4 i LDH 5 su aktivni u skeletnim mišićima. i jetra.

Slika 1. Struktura različitih LDH izoenzima.

Mjerenje enzimske aktivnosti

Određivanje aktivnosti enzima vrši se mjerenjem brzine kataliziranih reakcija. Brzina enzimskih reakcija mjeri se smanjenjem koncentracije supstrata ili povećanjem koncentracije proizvoda u jedinici vremena:

v = -ΔS S /Δτ , v = ΔC P /Δτ ,

gdje ∆S S je promjena molarne koncentracije supstrata (mol/l),

∆C P- promjena molarne koncentracije produkta reakcije (mol/l),

Δτ - promjena vremena (min, sek).

Poželjno je provesti kinetička ispitivanja pri zasićenoj koncentraciji supstrata, inače enzim neće moći pokazati maksimalnu aktivnost.

Jedinice aktivnosti enzima:

Međunarodna jedinica enzima (U)- to je količina enzima koja katalizuje konverziju 1 μmol supstrata u 1 minuti na temperaturi od 25°C i optimalnom pH podloge.

U SI sistemu jedinica enzima je valjani (kat)- ovo je količina enzima koja katalizuje transformaciju jednog mola supstrata u 1 sekundi. Lako je izračunati da:

1 U = (1 * 10 -6 M) / 60 s = 1,67 * 10 -8 M s-1 = 1,67 * 10 -8 mačka \u003d 16,7 ncat.

Često definisano specifična aktivnost enzimski preparati dijeljenjem aktivnosti porcije enzimskog preparata, izražene u (U), s težinom porcije u miligramima:

I otkucaji \u003d U / masa lijeka (mg)

Kada se enzimi pročišćavaju, povećava se specifična aktivnost. Povećanjem specifične aktivnosti može se suditi o efikasnosti koraka prečišćavanja i čistoći enzimskog preparata.

Da biste procijenili aktivnost visoko pročišćenih, homogenih enzimskih preparata dijeljenjem broja međunarodnih jedinica (U) enzima u uzorku s količinom enzimske supstance (µmol) u ovom uzorku, izračunajte molarna aktivnost(brzina). U fizičkom smislu, molarna aktivnost je broj molekula supstrata koji prolaze kroz transformaciju na jednom molekulu enzima u 1 minuti ili 1 sekundi. Na primjer: za ureazu, koja ubrzava hidrolizu ureje, molarna aktivnost je 30.000, za tripsin - 102, za glukozu oksidazu - 17.000 ciklusa u sekundi.

Enzimska svojstva

4.1. Mehanizam djelovanja. Enzimi ne pomjeraju ravnotežu kataliziranih reakcija prema stvaranju proizvoda, tako da konstanta ravnoteže reakcije ostaje konstantna. Kao i svi katalizatori, enzimi samo smanjuju vrijeme potrebno za postizanje ove ravnoteže. U većini slučajeva enzimi ubrzavaju reakcije za 10 7 - 10 14 puta. Efikasnost enzimske katalize zasniva se na snažnom smanjenju energije aktivacije reakcije usled transformacije supstrata u proizvod kroz prelazna stanja.

4.2. Specifičnost djelovanja. Specifičnost vezivanja za supstrat i putevi enzimske reakcije određuju apoenzim. Specifičnost djelovanja enzima određuje usmjereni metabolizam u tijelu.

Za enzime se kaže da ih imaju uska specifičnost supstrata ako djeluju na vrlo mali raspon supstrata. Ponekad možete razgovarati o tome apsolutna specifičnost supstrata, na primjer, katalaza katalizira samo jednu reakciju - razgradnju vodikovog peroksida:

Za većinu enzima, relativna (široka, grupna) specifičnost supstrata kada kataliziraju grupu sličnih reakcija. Na primjer, alkohol dehidrogenaza katalizira konverziju alkohola u aldehide, a metanol, etanol, propanol i drugi alkoholi mogu djelovati kao supstrati. Zanimljivo je da alkohol dehidrogenaza može oksidirati i nelinearne alkohole, kao i grupu alkohola koja je dio složenih molekula, a posebno ovaj enzim može katalizirati konverziju retinola u retinal. Naravno, enzimi obdareni širokom specifičnošću supstrata kataliziraju transformacije supstrata s različitom efikasnošću.

Enzimi su takođe obdareni stereohemijska specifičnost: njihovo aktivno mjesto prepoznaje molekule supstrata po njihovoj prostornoj konfiguraciji. Na primjer, L-aminokiselinske oksidaze aktivne su samo na L-aminokiseline i nemaju apsolutno nikakav učinak na njihove D-analoge. Za oksidativnu deaminaciju D-aminokiselina u živim organizmima postoje D-aminokiselinske oksidaze koje ne djeluju na L-aminokiseline. Sposobnost aktivnog mjesta da se veže za određene stereoizomere supstrata je u osnovi funkcioniranja takvih enzima kao što su racemaze, koje pretvaraju jedan stereoizomer u drugi.

Specifičnost puteva transformacije je da se jedan supstrat pod dejstvom različitih enzima može pretvoriti u proizvode koji se razlikuju po strukturi i ulozi u metabolizmu.

Evo primjera: L-aminokiselinske oksidaze djeluju na L-amino kiseline, pretvarajući ih u alfa-keto kiseline sa stvaranjem amonijaka i vodikovog peroksida.

L-aminokiselinske dekarboksilaze vežu se na iste supstrate, ali kataliziraju različite reakcije: dekarboksilaciju sa stvaranjem biogenih amina i oslobađanjem ugljičnog dioksida.

Drugi primjer je mogućnost pretvaranja glukoza-6 fosfata pod djelovanjem različitih enzima, duž jednog od mogućih metaboličkih puteva:

4.3. Termolabilnost .

Kao i mnogi proteini, enzimi podliježu termalnoj denaturaciji s povećanjem temperature, što dovodi do narušavanja prirodne konformacije enzima i promjene strukture aktivnog centra. Enzimi sisara počinju primjetno denaturirati na temperaturama iznad 40°C.

U vezi sa navedenim, poželjno je čuvati enzimske preparate na niskim temperaturama. Jedan od najboljih načina za očuvanje enzima je njihova liofilizacija (sušena na temperaturama ispod -70°C u vakuumu), djelimična denaturacija amonijum soli i stavljanje u frižider.

4.4. Ovisnost brzine reakcije o temperaturi. Brzina enzimskih reakcija, kao i svake kemijske reakcije, ovisi o temperaturi. Kada temperatura poraste za 10 o C, brzina reakcije se povećava za 2-4 puta prema van't Hoffovom pravilu. Međutim, na temperaturama iznad 40°C denaturacija enzima postaje značajna, što dovodi do smanjenja ukupne aktivnosti (slika 2):

Rice. 2. Ovisnost brzine enzimske reakcije o temperaturi.

4.5. Ovisnost brzine reakcije o pH. Zavisnost brzine enzimske reakcije o pH ima zvonolik oblik (slika 3). pH vrijednosti pri kojima se opaža najveća brzina enzimske reakcije nazivaju se optimalnim (pH-optimumom). Priroda krivulja i vrijednost pH optimuma zavise od prirode nabijenih grupa supstrata i nabijenih grupa enzima (posebno onih koje su uključene u aktivni centar). Optimum pH za većinu enzima je u rasponu od 6,0 do 8,0 (slika 3).

Rice. 3. Ovisnost brzine enzimske reakcije o pH.

Međutim, postoje izuzeci, na primjer, pepsin je najaktivniji pri pH 1,5 - 2,0, a alkalna fosfataza pri pH 10,0 - 10,5 (slika 4)

Rice. 4. Zavisnosti brzine enzimske reakcije (v) o pH podloge.

Pri ekstremnim (vrlo niskim ili vrlo visokim) pH vrijednostima, tercijarna struktura molekula enzima je poremećena, što dovodi do gubitka enzimske aktivnosti.

Slične informacije.

Koncept aktivnosti enzima

U svakodnevnoj biohemijskoj praksi praktično se ne procjenjuje količina enzima, već samo njegova aktivnost. Aktivnost je širi pojam od kvantiteta. Podrazumijeva prvenstveno rezultat reakcije, odnosno gubitak supstrata ili nakupljanje proizvoda. Naravno, ne može se zanemariti vrijeme u kojem je enzim djelovao i broj molekula enzima. Ali kako je obično nerealno izračunati broj molekula enzima, koristi se količina biološkog materijala koji sadrži enzim (volumen ili masa).

Dakle, pri određivanju aktivnosti enzima moraju se istovremeno uzeti u obzir tri varijable:

masa dobijenog proizvoda ili nestalog supstrata;
vrijeme utrošeno na reakciju;
količina enzima, ali zapravo masa ili zapremina biološkog materijala koji sadrži enzim.

Za razumijevanje odnosa između ovih faktora, jasan i jednostavan primjer može biti izgradnja dvije zgrade. Zgrade su izjednačene sa proizvodom reakcije, radnici su enzimi, neka ekipa odgovara zapremini biološkog materijala. Dakle, zadaci iz 3. razreda:

Tim od 10 ljudi je radio na izgradnji jedne zgrade, tim od 5 ljudi je radio na drugoj zgradi iste vrste. Izgradnja je završena istovremeno iu potpunosti. Gdje je veća aktivnost radnika?
Tim od 10 ljudi je radio na izgradnji jedne zgrade od 3 sprata, druge zgrade od 12 spratova - tim od 10 ljudi. Izgradnja je završena istovremeno iu potpunosti. Gdje je veća aktivnost radnika?
Na izgradnji jedne zgrade od 5 spratova radila je ekipa od 10 ljudi, druge iste zgrade - tim od 10 ljudi. Izgradnja prve zgrade trajala je 20 dana, a druga je završena za 10 dana. Gdje je veća aktivnost radnika?

Osnove kvantifikacije aktivnosti enzima

1. Aktivnost enzima se izražava kao brzina akumulacije proizvoda ili brzina gubitka supstrata u smislu količine materijala koji sadrži enzim.

U praksi obično koriste:

jedinice količine supstance - mol (i njeni derivati mmol, µmol), gram (kg, mg),
jedinice vremena - minuta, sat, sekunda,
jedinice mase ili zapremine - gram (kg, mg), litar (ml).

Aktivno se koriste i drugi derivati - katal (mol / s), međunarodna jedinica aktivnosti (IU, jedinica) odgovara μmol / min.

Tako se aktivnost enzima može izraziti, na primjer, u mmol/s×l, g/h×l, IU/l, cat/ml, itd.

Na primjer, poznato je

2. Stvaranje standardnih uslova za upoređivanje rezultata dobijenih u različitim laboratorijama - optimalni pH i fiksna temperatura, na primer 25°C ili 37°C, pridržavanje vremena inkubacije supstrata sa enzimom.

Aktivnost enzima. Ispod aktivnost enzima razumjeti njegovu količinu, koja katalizira transformaciju određene količine supstrata u jedinici vremena. Za izražavanje aktivnosti enzimskih preparata koriste se dvije alternativne jedinice: internacionalna (IU) i katal (mačka). Per međunarodna jedinica aktivnosti količina uzetog enzima je takva da katalizuje konverziju 1 µmol supstrata u proizvod za 1 min pod standardnim uslovima (obično optimalnim). Jedan se kotrljao označava količinu enzima koji katalizuje konverziju 1 mol supstrata u 1 s (1 kat = 6 ∙ 10 7 IU). U bimolekularnoj reakciji A + B = C + D, količina enzimske aktivnosti koja katalizira konverziju 1 µmol A ili B, ili 2 µmol A (ako je B = A) u 1 minuti uzima se kao jedinica enzimske aktivnosti.

Često se enzimski preparati odlikuju specifičnom aktivnošću, koja odražava stepen pročišćavanja enzima. Specifična aktivnost je broj jedinica enzimske aktivnosti po 1 mg proteina.

Molekularna aktivnost (broj obrtaja enzima) je broj molekula supstrata koje konvertuje jedan molekul enzima za 1 minut kada je enzim potpuno zasićen supstratom. Jednaka je broju jedinica enzimske aktivnosti podijeljenom s količinom enzima, izraženom u mikromolima. Koncept molekularne aktivnosti primjenjiv je samo na čiste enzime.

Kada je poznat broj aktivnih centara u molekuli enzima, uvodi se koncept aktivnost katalitičkog mjesta . Karakterizira ga broj molekula supstrata koji prolaze kroz transformaciju za 1 min po jednom aktivnom centru.

Aktivnost enzima snažno zavisi od spoljašnjih uslova, među kojima su temperatura i pH sredine od najveće važnosti. Povećanje temperature u rasponu od 0–50°S obično dovodi do postepenog povećanja enzimske aktivnosti, što je povezano sa ubrzanjem procesa formiranja kompleksa enzim–supstrat i svih kasnijih događaja katalize. Za svakih 10°C porasta temperature, brzina reakcije se približno udvostručuje (van't Hoffovo pravilo). Međutim, dalji porast temperature (>50°C) je praćen povećanjem količine inaktiviranog enzima zbog denaturacije njegovog proteinskog dijela, što se izražava u smanjenju aktivnosti. Svaki enzim je karakteriziran temperaturni optimum– vrijednost temperature na kojoj je zabilježena njegova najveća aktivnost.

Ovisnost aktivnosti enzima o pH vrijednosti podloge je složena. Svaki enzim ima svoj optimalni pH okruženja na kojoj je najaktivniji. Kako se udaljavate od ove vrijednosti u jednom ili drugom smjeru, enzimska aktivnost se smanjuje. To je zbog promjene stanja aktivnog centra enzima (smanjenje ili povećanje ionizacije funkcionalnih grupa), kao i tercijarne strukture cijele proteinske molekule, koja ovisi o omjeru kationskih i anionskih centara. u tome. Većina enzima ima optimalni pH u neutralnom opsegu. Međutim, postoje enzimi koji pokazuju maksimalnu aktivnost pri pH 1,5 (pepsin) ili 9,5 (arginaza). Kada se radi sa enzimima, pH se mora održavati odgovarajućom puferskom otopinom.

Aktivnost enzima je podložna značajnim fluktuacijama u zavisnosti od izloženosti inhibitori(supstance koje djelimično ili potpuno smanjuju aktivnost) i aktivatori(supstance koje povećavaju aktivnost). Njihovu ulogu imaju katjoni metala, neki anioni, nosioci fosfatnih grupa, redukcijski ekvivalenti, specifični proteini, međuprodukti i konačni produkti metabolizma itd.

Principi enzimske kinetike. Suština kinetičkih studija je da se odredi maksimalna brzina enzimske reakcije ( V max) i Michaelisova konstanta K M. Enzimska kinetika proučava stope kvantitativnih transformacija jednih supstanci u druge pod dejstvom enzima. Brzina enzimske reakcije mjeri se gubitkom supstrata ili povećanjem rezultirajućeg proizvoda u jedinici vremena, ili promjenom koncentracije jednog od susjednih oblika koenzima.

Uticaj koncentracija enzima o brzini reakcije izražava se na sljedeći način: ako je koncentracija supstrata konstantna (pod pretpostavkom da je supstrat višak), tada je brzina reakcije proporcionalna koncentraciji enzima. Za kinetičke studije koristi se koncentracija enzima od 10-8 M aktivnih centara. Optimalna vrijednost koncentracije enzima određuje se iz grafa ovisnosti aktivnosti enzima o njegovoj koncentraciji. Smatra se da optimalna vrijednost leži na platou dobivenog grafikona u rasponu vrijednosti aktivnosti enzima koje malo zavise od njegove koncentracije (slika 4.3).

Rice. 4.3. Ovisnost brzine enzimske reakcije

na koncentraciju enzima

Proučiti uticaj koncentracija supstrata na brzinu enzimske reakcije, prvo izgradite kinetičku krivulju koja odražava promjenu koncentracije supstrata (S 1) ili proizvoda (P 1) tokom vremena (slika 4.4) i izmjerite početnu brzinu ( V 1) reakcije kao tangenta nagiba tangente na krivu u nultoj tački.

Rice. 4.4. Kinetičke krivulje enzimske reakcije

Izgradnjom kinetičkih krivulja za druge koncentracije datog supstrata (S 2 , S 3 , S 4 , itd.) ili proizvoda (P 2 , P 3 , P 4 itd.) i određivanjem početnih brzina ( V 2, V 3 , V 4, itd.) reakcije, izgraditi graf zavisnosti početne brzine enzimske reakcije od koncentracije supstrata (pri konstantnoj koncentraciji enzima), koji ima oblik hiperbole (Sl. 4.5. ).

Rice. 4.5. Ovisnost početne brzine enzimske reakcije

od koncentracije supstrata

Kinetika mnogih enzimskih reakcija opisana je Michaelis-Menten jednačinom. Pri konstantnoj koncentraciji enzima i niske koncentracije supstrata[S] Početna brzina reakcije je direktno proporcionalna [S] (slika 4.5). U ovom slučaju govorimo o poluzasićenosti enzima supstratom, kada je polovina molekula enzima u obliku kompleksa enzim-supstrat i brzina reakcije V = 1/2V max. U odnosu na supstrat, reakcija ima 1. red (brzina reakcije je direktno proporcionalna koncentraciji jednog reaktanta) ili 2. red (brzina reakcije je proporcionalna proizvodu koncentracija dva reaktanata).

At visoke vrijednosti koncentracija supstrata[S] brzina reakcije je skoro nezavisna od [S]: sa daljim povećanjem [S], brzina reakcije raste sporije i na kraju postaje konstantna (maksimalna) (slika 4.5). U ovom slučaju postiže se potpuna zasićenost enzima supstratom, kada su svi molekuli enzima u obliku kompleksa enzim-supstrat i V = V max. S obzirom na supstrat, reakcija ima 0. red (brzina reakcije ne ovisi o koncentraciji reaktanata).

Godine 1913. L. Michaelis i M. Menten su predložili jednostavan model za objašnjenje takve kinetike. Prema ovom modelu, formiranje specifičnog kompleksa enzim-supstrat je neophodan međukorak u katalizi.

k 1 k 3

E + S ⇄ ES → E + P

Enzim E se kombinuje sa supstratom S i formira ES kompleks. Konstanta brzine ovog procesa k jedan . Sudbina ES kompleksa je dvostruka: može se ili disocirati na enzim E i supstrat S sa konstantom brzine k 2, ili podvrgnuti daljnjoj transformaciji, formirajući proizvod P i slobodni enzim E, sa konstantom brzine k 3 . Pretpostavlja se da se proizvod reakcije ne pretvara u originalni supstrat. Ovo stanje se opaža u početnoj fazi reakcije, dok je koncentracija proizvoda niska.

Brzina katalize se određuje u stacionarni uslovi, kada koncentracija međuproizvoda ostaje konstantna, dok se koncentracija polaznih materijala i finalnih proizvoda mijenja. Ovo se dešava kada je brzina formiranja ES kompleksa jednaka brzini njegovog raspada.

Možete uvesti novu konstantu K M - Michaelisova konstanta(mol/l), što je jednako

Michaelis–Menten jednačina, koji izražava kvantitativni odnos između brzine enzimske reakcije i koncentracije supstrata, ima oblik

(4.2)

Ova jednadžba odgovara dijagramu brzine reakcije u odnosu na koncentraciju supstrata. At niske koncentracije supstrata kada je [S] mnogo niže od K M, V = V max [S] / K M, tj. brzina reakcije je direktno proporcionalna koncentraciji supstrata. At visoke koncentracije supstrata kada je [S] mnogo veći od K M, V = V max , tj. brzina reakcije je maksimalna i ne ovisi o koncentraciji supstrata.

Ako je [S] = K M, onda V = V max /2.

Dakle, K M jednak koncentraciji supstrata pri kojoj je brzina reakcije polovina maksimuma.

Michaelisova konstanta (KM) i maksimalna brzina reakcije ( V max) su važne karakteristike brzine pri različitim koncentracijama supstrata. V max je konstantna vrijednost za svaki enzim, što omogućava procjenu efikasnosti njegovog djelovanja.

Michaelisova konstanta pokazuje afinitet supstrata za enzim (u slučaju kada k 2 >> k 3): što je niži KM, veći je afinitet i veća je brzina reakcije, i obrnuto. Svaki supstrat karakterizira njegova KM vrijednost za dati enzim, a njihove vrijednosti se mogu koristiti za procjenu specifičnosti supstrata enzima. Michaelisova konstanta zavisi od prirode supstrata, temperature, pH, jonske snage rastvora i prisustva inhibitora.

Zbog činjenice da je definicija V max i K M direktno iz grafičke zavisnosti Michaelis - Menten (slika 4.5) je dvosmislen, pribjegavaju linearizaciji ove jednačine. Da bi se to postiglo, pretvara se u takav oblik da se grafički prikazuje kao prava linija. Postoji nekoliko metoda linearizacije, među kojima se najčešće koriste metode Lineweaver-Burk i Edie-Hofstee.

transformacija Lineweaver-Burke ima oblik

(4.3)

Napravite graf zavisnosti 1/ V = f(1/[S]) i dobijemo pravu liniju čiji presek sa y-osom daje vrednost 1/ V max ; segment odsečen pravom linijom na osi apscise daje vrednost −1 / K M, a tangenta ugla nagiba prave na osu apscise je K M / V max (slika 4.6). Ovaj grafikon vam omogućava da preciznije odredite V max. Kao što ćemo vidjeti u nastavku, vrijedne informacije u vezi sa inhibicijom aktivnosti enzima također se mogu izvući iz ovog grafikona.

Rice. 4.6. Metoda za linearizaciju Michaelis–Menten jednačine

(prema Lineweaver-Burkeu)

Metoda Edie – Hofsty se zasniva na transformaciji Michaelis–Menten jednadžbe množenjem obje strane sa V max:

(4.4)

Grafikon u koordinatama V i V/[S] je prava linija, čiji presek sa y-osom daje vrednost V max, a segment odsječen pravom linijom na osi apscise je vrijednost V max / K M (sl. 4.7). To olakšava određivanje K M i V max , kao i detektovati moguća odstupanja od linearnosti koja nisu otkrivena u prethodnom grafikonu.

Rice. 4.7. Metoda za linearizaciju Michaelis–Menten jednačine

(prema Edie-Hofsty)

Inhibicija aktivnosti enzima. Djelovanje enzima može biti potpuno ili djelomično potisnuto određenim hemikalijama - inhibitori . Po prirodi svog djelovanja, inhibitori se dijele na reverzibilne i ireverzibilne. Ova podjela se zasniva na snazi vezivanja inhibitora za enzim.

Reverzibilni inhibitori - To su jedinjenja koja nekovalentno deluju sa enzimom i kada se uklone, aktivnost enzima se obnavlja. Reverzibilna inhibicija može biti kompetitivna, nekonkurentna i nekonkurentna.

Primjer konkurentska inhibicija je djelovanje strukturnih analoga supstrata, koji se mogu vezati za aktivno mjesto enzima na sličan način kao i supstrat, ali bez pretvaranja u produkt i sprječavanja interakcije enzima sa pravim supstratom, tj. postoji konkurencija između supstrata i inhibitora za vezivanje za aktivno mesto enzima. Kao rezultat formiranja kompleksa enzim-inhibitor (EI), koncentracija ES-kompleksa se smanjuje i kao rezultat toga smanjuje se brzina reakcije. Drugim riječima, kompetitivni inhibitor smanjuje brzinu katalize smanjenjem udjela molekula enzima koji vezuju supstrat.

Mjerenje brzina reakcije pri različitim koncentracijama supstrata omogućava razlikovanje kompetitivne inhibicije od nekompetitivne inhibicije. Sa kompetitivnom inhibicijom na grafu zavisnosti 1/ V=f(1/[S]) linije sijeku y-osu u jednoj tački 1/ V max bez obzira na prisustvo inhibitora, ali u prisustvu inhibitora raste tangenta nagiba prave linije na osu apscise, tj. V max se ne mijenja, dok se KM povećava, što ukazuje na smanjenje afiniteta supstrata za enzim u prisustvu inhibitora (slika 4.8). Stoga, pri dovoljno visokoj koncentraciji supstrata u uslovima konkurencije za aktivno mesto enzima, kada supstrat istisne inhibitor sa aktivnog mesta, inhibicija se može eliminisati i stopa katalizovane reakcije se vraća. U ovom slučaju, Michaelis − Mentenova jednačina ima oblik

(4.5)

gdje je [I] koncentracija inhibitora; K i je konstanta inhibicije.

Konstanta inhibicije karakterizira afinitet enzima prema inhibitoru i konstanta je disocijacije EI kompleksa:

(4.6)

U prisustvu kompetitivnog inhibitora, nagib prave linije prema x-osi se povećava za (1 + [I]/ K i).

Rice. 4.8. Kompetitivna inhibicija:

a - šema; b - grafički izraz prema Lineweaveru - Burkeu

At nekonkurentna inhibicija inhibitor se po strukturi razlikuje od supstrata i ne vezuje se za aktivno, već za alosterično mjesto enzima. To dovodi do promjene konformacije aktivnog mjesta enzima, što je praćeno smanjenjem katalitičke aktivnosti enzima. Štaviše, inhibitor se može vezati ne samo za slobodni enzim (E + I → EI), već i za kompleks enzim-supstrat (ES + I → ESI). Oba oblika EI i ESI nisu aktivni. Supstrat i inhibitor mogu biti istovremeno vezani molekulom enzima, ali se njihova mjesta vezivanja ne preklapaju. Djelovanje nekompetitivnog inhibitora je da smanji broj enzimskih obrtaja, a ne da smanji udio molekula enzima vezanih za supstrat. Inhibitor ne sprečava stvaranje ES kompleksa, ali inhibira konverziju supstrata u proizvod. Time V max se smanjuje, tj. u prisustvu inhibitora, presek prave linije sa y-osom će se desiti u višoj tački (slika 4.9). U istoj mjeri, tangenta ugla nagiba prave linije prema osi apscise, jednaka je K M / V max I . K M za razliku od V max se ne mijenja, tako da se nekonkurentna inhibicija ne može eliminirati povećanjem koncentracije supstrata.

Rice. 4.9. Nekonkurentna inhibicija:

a - šema; b - grafički izraz prema Lineweaveru - Burkeu

Maksimalna brzina reakcije V max I u prisustvu nekompetitivnog inhibitora opisan je jednadžbom

(4.7)

U konkretnom slučaju nekonkurentna inhibicija, kada se inhibitor veže samo za ES-kompleks, a ne vezuje se za slobodni enzim, na grafu zavisnosti 1/ V = f(1/[S]) prave su paralelne jedna s drugom i sijeku os ordinate i apscise u različitim tačkama (slika 4.10).

Rice. 4.10. Nekonkurentna inhibicija:

a - šema; b - grafički izraz prema Lineweaveru - Burkeu

ireverzibilni inhibitori - to su visoko reaktivna jedinjenja različite hemijske prirode, koja mogu stupiti u interakciju sa funkcionalno važnim grupama aktivnog centra, formirajući jake kovalentne veze. To dovodi do nepovratnog gubitka aktivnosti enzima. U tom smislu, Michaelis-Menten teorija, zasnovana na pretpostavci da je vezivanje inhibitora za enzim reverzibilno, u ovom slučaju nije primjenjiva.

Primjer ireverzibilne inhibicije je interakcija enzima s ionima teških metala, koji su vezani za sulfhidrilne grupe cisteinskih ostataka enzima i formiraju merkaptide, koji su praktički nedisocirajuća jedinjenja, ili kovalentna modifikacija enzima pod djelovanje alkilirajućih agenasa.

(aktivatori - povećanje, inhibitori - smanjenje) Proteinski enzimi se sintetiziraju na ribosomima, a RNK - u jezgri.

Izrazi "enzim" i "enzim" dugo se koriste kao sinonimi (prvi se uglavnom nalazi u ruskoj i njemačkoj naučnoj literaturi, drugi - u engleskoj i francuskoj).
Nauka o enzimima se zove enzimologija, a ne fermentologija (da se ne miješaju korijeni riječi latinskog i grčkog).

Istorija studija

Termin enzim koji je u 17. veku predložio hemičar van Helmont kada je raspravljao o mehanizmima varenja.

U kon. XVIII - rano. 19. vek već se znalo da se meso vari želudačnim sokom, a škrob se djelovanjem pljuvačke pretvara u šećer. Međutim, mehanizam ovih pojava bio je nepoznat.

Enzimi se široko koriste u nacionalnoj privredi - prehrambenoj, tekstilnoj industriji, u farmakologiji.

Klasifikacija enzima

Prema vrsti kataliziranih reakcija, enzimi se dijele u 6 klasa prema hijerarhijskoj klasifikaciji enzima (KF, - Enzyme Comission code). Klasifikaciju je predložila Međunarodna unija za biohemiju i molekularnu biologiju (International Union of Biochemistry and Molecular Biology). Svaka klasa sadrži podklase, tako da je enzim opisan skupom od četiri broja odvojena tačkama. Na primjer, pepsin ima naziv EC 3.4.23.1. Prvi broj otprilike opisuje mehanizam reakcije koju katalizira enzim:

CF 1: Oksidoreduktaza koji katalizuju oksidaciju ili redukciju. Primjer: katalaza, alkohol dehidrogenaza
CF 2: Transferaze koji katalizuju transfer hemijskih grupa sa jednog supstratnog molekula na drugi. Među transferazama posebno se izdvajaju kinaze, koje prenose fosfatnu grupu, u pravilu, iz molekule ATP.
CF 3: Hidrolaze koji katalizuju hidrolizu hemijskih veza. Primjer: esteraze, pepsin, tripsin, amilaza, lipoprotein lipaza
CF 4: Liase, katalizujući razbijanje hemijskih veza bez hidrolize sa stvaranjem dvostruke veze u jednom od proizvoda.
CF 5: Izomeraze, koji kataliziraju strukturne ili geometrijske promjene u molekuli supstrata.
CF 6: Ligaze, katalizujući stvaranje hemijskih veza između supstrata zbog hidrolize ATP-a. Primjer: DNK polimeraza

Kinetičko istraživanje

Kriva zasićenja kemijske reakcije koja ilustrira odnos između koncentracije supstrata [S] i brzine reakcije v

Najjednostavniji opis kinetike jednosupstratnih enzimskih reakcija je Michaelis-Menten jednačina (vidi sliku). Do danas je opisano nekoliko mehanizama djelovanja enzima. Na primjer, djelovanje mnogih enzima opisano je shemom "ping-pong" mehanizma.

Struktura i mehanizam djelovanja enzima

Aktivnost enzima određena je njihovom trodimenzionalnom strukturom.

Kao i svi proteini, enzimi se sintetiziraju kao linearni lanac aminokiselina koji se savija na specifičan način. Svaka sekvenca aminokiselina se savija na specifičan način, a rezultirajući molekul (proteinska globula) ima jedinstvena svojstva. Nekoliko proteinskih lanaca može se kombinovati u proteinski kompleks. Tercijarna struktura proteina se uništava kada se zagrije ili izloži određenim kemikalijama.

Da bi katalizirao reakciju, enzim se mora vezati za jedan ili više supstrata. Proteinski lanac enzima je presavijen na takav način da se na površini globule formira praznina, odnosno udubljenje, gdje se supstrati vezuju. Ovo područje se naziva mjesto vezivanja supstrata. Obično se podudara s aktivnim mjestom enzima ili se nalazi blizu njega. Neki enzimi također sadrže vezna mjesta za kofaktore ili ione metala.

Neki enzimi imaju mjesta vezanja malih molekula i mogu biti supstrati ili produkti metaboličkog puta u koji enzim ulazi. Oni smanjuju ili povećavaju aktivnost enzima, što stvara priliku za povratnu informaciju.

Aktivni centri nekih enzima karakteriziraju se fenomenom kooperativnosti.

Specifičnost

Enzimi obično pokazuju visoku specifičnost za svoje supstrate. Ovo se postiže djelomičnom komplementarnošću oblika, raspodjele naboja i hidrofobnih područja na molekulu supstrata i na mjestu vezivanja supstrata na enzimu. Enzimi pokazuju visok nivo stereospecifičnosti, regioselektivnosti i hemoselektivnosti.

Model sa ključem

Koshlandova indukovana pretpostavka o uklapanju

Realnija situacija je u slučaju indukovanog podudaranja. Neispravne podloge - prevelike ili premale - ne odgovaraju aktivnom mjestu

Emil Fischer je 1890. godine sugerirao da je specifičnost enzima određena tačnom korespondencijom između oblika enzima i supstrata. Ova pretpostavka se naziva model brave i ključa. Enzim se vezuje za supstrat i formira kratkotrajni kompleks enzim-supstrat. Međutim, iako ovaj model objašnjava visoku specifičnost enzima, on ne objašnjava fenomen stabilizacije prelaznog stanja koji se uočava u praksi.

Model indukovanog uklapanja

Godine 1958. Daniel Koshland je predložio modifikaciju modela brave sa ključem. Enzimi općenito nisu kruti, već fleksibilni molekuli. Aktivno mjesto enzima može promijeniti konformaciju nakon vezivanja supstrata. Bočne grupe aminokiselina aktivnog mjesta zauzimaju položaj koji omogućava enzimu da izvrši svoju katalitičku funkciju. U nekim slučajevima, molekul supstrata također mijenja konformaciju nakon vezivanja za aktivno mjesto. Za razliku od modela zaključavanja ključa, model induciranog uklapanja objašnjava ne samo specifičnost enzima, već i stabilizaciju prijelaznog stanja.

Modifikacije

Mnogi enzimi prolaze kroz modifikacije nakon sinteze proteinskog lanca, bez kojih enzim ne pokazuje svoju aktivnost u punoj mjeri. Takve modifikacije se nazivaju posttranslacijske modifikacije (obrada). Jedan od najčešćih tipova modifikacije je dodavanje hemijskih grupa bočnim ostacima polipeptidnog lanca. Na primjer, dodavanje ostatka fosforne kiseline naziva se fosforilacija i katalizira ga enzim kinaza. Mnogi eukariotski enzimi su glikozilirani, tj. modificirani oligomerima ugljikohidrata.

Još jedan uobičajeni tip post-translacijskih modifikacija je cijepanje polipeptidnog lanca. Na primjer, himotripsin (proteaza uključena u probavu) se dobiva cijepanjem polipeptidne regije od kimotripsinogena. Kimotripsinogen je neaktivni prekursor kimotripsina i sintetizira se u pankreasu. Neaktivni oblik se transportuje u želudac gdje se pretvara u himotripsin. Ovaj mehanizam je neophodan kako bi se izbjeglo cijepanje pankreasa i drugih tkiva prije nego što enzim uđe u želudac. Neaktivni prekursor enzima se također naziva "zimogen".

Enzimski kofaktori

Neki enzimi obavljaju katalitičku funkciju sami, bez ikakvih dodatnih komponenti. Međutim, postoje enzimi koji zahtijevaju ne-proteinske komponente za katalizu. Kofaktori mogu biti ili neorganske molekule (joni metala, klasteri željezo-sumpor, itd.) ili organski (npr.

1. Osobine enzimskih reakcija

2. Utjecaj temperature na aktivnost enzima

3. Utjecaj pH na aktivnost enzima

4. Enzimski aktivatori i inhibitori

I. Sve enzimske reakcije imaju 4 karakteristike

· Visoka aktivnost enzima;

Reverzibilnost djelovanja enzima;

Specifičnost djelovanja enzima;

labilnost (osjetljivost).

Visoka aktivnost enzima. Enzimi uzrokuju visoku brzinu enzimske reakcije, koju karakterizira broj enzimskih obrtaja - to je broj molekula supstrata koji se pretvaraju u produkte reakcije pod djelovanjem jedne molekule enzima u jedinici vremena. Na primjer, alkohol dehidrogenaza ima aktivnost od 4700 jedinica, fosforilaza - 50000 jedinica, a-amilaza - 16000 jedinica.

Reverzibilnost djelovanja enzima osnovao Danilevski. Pod reverzibilnošću djelovanja enzima podrazumijeva se formiranje ES kompleksa i njegovo raspadanje, tj. reakcije koje uključuju enzim mogu ići u jednom smjeru (biosinteza) i u suprotnom smjeru (raspad).

Specifičnost djelovanja enzima- svaki enzim djeluje samo na svoj specifični supstrat ili grupu srodnih supstrata. Na primjer, invertaza djeluje na saharozu; a-amilaza - samo na škrobu i dekstrinima; proteaze u proteine.

Postoje dvije tačke gledišta koje objašnjavaju specifičnost djelovanja enzima. Prema figurativnoj zamisli E. Fishera, "enzim se približava supstratu kao ključ brave", tj. topografija aktivnog centra enzima nije samo visoko uređena, već i kruto fiksirana. Aktivno mjesto enzima odgovara topografiji samo jednog supstrata. Druga tačka gledišta, koju je predložio D. Koshland, je teorija indukovane konformacije enzima i supstrata: konformacija enzima, posebno njegovog aktivnog centra, sposobna je za određene modifikacije. Ovisno o konformacijskoj mobilnosti aktivnog mjesta, enzim je u stanju da stupi u interakciju sa nekoliko ili sa velikim brojem supstrata. Drugim riječima, u trenutku formiranja ES kompleksa dolazi do promjena u strukturi i enzima i supstrata. Kao rezultat toga, prilagođavaju se jedni drugima.

Specifičnost enzima igra važnu ulogu u procesu metabolizma u živom organizmu. (Da enzim nema jedinstvena svojstva, onda ne bi bilo metabolizma u živom organizmu)

Na osnovu specifičnosti enzimi se dijele u 2 grupe:

Apsolutna specifičnost - enzim djeluje samo na jednu tvar ili katalizira samo određenu transformaciju ove tvari;

Relativna ili grupna specifičnost – enzimi djeluju istovremeno na mnoge supstrate koji imaju niz zajedničkih strukturnih svojstava.

Labilnost (osjetljivost) - svi enzimi su osjetljivi na povišene temperature i niske pH vrijednosti, pri čemu dolazi do gubitka aktivnosti enzima.

II. Najvažniji faktor od kojeg zavisi aktivnost enzima je temperatura.

Grafički, ovisnost brzine enzimske reakcije od temperature je sljedeća:

Na 0°C, a još više na temperaturama ispod 0°C, djelovanje većine enzima prestaje. Povećanje temperature (kriva 1) iznad 0°C potiče povećanje aktivnosti enzima (povećava se broj sudara reaktanata). Na određenoj temperaturi enzim pokazuje maksimalnu aktivnost. Za većinu enzima optimalna temperatura djelovanja je 40-50°C. Dalje povećanje temperature dovodi do inaktivacije enzima (smanjenje aktivnosti) zbog termičke denaturacije proteinskog molekula (kriva 2).

Promjena brzine reakcije s povećanjem temperature za svakih 10°C izražava se temperaturnim koeficijentom Q 10 . Temperaturni koeficijent je omjer brzine reakcije na datoj temperaturi v t +10 i brzine reakcije na temperaturi 10 °C ispod date:

Vrijednost Q 10 za hemijske reakcije je u granicama 2-4, za enzimsku reakciju - između 1 i 2; Q 10 enzimske reakcije značajno opadaju s povećanjem temperature.

III. Svaki enzim ispoljava svoju aktivnost unutar prilično uskog pH raspona. Grafička zavisnost aktivnosti enzima od pH je sljedeća:

U kiseloj sredini, pri niskim pH vrednostima, ima oblik EH 2 + , u ovom obliku je neaktivan. Pri optimalnom pH, enzim ima maksimalnu aktivnost i nalazi se u obliku EH; kada je medij alkaliziran, enzim poprima oblik E - .

Optimalna aktivnost odgovara određenom pH rasponu, a svaki enzim ima svoju optimalnu pH vrijednost djelovanja (npr. bakterijska a-amilaza ima optimalni pH 6, a a-amilaza mikroskopskih gljiva je 4,7). Optimalna pH vrijednost povezana je sa sastavom aminokiselina enzima.

Zvonasti oblik krivulje će se objasniti amfoternom prirodom enzima; uzlazne i silazne grane ove krivulje su tipične krivulje titracije i određene su pK vrijednostima jonskih grupa koje se nalaze na aktivnom mjestu enzima.

Za određivanje funkcionalnih grupa uključenih u aktivni centar enzima, potrebno je utvrditi ovisnost aktivnosti ovog enzima o pH na različitim temperaturama i odrediti pK vrijednost. Poznavajući vrijednosti ΔrK za kisele i alkalne grane zavisnosti v = f(pH), nalaze se funkcionalne grupe koje odgovaraju ovoj vrijednosti.

IV. Sve supstance koje prate enzim tokom reakcije mogu se podeliti na aktivatore, inhibitore i neutralna jedinjenja.

Aktivatori- hemijski spojevi koji pojačavaju djelovanje enzima (na primjer, glutation aktivira djelovanje proteaza, NaCl povećava aktivnost amilaze); inhibitori- jedinjenja koja inhibiraju njihovu aktivnost (na primjer, -CN grupa inhibira aktivnost respiratornih enzima koji se nalaze u sistemu citokroma) i neutralna jedinjenja nemaju uticaja na enzime.

Proces inhibicije može biti reverzibilan i nepovratan.

Reverzibilni inhibitori su:

Kompetitivno djelovanje - inhibitor stupa u interakciju s funkcionalnim grupama aktivnog centra enzima. Inhibicija u ovom slučaju zavisi od koncentracije supstrata: ako je [S] veliko, onda se efekat inhibitora [I] možda neće pojaviti; ako je [S] mali, tada inhibitor može istisnuti supstrat iz veze sa enzimom, čije djelovanje se tada inhibira. Trostruki ESI kompleks se nikada ne formira tokom kompetitivne inhibicije.

· Nekonkurentna inhibicija se opaža kada inhibitor nije u stanju da se veže za enzim, ne može se vezati za kompleks enzim-supstrat, pretvarajući ga u neaktivan oblik.

· Kod mešovite inhibicije, inhibitor deluje i na ES mesto vezivanja i na katalitičko mesto enzima.