مراحل عزل الثقافة النقية للميكروبيولوجيا الهوائية. فسيولوجيا الكائنات الحية الدقيقة: الخصائص الثقافية للبكتيريا ، وعزل الثقافات النقية للكائنات الحية الدقيقة

تعتمد زراعة الكائنات الحية الدقيقة ، بالإضافة إلى تكوين الوسط الغذائي ، على العوامل الفيزيائية والكيميائية (درجة الحرارة ، الحموضة ، التهوية ، الضوء ، إلخ). في الوقت نفسه ، فإن المؤشرات الكمية لكل منها ليست هي نفسها ويتم تحديدها من خلال خصائص التمثيل الغذائي لكل مجموعة من البكتيريا. هناك طرق لزراعة الكائنات الحية الدقيقة على وسائط المغذيات الصلبة والسائلة في الظروف الهوائية واللاهوائية وغيرها.

طرق عزل المزارع النقية من الكائنات الحية الدقيقة الهوائية. من أجل الحصول على مستعمرات معزولة ، أثناء التطبيق ، يتم توزيع المادة بحيث يتم فصل الخلايا البكتيرية عن بعضها البعض. للحصول على ثقافة نقية ، يتم استخدام مجموعتين رئيسيتين من الأساليب:

أ) الطرق القائمة على مبدأ الفصل الميكانيكي للكائنات الحية الدقيقة ؛

ب) طرق تعتمد على الخصائص البيولوجية للكائنات الحية الدقيقة.

طرق تعتمد على مبدأ الفصل الميكانيكي للكائنات الحية الدقيقة

الغربلة بملعقة حسب درايجالسكي. خذ 3 أطباق بتري متوسطة المغذيات. يتم وضع قطرة من مادة الاختبار على الطبق الأول باستخدام حلقة أو ماصة ويفرك بملعقة على كامل سطح أجار المغذيات. ثم يتم نقل الملعقة إلى الكوب الثاني ويفرك المزرعة المتبقية على الملعقة في سطح وسط المغذيات. بعد ذلك ، يتم نقل الملعقة إلى الكوب الثالث ويتم تلقيحها بنفس الطريقة. في الكوب الأول ، ينمو الحد الأقصى لعدد المستعمرات ، في اليوم الثالث - الحد الأدنى. اعتمادًا على محتوى الخلايا الميكروبية في مادة الاختبار ، تنمو مستعمرات منفصلة على أحد الأطباق ، وهي مناسبة لعزل ثقافة نقية للكائنات الحية الدقيقة.

طريقة باستير (طريقة التخفيف).يتم تحضير عدد من التخفيفات التسلسلية ، غالبًا عشرة أضعاف ، من مادة الاختبار في وسط معقم سائل أو محلول ملحي في أنابيب الاختبار. بعد ذلك ، تزرع المادة بحشيش ، 0.5 مل من كل أنبوب. من المفترض أنه في بعض أنابيب الاختبار سيبقى عدد الكائنات الحية الدقيقة التي يمكن حسابها عند زرعها على وسط لوحة. تتيح هذه الطريقة حساب عدد الميكروبات في مادة الاختبار. (العدد الميكروبي هو عدد المستعمرات الموجودة على اللوح الأخير مع نمو الكائنات الحية الدقيقة ، مضروبة في درجة تمييع المادة).

النخل بحلقة (البذر بالسكتات الدماغية).خذ طبق بتري واحد مع أجار المغذيات وقسمه إلى 4 قطاعات ، مع رسم خطوط فاصلة على الجزء الخارجي من قاع الطبق. يتم إدخال المادة قيد الدراسة في القطاع الأول بحلقة ويتم رسم خطوط متوازية معها في جميع أنحاء القطاع على مسافة حوالي 5 مم من بعضها البعض. مع نفس الحلقة ، دون تغيير موضعها بالنسبة للأجار ، يتم رسم نفس الخطوط على قطاعات أخرى من الطبق. في المكان الذي سقط فيه عدد كبير من الخلايا الميكروبية على أجار ، سيكون نمو الكائنات الحية الدقيقة في شكل سكتة دماغية مستمرة. تنمو المستعمرات المنفصلة في قطاعات بها عدد صغير من الخلايا. من الممكن أيضًا صب المحاليل المخففة للثقافة المختلطة على سطح الوسائط الصلبة في الأطباق.

طريقة الترشيح.يعتمد على تمرير مادة الاختبار من خلال مرشحات خاصة ذات قطر مسام معين وفصل الكائنات الحية الدقيقة الموجودة في الحجم. تستخدم هذه الطريقة بشكل أساسي لتنقية الفيروسات من البكتيريا ، وكذلك للحصول على العاثيات والسموم (في المرشح - الملتهمة النقية ، السم المنقى).

طرق تعتمد على الخصائص البيولوجية للكائنات الحية الدقيقة

خلق الظروف المثلى للتكاثر

إنشاء نظام درجة حرارة مثالية للقمع الانتقائي لتكاثر النباتات الدقيقة المصاحبة في درجات حرارة منخفضة وإنتاج مستنبتات من البكتيريا المحبة للنفسية أو المحبة للحرارة. تتطور معظم الميكروبات جيدًا عند 35-37 درجة مئوية ، وتنمو يرسينيا جيدًا عند 22 درجة مئوية ، وتُزرع البريميات عند 30 درجة مئوية. تنمو البكتيريا المحبة للحرارة في درجات حرارة تقع خارج أنظمة درجات الحرارة للأنواع البكتيرية الأخرى المرتبطة بها (على سبيل المثال ، تُزرع العطيفة عند 42 درجة مئوية).
خلق الظروف لممارسة الهوائية أو اللاهوائية. تنمو معظم الكائنات الحية الدقيقة جيدًا في وجود الأكسجين الجوي. تنمو اللاهوائية الملزمة في ظروف تستبعد وجود الأكسجين الجوي (العوامل المسببة للكزاز ، والتسمم الغذائي ، والبكتيريا المشقوقة ، والبكتيريا ، وما إلى ذلك). تنمو الكائنات الدقيقة المحبة للهواء فقط عند محتوى أكسجين منخفض ومحتوى مرتفع من ثاني أكسيد الكربون (كامبيلوباكتر ، هيليكوباكتر).
طريقة التخصيب. يتم تلقيح مادة الاختبار على وسائط مغذية اختيارية تعزز نمو نوع معين من الكائنات الحية الدقيقة.

طرق عزل الثقافات النقية من الكائنات الحية الدقيقة

نظرًا لأن الميكروبات تنمو بشكل منتشر في الوسائط السائلة ، أي يتم توزيعها بسهولة في جميع أنحاء البيئة ، فمن الصعب عزل خلية جرثومية عن أخرى. وبالتالي ، فإن طريقة باستير لا توفر دائمًا ثقافة نقية. لذلك ، في الوقت الحاضر ، تُستخدم هذه الطريقة بشكل أساسي لتقليل تركيز الكائنات الحية الدقيقة في المادة بشكل مبدئي قبل تلقيحها في وسط كثيف للحصول على مستعمرات معزولة.

طرق الفصل الميكانيكي للكائنات الدقيقة باستخدام وسط مغذي كثيف.تتضمن هذه الطرق طريقة Koch وطريقة Drygalsky.

طريقة كوخ (طريقة البذر العميق).

يتم إدخال مادة الاختبار بواسطة حلقة بكتريولوجية أو ماصة باستور في أنبوب اختبار بوسط مغذي كثيف منصهر. حرك محتويات أنبوب الاختبار بالتساوي عن طريق تدويره بين راحتي اليد. يتم نقل قطرة من المادة المخففة إلى أنبوب الاختبار الثاني ، من الثاني إلى الثالث ، وهكذا. تُسكب محتويات كل أنبوب ، بدءًا من الأول ، في أطباق بتري المعقمة. بعد تصلب الوسط في الأكواب ، يتم وضعها في ترموستات للزراعة.

لعزل الكائنات الحية الدقيقة اللاهوائية بطريقة كوخ ، من الضروري الحد من وصول الأكسجين إلى الثقافة.

لهذا الغرض ، يتم ملء سطح البذر العميق في طبق بتري بمزيج معقم من البارافين والفازلين (1: 1). يمكنك أيضًا ترك اللقاح ممزوجًا جيدًا بوسط الأجار مباشرة في أنبوب الاختبار.

في الوقت نفسه ، يتم استبدال السدادة القطنية بسدادة مطاطية أو يُسكب سطح أجار بمزيج من زيت البارافين والفازلين. لاستخراج المستعمرات الناضجة من الكائنات الحية الدقيقة اللاهوائية ، يتم تسخين أنابيب الاختبار قليلاً عن طريق الدوران السريع على لهب الموقد. يذوب الأجار المجاور للجدران وينزلق العمود بسهولة في طبق بتري المحضر. بعد ذلك ، يتم قطع عمود الآجار بمشرط معقم ، وتتم إزالة المستعمرات بحلقة معقمة أو بقطع شعري معقم ونقلها إلى وسط سائل.

طريقة دريغالسكييعتمد على الفصل الميكانيكي للخلايا الميكروبية على سطح وسط غذائي كثيف في أطباق بتري.

تبدأ كل خلية جرثومية ، مثبتة في مكان معين ، في التكاثر ، وتشكيل مستعمرة.

للبذر وفقًا لطريقة Drygalsky ، يتم استخدام العديد من أطباق Petri المملوءة بوسط غذائي كثيف.

يتم وضع قطرة من مادة الاختبار على سطح الوسط.

ثم ، باستخدام ملعقة معقمة ، يتم توزيع هذه القطرة على وسط المغذيات بالكامل (البذر مع العشب).

يمكن أيضًا إجراء البذر عن طريق الخط باستخدام حلقة بكتريولوجية. باستخدام نفس الملعقة أو الحلقة ، يتم إجراء البذر في الثانية والثالثة وما إلى ذلك. كؤوس. كقاعدة عامة ، يظهر النمو الميكروبي على شكل طلاء مستمر في اللوحة الأولى بعد زراعة المحصول ، في اللوحات اللاحقة يتناقص المحتوى الميكروبي وتتشكل مستعمرات معزولة ، يمكن من خلالها عزل الثقافة النقية بسهولة عن طريق الغربلة.

وبالتالي ، يتم الحصول على النمو المستمر في القطاعات الأولى ، وستنمو المستعمرات المعزولة على طول السكتات الدماغية اللاحقة ، والتي هي نسل خلية واحدة.

لحفظ الوسائط والأواني ، يمكنك استخدام طبق واحد ، وتقسيمه إلى قطاعات ، وتلقيحهم بالتتابع بضربة (طريقة نضوب).

للقيام بذلك ، يتم أخذ المادة بحلقة ويتم رسم سلسلة من الضربات المتوازية معها ، أولاً فوق سطح القطاع الأول ، ثم يتم زرع جميع القطاعات الأخرى مع بقاء الخلايا في الحلقة.

مع كل ضربة لاحقة ، يتناقص عدد الخلايا المصنفة.

طريقة عزل المزارع النقية باستخدام المواد الكيميائيةتستخدم في عزل مزارع الكائنات الحية الدقيقة المقاومة لبعض المواد الكيميائية.

على سبيل المثال ، يمكن استخدام هذه الطريقة لعزل مزرعة نقية من المتفطرة السلية المقاومة للأحماض والقلويات والكحول. في هذه الحالة ، تُسكب مادة الاختبار قبل البذر بمحلول حمض 15٪ أو مضاد للفورمين ، وتُحفظ في منظم حرارة لمدة 3-4 ساعات.

بعد التعرض للحمض أو القلوي ، تظل خلايا عصية الحديبة حية ، وتموت جميع الكائنات الحية الدقيقة الأخرى الموجودة في مادة الاختبار. بعد معادلة الحمض أو القلويات ، تزرع المادة المعالجة على وسط صلب ويتم الحصول على مستعمرات معزولة من العامل المسبب لمرض السل.

الطرق البيولوجية لعزل المزارع النقية من الكائنات الحية الدقيقة المسببة للأمراضتستند إلى الإصابة بمواد الاختبار لحيوانات المختبر المعرضة لهذا النوع من العوامل الممرضة.

إذا تم احتواء كائن حي دقيق ممرض في كائن الاختبار ، فإن حيوان المختبر يصبح مريضًا ويموت. بعد تشريح الجثة للحيوان الساقط ، تُزرع الأعضاء الداخلية في وسط خاص ، حيث تنمو ثقافات نقية من الميكروبات المعزولة.

السابق 567891011121314151617181920 التالي

عرض المزيد:

عزل الثقافة البكتيرية النقية

الثقافة النقية هي ثقافة تحتوي على كائنات دقيقة من نفس النوع ويتم الحصول عليها كنسل من خلية واحدة. يمكن الحصول على مزارع نقية من الخلية الميكروبية الأصلية المعزولة باستخدام جهاز معالجة دقيقة ، أو من مستعمرات معزولة عن طريق زرعها في أنابيب اختبار منفصلة باستخدام وسط غذائي.

يتم استخدام الطرق التالية لعزل ثقافة نقية.

1. طريقة Drygalsky.في هذه الطريقة ، يتم سكب وسط المغذيات المنصهرة في 3 أطباق بتري. تضاف قطرة واحدة من مادة الاختبار إلى الكوب الأول وتنتشر على سطح وسط المغذيات باستخدام ملعقة معقمة. ثم يتم نقل الملعقة إلى الكوب الثاني ثم إلى الكوب الثالث ، وفرك المادة المتبقية عليها في سطح وسط المغذيات.

عند الزراعة بهذه الطريقة ، تنمو المستعمرات المعزولة على الصفيحتين الثانية والثالثة. تتم زراعة المستعمرات الفردية الناتجة في أنابيب اختبار باستخدام وسط غذائي للحصول على ثقافة نقية للكائن الدقيق.

2. طريقة الضربات المتوازية.بهذه الطريقة ، تنتشر المادة على سطح الأجار بمساعدة حلقة بكتريولوجية في ضربات متوازية في اتجاه واحد.

بعد ذلك ، قلب الكوب بزاوية 90 درجة ، يتم رسم الضربات في الاتجاه العمودي على الضربات الأولى. باستخدام طريقة البذر هذه ، يتم استهلاك المادة الموجودة في الحلقة تدريجياً ، وتنمو مستعمرات الميكروبات المعزولة على طول خطوط السكتات الدماغية المطبقة في نهاية البذر.

3. طريقة كوخ (طريقة النخل في عمق الوسط).باستخدام هذه الطريقة ، يتم إدخال حلقة بكتريولوجية واحدة من مادة الاختبار في أنبوب اختبار مع أجار ، ويتم صهرها وتبريدها إلى 43-45 درجة مئوية ، ويتم خلطها جيدًا.

بعد ذلك ، يتم نقل حلقة واحدة من المادة من أنبوب الاختبار هذا إلى أنبوب الاختبار الثاني ، ثم منه إلى أنبوب الاختبار الثالث. تُسكب المخففات المحضرة للبكتيريا من أنابيب الاختبار في أطباق بتري المعقمة. بعد تصلب الوسط ، يتم وضع الأكواب في منظم الحرارة. يتناقص عدد المستعمرات في لوحات الاستنبات مع تخفيف المادة.

أسئلة التحكم في موضوع الدرس:

1. طبيعة النمو البكتيري في وسط المغذيات السائلة وشبه السائلة والكثيفة.

توصيف مستعمرات الكائنات الحية الدقيقة.

3. أصباغ البكتيريا ودورها في الكائنات الحية الدقيقة.

4. طرق عزل الثقافات البكتيرية النقية.

الأدب للتحضير للدرس:

الأدب الرئيسي:

1. علم الأحياء الدقيقة الطبية والفيروسات والمناعة. إد. أ.

فوروبيوف. م ، 2004.

أدبيات إضافية:

1. L.B. بوريسوف. علم الأحياء الدقيقة الطبية وعلم الفيروسات وعلم المناعة. م ، 2002.

2. حسنًا. بوزديف. علم الأحياء الدقيقة الطبية.

م ، جيوتار ميديا ، 2005.

3. علم الأحياء الدقيقة الطبية. الدليل. إد. في و. Pokrovsky و O.K. بوزديفا. M. ، GEOTAR-MED ، 1998.

النشاط 5

موضوع الدرس: إنزيمات البكتيريا. دراسة النشاط الأنزيمي للكائنات الدقيقة. التنفس الجرثومي. طرق زراعة وعزل الثقافة اللاهوائية النقية.

هدف التعلم: تعرف على الإنزيمات البكتيرية.

لدراسة طرق تحديد النشاط الأنزيمي للكائنات الحية الدقيقة. تعرف على التنفس البكتيري. لدراسة طرق زراعة وعزل الثقافة اللاهوائية النقية.

أهداف الدرس:

1. تعرف على الإنزيمات البكتيرية.

لدراسة طرق تحديد النشاط الأنزيمي للكائنات الحية الدقيقة.

3. التعرف على عمليات التنفس الجرثومي.

4. دراسة طرق زراعة وعزل ثقافة نقية من اللاهوائية.

الانزيمات البكتيرية

تتم جميع العمليات الكيميائية الحيوية في خلية الكائنات الحية الدقيقة المرتبطة بعملية التمثيل الغذائي والنمو والتكاثر بمشاركة الإنزيمات (الإنزيمات).

يتم تصنيع الإنزيمات بواسطة الخلية الميكروبية نفسها ولها بنية معقدة. هم إما مجرد بروتين ذو وزن جزيئي مرتفع (التربسين ، البيبسين ، إلخ) ، أو يتكون من بروتين (أبوينزيم) مرتبط بعامل مساعد (أنزيم). يمكن أن يكون الإنزيم منخفض الوزن الجزيئي غير عضوي (معدن) أو مادة عضوية.

يعتمد تصنيف الإنزيمات على أنواع التفاعلات التي تحفزها.

تنقسم جميع الإنزيمات إلى ست فئات:

1). أوكسيدوروكتاز- إنزيمات نقل الإلكترون. هذه الإنزيمات تحفز تفاعلات الأكسدة والاختزال. وتشمل هذه نازعات الهيدروجين (NAD ، NADP ، FAD) ، الكاتلاز ، السيتوكرومات.

المحولات- إنزيمات لنقل المجموعات بين الجزيئات من مركب إلى آخر. وتشمل هذه أسيتيل ترانسفيراز ، فسفوتانسفيراز ، أمينوترانسفيراز.

3). هيدروليسات- إنزيمات لنقل المجموعات الوظيفية بمشاركة الماء. تشمل هذه الفئة من الإنزيمات هيدرولازات الببتيد ، الجلوكوزيداز ، الأميليز ، الإستراتز ، الليباز ، الفوسفاتيز.

4). لياس- الإنزيمات التي تنشق أو تضيف مركبات مختلفة برابطة مزدوجة دون مشاركة الماء.

وتشمل هذه الإنزيمات بيروفات ديكاربوكسيلاز والألدولاز.

5). الايزوميراز- الانزيمات التي تنقل المجموعات داخل الجزيئات مع تكوين اشكال ايزومرية. تشمل هذه الإنزيمات أيزوميراز ثلاثي الفوسفات ، أيزوميراز الجلوكوز فوسفات.

Ligases (التركيبات)- إنزيمات تجمع جزيئين مع التكسير المتزامن لروابط الفوسفات باستخدام طاقة ATP. تتضمن Ligases الإنزيمات التي تحفز تخليق المواد العضوية المعقدة من مركبات بسيطة (أسباراجين سينثيتاز ، cocarboxylases).

يتم قياس نشاط الإنزيم بالوحدات الدولية (ME). 1 IU يتوافق مع كمية الإنزيمات التي تحول ميكرومول واحد من الركيزة في دقيقة واحدة في ظل الظروف القياسية.

تنقسم البكتيريا إلى الإنزيمات الداخلية والإنزيمات الخارجية.

الإنزيمات الداخليةداخل الخلية البكتيرية ، تحفز عمليات التمثيل الغذائي داخل الخلايا. الإنزيمات الخارجيةيتم إطلاقها في البيئة الخارجية وتؤدي وظيفة تقسيم العناصر الغذائية المعقدة.

إنزيمات العدوان.البكتيريا المسببة للأمراض لديها مجموعة خاصة من الإنزيمات الخارجية تسمى إنزيمات العدوان. يؤدون وظائف تسهيل تغلغل البكتيريا وانتشارها في أنسجة الجسم المضيف وإضعاف خصائص الحماية.

تشمل إنزيمات العدوان: الهيالورونيداز ، النورامينيداز ، الكولاجيناز ، البروتياز ، الفيبرينوليزين ، الهيموليسين ، الليكوسيدين.

الإنزيمات التأسيسية والمحفزة.تسمى الإنزيمات التي يتم تصنيعها بواسطة خلية بمعدل ثابت ، بغض النظر عن وجود ركيزة في البيئة ، التأسيسي. محرضتتشكل الإنزيمات (التكيفية) فقط في وجود الركيزة المناسبة في البيئة.

على سبيل المثال ، إنزيم بيتا جالاكتوزيدازيبدأ تصنيعه فقط عند إضافة الكربوهيدرات اللاكتوز إلى وسط المغذيات ، والذي يتفككه هذا الإنزيم لتكوين الجلوكوز والجالاكتوز.

طرق تحديد النشاط الأنزيمي للميكروبات

الشرط الإلزامي لتحديد الثقافة النقية المعزولة للبكتيريا هو تحديد النشاط الأنزيمي فيما يتعلق بالكربوهيدرات والبروتينات ("جواز السفر" الكيميائي الحيوي للأنواع).

لتحديد الإنزيمات التي تكسر الكربوهيدرات (الإنزيمات المحللة للسكريات)استخدم وسائط التشخيص التفاضلي لـ Giss.

تحتوي وسائط Hiss على ماء الببتون ، ومؤشر الأس الهيدروجيني ، وطفو لالتقاط الغاز ، وأحد الكربوهيدرات (الجلوكوز ، اللاكتوز ، المالتوز ، المانيتول ، السكروز ، النشا ، إلخ). إذا قامت البكتيريا بتفكيك الكربوهيدرات ، يتشكل حمض ويتغير لون الوسط بسبب مؤشر الأس الهيدروجيني الموجود فيه. معظم البكتيريا المسببة للأمراض تكسر الكربوهيدرات لتشكيل الأحماض فقط ؛ بعض الأنواع تخمر الكربوهيدرات لإنتاج حامض وغاز (CO2).

في هذه الحالة ، يتغير لون الوسيط وتظهر فقاعة غاز في العوامة.

نشاط البكتيريا التحلل للبروتين.مؤشرات الانقسام العميق للبروتين هي تشكيل الإندول والأمونيا وكبريتيد الهيدروجين.لتحديد هذه المواد الغازية ، يتم تلقيح الثقافات النقية للبكتيريا في مرق ببتون اللحم أو ماء الببتون في أنابيب اختبار ذات مؤشرات ورقية خاصة.

في وجود منتجات الانقسام ، يتغير لون المؤشر المقابل.

يتم تحديد نشاط التحلل البروتيني للبكتيريا أيضًا عن طريق تلقيح مستنبت نقي مع حقنة في عمود من الجيلاتين من خلال وجود المادة المخففة وطبيعتها ، على سبيل المثال ، في شكل شجرة عيد الميلاد المقلوبة ، أو الظفر ، أو قمع ، إلخ.

استقلاب الطاقة

هذه مجموعة من التفاعلات الكيميائية الحيوية ، والتي ينتج عنها تكوين (تراكم الطاقة) وتقسيم (استهلاك الطاقة) الروابط الكبيرة في جزيئات ATP.

في البكتيريا ، يمكن تصنيع ATP نتيجة لعمليات التخمير والتنفس.

التخمير.طريقة قديمة وغير فعالة لتوليد الطاقة ، حيث يتم تكوين جزيئين من ATP نتيجة لانهيار جزيء الجلوكوز. المنتجات النهائية للتخمير هي ثاني أكسيد الكربون والماء والكحول والأحماض العضوية.

تتم العملية بدون مشاركة الأكسجين.

عمليه التنفستسمى عملية الفسفرة المؤكسدة للكربوهيدرات بتكوين ATP و CO2 وجزيئات الماء. عندما ينهار جزيء جلوكوز واحد ، يتم إطلاق 12 إلكترونًا ، والتي تمر عبر سلسلة إنزيمات الجهاز التنفسي ، مما يعطي طاقة لتخليق 36 جزيء ATP. يتم إطلاق سلسلة الجهاز التنفسي من الإلكترونات بواسطة مواد تسمى متقبلات الإلكترون.

تشمل هذه المواد الأكسجين والكبريتات والنترات والكربونات. إذا كان متقبل الإلكترون النهائي هو الأكسجين الجزيئي ، يسمى التنفس الهوائية. في حالة القبول النهائي للإلكترونات من قبل المركبات الأخرى ، يسمى التنفس اللاهوائية.

حسب نوع التنفس ، تصنف البكتيريا إلى أربع مجموعات رئيسية:

1. يلتزم (صارم) الأيروبستنمو مع حرية الوصول إلى الأكسجين (العامل المسبب لمرض السل).

الميكرويروفيليستنمو بتركيز منخفض (يصل إلى 1٪) من الأكسجين وتركيز متزايد من ثاني أكسيد الكربون (Hemophilus influenzae).

اللاهوائية الاختياريةيمكن أن تنمو في وجود الأكسجين وتحت الظروف اللاهوائية (الإشريكية القولونية).

4. يلتزم (صارم) اللاهوائيةيمكن أن تنمو فقط في حالة الغياب التام للأكسجين في البيئة (العوامل المسببة للكزاز ، والتسمم الغذائي ، والغرغرينا الغازية).

عزل الثقافات النقية من الكائنات الحية الدقيقة

الثقافة النقية هي ثقافة تحتوي على كائنات دقيقة من نوع واحد. يعد عزل الثقافات النقية للبكتيريا مرحلة إلزامية في البحث البكتيريولوجي في التشخيص المختبري للأمراض المعدية ، وفي دراسة التلوث الميكروبي للعديد من الكائنات البيئية ، وبشكل عام ، في أي عمل مع الكائنات الحية الدقيقة.

تحتوي المواد المدروسة (القيح والبلغم والبراز والدم ومواد أخرى من المرضى ؛ الماء والتربة والهواء والغذاء والجثث الحيوانية والبشرية والنواقل) عادةً على روابط الميكروبات.

إن عزل الثقافة النقية يجعل من الممكن دراسة السمات المورفولوجية والثقافية والكيميائية الحيوية والمستضدية وغيرها ، والتي يحدد مجموعها نوع ونوع العامل الممرض ، أي أنه يتم تحديده.

لعزل الثقافات النقية من الكائنات الحية الدقيقة ، يتم استخدام طرق يمكن تقسيمها إلى عدة مجموعات.

طريقة باستير- التخفيف المتسلسل لمواد الاختبار في وسط مغذي سائل إلى تركيز خلية واحدة لكل حجم (له أهمية تاريخية).

2. طريقة كوخ ("لوحة الأسلاك")- التخفيف المتسلسل لمواد الاختبار في الأجار المنصهر (درجة حرارة 48-500 درجة مئوية) ، متبوعًا بصبها في أطباق بتري ، حيث يتجمد الأجار.

يتم إجراء التطعيمات ، كقاعدة عامة ، من التخفيفات الثلاثة أو الأربعة الأخيرة ، حيث يوجد عدد قليل من البكتيريا ، وفي المستقبل ، مع النمو على أطباق بتري ، تظهر مستعمرات معزولة ، تتكون من خلية أم أصلية واحدة. من المستعمرات المعزولة في عمق الأجار ، يتم الحصول على ثقافة نقية للبكتيريا عن طريق الثقافة الفرعية على وسط طازج.

طريقة شوكيفيتش- يستخدم للحصول على مزرعة نقية من المتقلبة والكائنات الدقيقة الأخرى ذات النمو "الزاحف". يتم تلقيح مادة الاختبار في ماء التكثيف عند قاعدة الأجار المائل. الميكروبات المتحركة (Proteus) قادرة على صعود مائل الأجار ، وتبقى الأشكال الثابتة تنمو في قاع موقع التلقيح.

من خلال إعادة زرع الحواف العلوية للثقافة ، يمكن الحصول على ثقافة نقية.

4. طريقة دريغالسكي- يستخدم على نطاق واسع في الممارسة البكتريولوجية ، بينما يتم تخفيف مادة الاختبار في أنبوب اختبار مع محلول ملحي معقم أو مرق.

تُضاف قطرة واحدة من المادة إلى الكوب الأول وتنتشر على سطح الوسط باستخدام ملعقة زجاجية معقمة. ثم ، باستخدام نفس الملعقة (بدون حرقها في لهب الموقد) ، يتم البذر نفسه في الكوبين الثاني والثالث. مع كل بذر من البكتيريا على الملعقة ، يكون هناك عدد أقل وأقل ، وعند البذر في الكوب الثالث ، سيتم توزيع البكتيريا على سطح وسط المغذيات بشكل منفصل عن بعضها البعض.

بعد 1-7 أيام من حفظ الأطباق في منظم حرارة (اعتمادًا على معدل نمو الكائنات الدقيقة) ، في الطبق الثالث ، تعطي كل بكتيريا استنساخًا للخلايا ، وتشكل مستعمرة معزولة ، والتي يتم استزراعها على أجار مائل من أجل التراكم ثقافة نقية.

5. طريقة واينبرغ.تنشأ صعوبات خاصة في عزل الثقافات النقية من اللاهوائية الملزمة.

إذا لم يتسبب ملامسة الأكسجين الجزيئي في موت الخلايا على الفور ، فسيتم إجراء البذر وفقًا لطريقة Drygalsky ، ولكن بعد ذلك يتم وضع الكؤوس على الفور في anaerostat. ومع ذلك ، فإن طريقة التربية هي الأكثر استخدامًا. يكمن جوهرها في حقيقة أن تخفيف مادة الاختبار يتم في وسط مصهور ويتم تبريده إلى وسط مغذي أجار 45-500 درجة مئوية. قم بعمل 6-10 تخفيفات متتالية ، ثم يتم تبريد الوسط الموجود في أنابيب الاختبار بسرعة ويتم تغطية السطح بطبقة من خليط من البارافين وزيت الفازلين لمنع تغلغل الهواء في سماكة وسط المغذيات.

في بعض الأحيان ، يتم نقل وسط المغذيات ، بعد التلقيح والخلط ، إلى أنابيب بوري المعقمة أو ماصات باستور الشعرية ، والتي يتم غلق نهاياتها. مع التخفيف الناجح في أنابيب الاختبار ، تنمو أنابيب بوري ، وماصات باستير ، والمستعمرات المعزولة من اللاهوائية.

من أجل أن تكون المستعمرات المعزولة مرئية بوضوح ، يتم استخدام وسائط المغذيات الموضحة. لاستخراج المستعمرات اللاهوائية المعزولة ، يتم تسخين الأنبوب قليلاً عن طريق تدويره فوق اللهب ، بينما يذوب الأجار المجاور للجدران وتنزلق محتويات الأنبوب على شكل عمود أجار إلى طبق بتري معقم.

يتم قطع عمود أجار بملاقط معقمة وتتم إزالة المستعمرات بحلقة. يتم وضع المستعمرات المستخرجة في وسط سائل ملائم لتنمية الكائنات الدقيقة المعزولة (على سبيل المثال ، وسط Kitt-Tarozzi). يتم تطهير وسط أجار من أنبوب بوري عن طريق تمرير الغاز عبر سدادة قطنية.

6. طريقة معلقة- عندما يرغبون في الحصول على مستعمرات معزولة من البكتيريا ذات حساسية عالية بشكل خاص للأكسجين (الأيروبس الصارم) ، فإنهم يستخدمون طريقة أنبوب الاختبار الدائر Hungate.

للقيام بذلك ، يتم تلقيح وسط الأجار المنصهر بالبكتيريا في التيار المباشر من خلال أنبوب اختبار لغاز خامل متحرر من شوائب الأكسجين. ثم يُغلق الأنبوب بسدادة مطاطية ويوضع أفقيًا في مشبك يدور الأنبوب ، بينما يتم توزيع الوسط بالتساوي على جدران الأنبوب ويتجمد في طبقة رقيقة. يتيح استخدام طبقة رقيقة في أنبوب اختبار مملوء بخليط غازي الحصول على مستعمرات معزولة يمكن رؤيتها بالعين المجردة.

عزل الخلايا الفردية بمُعالج دقيق. المعالج الدقيق هو جهاز يسمح بإزالة خلية واحدة من التعليق باستخدام ماصة خاصة أو حلقة صغيرة. يتم التحكم في هذه العملية تحت المجهر. يتم تركيب غرفة مبللة على مرحلة المجهر ، حيث يتم وضع المستحضر "قطرة معلقة".

في حاملي منصات التشغيل ، يتم تثبيت الماصات الدقيقة (microloops) ، والتي تتم حركتها في مجال رؤية المجهر بدقة ميكرون بفضل نظام من البراغي والرافعات.

يقوم الباحث ، من خلال الفحص بالمجهر ، باستخراج الخلايا الفردية باستخدام الماصات الدقيقة ونقلها إلى أنابيب الاختبار بوسط سائل معقم للحصول على استنساخ خلية.

السابق التالي

عرض المزيد:

طرق عزل الثقافات النقية من البكتيريا الهوائية

أ) طريقة باستير- ذو أهمية تاريخية ، ينص على التخفيف المتسلسل لمواد الاختبار في وسط مغذي سائل بطريقة الدرفلة

ب) طريقة كوخ- طريقة تخطيط الصفائح - استنادًا إلى التخفيف المتسلسل لمواد الاختبار باستخدام أجار ببتون اللحم ، متبوعًا بصب أنابيب الاختبار بمواد مخففة في أطباق بتري

في) طريقة دريغالسكي- عند بذر مادة مزروعة بكثرة بالنباتات الدقيقة ، استخدم 2-3 أكواب للبذر المتتالي باستخدام ملعقة.

ز) حلقة البذر بضربات متوازية.

الطرق البيولوجيةبناءً على الخصائص البيولوجية لمسببات الأمراض.

أ) بيولوجي- إصابة الحيوانات شديدة الحساسية حيث تتكاثر الميكروبات بسرعة وتتراكم.

في بعض الحالات ، تكون هذه الطريقة هي الوحيدة التي تسمح بعزل مزرعة العامل الممرض عن شخص مريض (على سبيل المثال ، مع مرض التولاريميا) ، وفي حالات أخرى تكون أكثر حساسية (على سبيل المثال ، عزل المكورات الرئوية في الفئران البيضاء أو العامل المسبب السل في خنازير غينيا).

ب) المواد الكيميائية- على أساس المقاومة الحمضية للمتفطرات. لتحرير المواد من النباتات المصاحبة
تعامل بمحلول حامض.

ستنمو عصيات الحديبة فقط ، حيث يتم قتل الميكروبات المقاومة للأحماض بواسطة الحمض.

في) الطريقة الفيزيائيةعلى أساس مقاومة الجراثيم للحرارة. لعزل مزارع البكتيريا المكونة للجراثيم من
المخاليط ، يتم تسخين المادة عند 80 درجة مئوية وتلقيحها على وسط مغذي. ستنمو بكتيريا الأبواغ فقط ، لأن أبواغها بقيت حية ونمت.

ز) طريقة شتشوكيفيتش- على أساس الحركة العالية للبروتينات المبتذلة ، القادرة على النمو الزاحف.

طريقة الانتقال من المستعمرات إلى الأجار المائل و BCH:

أ) الانتقال من المستعمرات إلى مائل أجار

يتم فتح غطاء الكأس قليلاً ، ويتم إزالة جزء من مستعمرة فردية بحلقة مبردة مكلسة ، ويتم فتح أنبوب اختبار مع أجار مائل معقم ، ممسكًا به في اليد اليسرى في وضع مائل ، بحيث يكون سطح يمكن ملاحظتها المتوسطة.

يتم نقل الحلقة مع المزرعة إلى أنبوب الاختبار دون ملامسة الجدران ، ويتم فركها فوق وسط المغذيات ، والانزلاق فوق السطح من أحد طرفي أنبوب الاختبار إلى الطرف الآخر ، مما يؤدي إلى رفع السكتات الدماغية إلى أعلى الوسط - البذر باستخدام السكتة الدماغية. الأنبوب مغلق ، ودون تركه ، يتم التوقيع على اسم الميكروب المصنف وتاريخ البذر.

ب) الانتقال من المستعمرة إلى مرق ببتون اللحم

تقنية إعادة البذر على MPB هي في الأساس نفس طريقة البذر على وسط كثيف.

عند البذر على BCH ، يتم غمر الحلقة مع المادة الموجودة عليها في الوسط. إذا كانت المادة لزجة ولم يتم إزالتها من الحلقة ، يتم فركها على جدار الوعاء ، ثم يتم غسلها بوسط سائل. تُسكب المادة السائلة التي يتم جمعها باستخدام باستور معقم أو ماصة متدرجة في وسط مغذي.

كنتيجة للعمل المستقل ، يجب أن يعرف الطالب:

طرق عزل الثقافة النقية للكائنات الحية الدقيقة

2. طرق زراعة الكائنات الحية الدقيقة

يكون قادرا على:

1. مهارات الالتزام بقواعد نظام مكافحة الأوبئة واحتياطات السلامة

تطهير المواد وتطهير اليدين

3. تحضير المستعمرات البكتيرية

4. مجهر المستعمرات

5. الكائنات الحية الدقيقة صبغ غرام

النشاط 8

عنوان.

طرق عزل الثقافات النقية (تابع). النشاط الأنزيمي للبكتيريا وطرق دراستها.

طريقة باستور (طريقة الحد من التخفيفات).يتكون من حقيقة أن عددًا من التخفيفات المتتالية مصنوعة من المادة قيد الدراسة في وسط مغذي سائل. للقيام بذلك ، يتم إدخال قطرة من اللقاح في أنبوب اختبار بوسط سائل معقم ، يتم نقل القطرة منه إلى أنبوب الاختبار التالي ويتم تلقيح ما يصل إلى 8-10 أنابيب اختبار. مع كل تخفيف ، سينخفض عدد الخلايا الميكروبية التي تدخل الوسيط ، ومن الممكن الحصول على مثل هذا التخفيف حيث ستكون هناك خلية جرثومية واحدة فقط في أنبوب الاختبار بأكمله مع الوسيط ، والذي يتم من خلاله استنبات الكائنات الحية الدقيقة النقية. ستطور. نظرًا لأن الميكروبات تنمو بشكل منتشر في الوسائط السائلة ، أي يتم توزيعها بسهولة في جميع أنحاء البيئة ، فمن الصعب عزل خلية جرثومية عن أخرى. وبالتالي ، فإن طريقة باستير لا توفر دائمًا ثقافة نقية. لذلك ، في الوقت الحاضر ، تُستخدم هذه الطريقة بشكل أساسي لتقليل تركيز الكائنات الحية الدقيقة في المادة بشكل مبدئي قبل تلقيحها في وسط كثيف للحصول على مستعمرات معزولة.

طرق الفصل الميكانيكي للكائنات الدقيقة باستخدام وسط مغذي كثيف.تتضمن هذه الطرق طريقة Koch وطريقة Drygalsky.

طريقة كوخ (طريقة البذر العميق).يتم إدخال مادة الاختبار بواسطة حلقة بكتريولوجية أو ماصة باستور في أنبوب اختبار بوسط مغذي كثيف منصهر. حرك محتويات أنبوب الاختبار بالتساوي عن طريق تدويره بين راحتي اليد. يتم نقل قطرة من المادة المخففة إلى أنبوب الاختبار الثاني ، من الثاني إلى الثالث ، وهكذا. تُسكب محتويات كل أنبوب ، بدءًا من الأول ، في أطباق بتري المعقمة. بعد تصلب الوسط في الأكواب ، يتم وضعها في ترموستات للزراعة.

لعزل الكائنات الحية الدقيقة اللاهوائية بطريقة كوخ ، من الضروري الحد من وصول الأكسجين إلى الثقافة. لهذا الغرض ، يتم ملء سطح البذر العميق في طبق بتري بمزيج معقم من البارافين والفازلين (1: 1). يمكنك أيضًا ترك اللقاح ممزوجًا جيدًا بوسط الأجار مباشرة في أنبوب الاختبار. في الوقت نفسه ، يتم استبدال السدادة القطنية بسدادة مطاطية أو يُسكب سطح أجار بمزيج من زيت البارافين والفازلين. لاستخراج المستعمرات الناضجة من الكائنات الحية الدقيقة اللاهوائية ، يتم تسخين أنابيب الاختبار قليلاً عن طريق الدوران السريع على لهب الموقد. يذوب الأجار المجاور للجدران وينزلق العمود بسهولة في طبق بتري المحضر. بعد ذلك ، يتم قطع عمود الآجار بمشرط معقم ، وتتم إزالة المستعمرات بحلقة معقمة أو بقطع شعري معقم ونقلها إلى وسط سائل.

طريقة دريغالسكييعتمد على الفصل الميكانيكي للخلايا الميكروبية على سطح وسط غذائي كثيف في أطباق بتري. تبدأ كل خلية جرثومية ، مثبتة في مكان معين ، في التكاثر ، وتشكيل مستعمرة.

للبذر وفقًا لطريقة Drygalsky ، يتم استخدام العديد من أطباق Petri المملوءة بوسط غذائي كثيف. يتم وضع قطرة من مادة الاختبار على سطح الوسط. ثم ، باستخدام ملعقة معقمة ، يتم توزيع هذه القطرة على وسط المغذيات بالكامل (البذر مع العشب).

لحفظ الوسائط والأواني ، يمكنك استخدام طبق واحد ، وتقسيمه إلى قطاعات ، وتلقيحهم بالتتابع بضربة (طريقة نضوب). للقيام بذلك ، يتم أخذ المادة بحلقة ويتم رسم سلسلة من الضربات المتوازية معها ، أولاً فوق سطح القطاع الأول ، ثم يتم زرع جميع القطاعات الأخرى مع بقاء الخلايا في الحلقة. مع كل ضربة لاحقة ، يتناقص عدد الخلايا المصنفة.

طريقة عزل المزارع النقية باستخدام المواد الكيميائيةتستخدم في عزل مزارع الكائنات الحية الدقيقة المقاومة لبعض المواد الكيميائية. على سبيل المثال ، يمكن استخدام هذه الطريقة لعزل مزرعة نقية من المتفطرة السلية المقاومة للأحماض والقلويات والكحول. في هذه الحالة ، تُسكب مادة الاختبار قبل البذر بمحلول حمض 15٪ أو مضاد للفورمين ، وتُحفظ في منظم حرارة لمدة 3-4 ساعات. بعد التعرض للحمض أو القلوي ، تظل خلايا عصية الحديبة حية ، وتموت جميع الكائنات الحية الدقيقة الأخرى الموجودة في مادة الاختبار. بعد معادلة الحمض أو القلويات ، تزرع المادة المعالجة على وسط صلب ويتم الحصول على مستعمرات معزولة من العامل المسبب لمرض السل.

تستخدم على نطاق واسع لتحديد عدد الكائنات الحية الدقيقة القابلة للحياة في التربة والركائز الطبيعية الأخرى. لا يسمح تطبيقه فقط بمراعاة عدد الكائنات الحية الدقيقة ، ولكن أيضًا لتقييم تنوعها من خلال مورفولوجيا المستعمرة.

تؤخذ عينات التربة بملعقة معقمة ، وتجرى الدراسة في يوم أخذ العينات. يكمن جوهر الطريقة في بذر عينة التربة قيد الدراسة على وسط كثيف في أطباق بتري والعد اللاحق للمستعمرات المزروعة. يُعتقد أن كل مستعمرة هي نتيجة تكاثر خلية واحدة. يتم العمل على ثلاث مراحل: تحضير المخففات ، البذر في أكواب ، عد المستعمرات المزروعة.

يتم التلقيح من تخفيف التعليق اعتمادًا على العدد المتوقع من الكائنات الحية الدقيقة في ركيزة الاختبار. يتم إجراء التخفيفات في ماء الصنبور المعقم أو محلول كلوريد الصوديوم متساوي التوتر. تم استخدام عامل تخفيف ثابت أثناء التجربة. في أغلب الأحيان ، يتم إجراء التخفيفات العشرية.

توضع عينة من التربة التي تم تحليلها (1-10 جم) في دورق به 100 مل من الماء المعقم ورجها. ثم انقل 1 مل من مادة الاختبار باستخدام ماصة معقمة إلى أنبوب اختبار به 9 مل من الماء المعقم. إذا تم تخفيف مادة الاختبار بالفعل 100 مرة ، يتم الحصول على تخفيف بنسبة 1: 1000. يتم خلط تعليق هذا التخفيف تمامًا ، مع الأخذ في الماصة وإطلاق التعليق الناتج منه. ثم ، باستخدام نفس الماصة ، خذ 1 مل من التخفيف الناتج وانقله إلى أنبوب الاختبار الثاني - يتم الحصول على تخفيف 1: 10000. يتم تحضير التخفيفات اللاحقة بنفس الطريقة. يتم تحديد درجة التخفيف من خلال العدد المتوقع من الكائنات الحية الدقيقة في العينة: عدد التخفيفات هو أكبر ، والمزيد من الكائنات الحية الدقيقة في الركيزة الأصلية.

يتم البذر على وسائط أجار في أطباق بتري. يتم استخدام أجار ببتون أو أجار ببتون السمك (MPA ، RPA) لتحديد العدد الإجمالي للكائنات الحية الدقيقة ، يتم استخدام نبتة أجار (SA) لتحديد محتوى الفطريات في التربة ، يتم استخدام وسائط المغذيات المناسبة لتحديد عدد المجموعات الفسيولوجية المختلفة والكائنات الدقيقة الإرشادية الصحية. يُسكب الوسط المُذاب المذاب في حمام مائي في أطباق بتري المعقمة ، 20-30 مل لكل منهما. تُترك الألواح على سطح أفقي حتى يتصلب الأجار. باستخدام ماصة معقمة ، يتم تطبيق حجم معين (عادةً 0.1-0.5 مل) من التخفيف المناسب ، الذي سبق خلطه جيدًا ، على سطح لوحة أجار في طبق بتري. ينتشر هذا الحجم على سطح الوسط باستخدام ملعقة معقمة. ثم يتم تنفيذ هذه الملعقة على كامل سطح الوسط في الكوبين الثاني والثالث ، حيث لم يتم إدخال اللقاح (طريقة التلقيح النضوب).

4-6 زرع متوازي من كل تخفيف. مع المحاصيل المتوازية من نفس التخفيف ، يمكن استخدام ماصة واحدة معقمة وملعقة واحدة. يتم وضع الأكواب ذات الوسائط الملقحة في منظم حرارة يتم ضبطه على درجة حرارة مناسبة لاكتشاف تطور الكائنات الحية. تحسب البكتيريا أثناء الزراعة عند درجة حرارة 30 درجة مئوية بعد ثلاثة أيام ، في درجة حرارة الغرفة - بعد سبعة أيام. عد الخميرة والفطريات - في درجة حرارة الغرفة بعد 310 يومًا (عند درجة حرارة 25 درجة مئوية ، يمكن تقليل فترة مراقبة الفطريات إلى 2-3 أيام).

يُحسب عدد المستعمرات المزروعة في طبق بتري ويعاد حسابه لكل غرام واحد ، ويتم تلخيص نتائج البذار المتوازية ويتم حساب متوسط عدد المستعمرات المزروعة عند زرع البذور من هذا التخفيف. يتم عد المستعمرات دون فتح أطباق بتري.

تعتمد دقة الطريقة على عدد المستعمرات المحسوبة وليس على عدد التكرارات. يعتبر أفضل تربية ، عندما تزرع على وسط مغذي كثيف ، من 50 إلى 100 مستعمرة. إذا كان عدد المستعمرات المزروعة أقل من 10 ، فسيتم تجاهل هذه النتائج ولا تُستخدم لحساب عدد الخلايا في الركيزة الأصلية. من المستحسن أن يكون العدد الإجمالي للمستعمرات المحسوبة عند زرعها من هذا التخفيف 300 على الأقل.

يتم حساب عدد الكائنات الحية الدقيقة في 1 جم (1 مل) من الركيزة الأولية بالصيغة:

T = أ س ب س ج / د ،

حيث T هو عدد الكائنات الحية الدقيقة في 1 جم ، أ هو عدد المستعمرات المحسوبة ، ب هو التخفيف الذي تم التلقيح منه ، ج - 10 (إذا تم تلقيح 0.1 مل من المعلق على الأطباق) ، د هي الكتلة من الركيزة (التربة) المأخوذة للتحليل

المعالجة الإحصائية للنتائج ممكنة فقط مع الحد الأدنى من الخطأ الفني ، لذلك تتطلب طريقة اللوحة قدرًا كبيرًا من النظافة والدقة في جميع العمليات. من الضروري حماية الماصات والوسائط بعناية من التلوث بالكائنات الحية الدقيقة الأجنبية ، حيث يمكن للخلية التي يتم إدخالها عن طريق الخطأ أن تبالغ في تقدير عدد الكائنات الحية الدقيقة في تعليق الاختبار. يجب أن يتم تحضير التخفيفات والبذر في صندوق.

الطريقة الموصوفة قابلة للتطبيق لحساب الأيروبس واللاهوائية الاختيارية. لحساب اللاهوائية الصارمة ، توضع أطباق بتري في ظروف لاهوائية بعد التلقيح.

الطرق البيئية لدراسة الكائنات الحية الدقيقة في التربة

تُستخدم طريقة كوخ لتحديد العدد الإجمالي للبكتيريا. في طبق بتري معقم فارغ ، صب 1 مل من مادة الاختبار من التخفيف المناسب وصب 10-15 مل من المادة المنصهرة وتبريدها إلى 45 درجة مئوية ميجا باسكال ، واخلطها مع السائل ، وقم بتدوير الكوب على سطح الطاولة.

بعد زراعة المحاصيل ، تُحسب المستعمرات المزروعة على السطح وفي عمق الأجار. للقيام بذلك ، يتم وضع الكوب رأسًا على عقب على خلفية سوداء ، ويتم تمييز كل مستعمرة معدودة بعلامة على الزجاج. قيِّم فقط تلك الأطباق التي نمت من 30 إلى 300 مستعمرة. إذا نمت أكثر من 300 مستعمرة على الطبق ، ولا يمكن تكرار التحليل ، فيمكن حساب المستعمرات تحت إضاءة جانبية قوية باستخدام عدسة مكبرة ولوحة خاصة بشبكة.

يتم حساب عدد المستعمرات في 20 مربعًا على الأقل 1 سم 2 في أماكن مختلفة من الطبق. يتم حساب متوسط عدد المستعمرات في 1 سم 2 ، والذي يتم ضربه في مساحة الطبق.

عند عد المستعمرات ، يمكن استخدام جهاز عد بكتيري خاص ، PSB.

نتيجة عد الطوائف في كل طبق هي عدد البكتيريا لكل 1 مل (سم 3) أو 1 غرام من مادة الاختبار مع مراعاة التخفيف. بالنسبة للعدد النهائي للبكتيريا ، يتم أخذ المتوسط الحسابي لنتائج عد الطوائف على الأطباق مع تلقيح تخفيفين متجاورين.

مثال:تربية 10 - 1 - 250 مستعمرة ، تكاثر 10 - 2 - 23 مستعمرة.

العدد الإجمالي للبكتيريا = 250 × 10 + 23 × 100/2 = 2400 كفو / مل = 2.4 × 10 2 كفو / مل (وحدات تشكيل مستعمرة لكل 1 مل).

يمكن تقريب نتيجة البحث إلى 2-3 أرقام معنوية.

طريقة المعايرة.

يستخدم لتحديد عدد PSDs.

المرحلة الأولى:التجانس المادي. إذا لزم الأمر ، قم بإعداد معلق من أجل نقل الكائنات الحية الدقيقة إلى الطور السائل.

المرحلة الثانية:تحضير سلسلة من التخفيفات.

المرحلة الثالثة:تلقيح كميات مختارة من مادة الاختبار (100 ، 10 ، 1 مل) ومخففاتها 1 مل في وسط مغذي سائل. لتحسين دقة الطريقة ، يمكن زرع كل حجم بالتوازي في عدة أجزاء من وسط المغذيات (بذر ثنائي ، ثلاثة ، خمسة صفوف). الأمثل هو التكرار ثلاثة أضعاف (موثوقية كافية بتكلفة منخفضة نسبيًا).

المرحلة الرابعة:مع الأخذ في الاعتبار وجود النمو على وسط مغذي سائل والبذر من أحجام موجبة على وسط مغذي صلب.

المرحلة الخامسة:تحديد الكائنات الحية الدقيقة التي تنمو على وسط مغذي صلب. في الوقت نفسه ، تؤخذ الخصائص الثقافية في الاعتبار ، وإذا لزم الأمر ، يتم إجراء دراسات إضافية (دراسة الخصائص الصرفية والمورفولوجية والكيميائية الحيوية والمصلية).

إذا تم استخدام طريقة صف واحد ، يتم التعبير عن النتيجة عادةً على أنها عيار الكائن الدقيق المستهدف ، والذي يتم اعتباره أصغر حجم (أعلى تخفيف) لا يزال موجودًا فيه.

إذا تم استخدام طريقة متعددة الصفوف ، يتم تسجيل النتائج باستخدام جداول خاصة تسمح ، بناءً على مجموعة الأحجام الموجبة التي أدت إلى الظهور ، بتحديد العيار ، الفهرس (MP).

مقدمة لممارسة صبغات الأنيلين

استخدام نظام الغمر والمكثف في الفحص المجهري

تطوير طريقة الزراعة على السوائل البيولوجية والأوساط الغذائية الكثيفة

تطوير طريقة التجزيء الجزئي

اكتشاف العامل المسبب لمرض الجمرة الخبيثة والكوليرا والسل والتوبركولين

في نفس السنوات تقريبًا ، تم تشكيل المدرسة الألمانية لعلماء الأحياء الدقيقة وتشغيلها بنجاح ، برئاسة ROBERT KOCH (1843 - 1910). بدأ كوخ بحثه في وقت كان فيه دور الكائنات الحية الدقيقة في مسببات الأمراض المعدية محل شك كبير. لإثبات ذلك ، كانت هناك حاجة إلى معايير واضحة ، صاغها كوخ ودخلت في التاريخ تحت اسم "ثلاثية هنلي كوخ". كان جوهر الثالوث كما يلي:

1) يجب دائمًا اكتشاف العامل المسبب للميكروبات المزعوم فقط في هذا المرض ، وليس عزله عن الأمراض الأخرى وعن الأفراد الأصحاء ؛

2) يجب عزل العامل الممرض في مزرعة نقية ؛

3) يجب أن تسبب الثقافة النقية لهذا الميكروب مرضًا في الحيوانات المصابة التجريبية مع صورة سريرية ومرضية مماثلة لمرض يصيب الإنسان.

أظهرت الممارسة أن النقاط الثلاث جميعها ذات أهمية نسبية ، حيث أنه من غير الممكن دائمًا عزل العامل المسبب للمرض في ثقافة نقية والتسبب في مرض بشري في حيوانات التجارب. بالإضافة إلى ذلك ، تم العثور على مسببات الأمراض لدى الأشخاص الأصحاء ، خاصة بعد المرض. ومع ذلك ، في المراحل المبكرة من تطور وتكوين علم الأحياء الدقيقة الطبية ، عندما تم عزل العديد من الكائنات الدقيقة التي لا علاقة لها بهذا المرض من جسم المريض ، لعب الثالوث دورًا مهمًا في تحديد العامل المسبب الحقيقي للمرض. بناءً على مفهومه ، أثبت كوخ أخيرًا أن الكائنات الحية الدقيقة الموجودة سابقًا في الحيوانات المصابة بالجمرة الخبيثة تلبي متطلبات الثالوث وهي العامل المسبب الحقيقي لهذا المرض. على طول الطريق ، أنشأ كوخ قدرة بكتيريا الجمرة الخبيثة على تكوين الأبواغ.

دور كوخ كبير في تطوير الأساليب الأساسية لدراسة الكائنات الحية الدقيقة. وهكذا ، أدخل في الممارسة الميكروبيولوجية طريقة عزل الثقافات النقية للبكتيريا على وسط المغذيات الصلبة ، وكان أول من استخدم أصباغ الأنيلين لتلوين الخلايا الميكروبية ، واستخدم العدسات الغاطسة والتصوير الميكروي لدراستها المجهرية.

في عام 1882 ، أثبت كوخ أن الكائن الدقيق الذي عزله كان العامل المسبب لمرض السل ، والذي سمي لاحقًا باسم عصية كوخ. في عام 1883 ، عزل كوخ وزملاؤه العامل المسبب للكوليرا ، ضمة الكوليرا (ضمة كوخ).

منذ عام 1886 ، كرس كوخ كامل أبحاثه للبحث عن عقاقير فعالة لعلاج السل أو الوقاية منه. في سياق هذه الدراسات ، حصل على أول دواء مضاد لمرض السل - tuberculin ، وهو مستخلص من مزرعة بكتيريا السل. على الرغم من أن التوبركولين ليس له تأثير علاجي ، إلا أنه يُستخدم بنجاح لتشخيص مرض السل.

تلقى عمل كوخ العلمي اعترافًا عالميًا ، وفي عام 1905 حصل على جائزة نوبل في الطب.

باستخدام الأساليب التي طورها كوخ ، اكتشف علماء البكتيريا الفرنسيون والألمان العديد من البكتيريا واللولبيات والأوليات - العوامل المسببة للأمراض المعدية في البشر والحيوانات. من بينها العوامل المسببة للالتهابات القيحية والجروح: المكورات العنقودية ، والمكورات العقدية ، والمطثيات من العدوى اللاهوائية ، والإشريكية القولونية والعوامل المسببة للعدوى المعوية (بكتيريا التيفوئيد والبكتيريا نظيرة التيفية ، وبكتيريا الزحار الشيغا) ، والعامل المسبب لعدوى الدم - الحمى الانتكاسية اللولبية ، العوامل المسببة لالتهابات الجهاز التنفسي والعديد من الالتهابات الأخرى ، بما في ذلك العدد الذي تسببه الأوليات (الملاريا المتصورة ، الزحار الأميبا ، الليشمانيا). تسمى هذه الفترة "العصر الذهبي" لعلم الأحياء الدقيقة.

دور العلماء المحليين في تطوير علم الأحياء الدقيقة (I.I. Mechnikov، D.I. Ivanovsky، GN Gabrichevsky، S.N. Vinogradsky، VD Timakov، N.F. Gamaleya، LA PF Zdrodovsky، ZV Ermolyeva).

أحد مؤسسي علم المناعة كان I.I. MECHNIKOV (1845-1916) - مبتكر نظرية المناعة البلعمية أو الخلوية. في عام 1888 قبل متشنيكوف دعوة باستير وترأس المختبر في معهده. ومع ذلك ، لم يقطع متشنيوف العلاقات الوثيقة مع وطنه. لقد جاء مرارًا وتكرارًا إلى روسيا ، وعمل العديد من الأطباء الروس في مختبره في باريس. ومن بينهم Ya. Yu. Bardakh ، و V. A. Barykin ، و A.M Bezredka ، و M.Veinberg ، و G.N. Gaperhevsky ، و V. I. L. علم الأحياء الدقيقة والمناعة وعلم الأمراض المحلي والعالمي.

على الرغم من التقدم الكبير في مجال إنشاء مناعة مضادة للعدوى ، لم يُعرف أي شيء تقريبًا عن آليات تطورها. كانت نقطة التحول هي اكتشاف I.I. Mechnikov (1845-1916) ، صنعه في ميسينا عام 1882 عند دراسة رد فعل يرقة نجم البحر على إدخال شوكة الورد فيها. كانت تلك المناسبة السعيدة عندما وقعت ملاحظة بالصدفة على عقل جاهز وقادت أنا. Mechnikov لإنشاء عقيدة البلعمة والالتهابات والمناعة الخلوية.

في عام 1892 ، نشر متشنيكوف محاضراته حول علم الأمراض المقارن للالتهاب ، حيث اعتبر ، كمفكر بارز ، العمليات المرضية من وجهة نظر النظرية التطورية. في عام 1901 ، ظهر كتابه الجديد "المناعة ضد الأمراض المعدية" ، والذي لخص نتائج سنوات عديدة من البحث في مجال المناعة.

اكتسب النقاش الذي دار بين متشنيكوف وأنصاره مع أتباع النظرية الخلطية ، الذين رأوا عمل الأجسام المضادة كأساس للمناعة ، أهمية إبداعية كبيرة. تم وضع بداية دراسة الأجسام المضادة من خلال أعمال P. Ehrlich ، ثم J. Bordet ، التي أجريت في العقد الأخير من القرن التاسع عشر.

إن مساهمة Paul EHRLICH (1854-1915) في تطوير علم المناعة ، وكذلك في إنشاء وتطوير العلاج الكيميائي ، لا تقدر بثمن. كان هذا العالم أول من صاغ مفاهيم المناعة الإيجابية والسلبية وكان مؤلفًا لنظرية شاملة عن المناعة الخلطية ، والتي أوضحت أصل الأجسام المضادة وتفاعلها مع المستضدات. تم انتقاد توقع إيرليش لوجود مستقبلات خلوية تتفاعل بشكل خاص مع مجموعات معينة من المستضدات لسنوات عديدة. ومع ذلك ، فقد تم إحياؤه في النصف الثاني من القرن العشرين في نظرية بيرنت وعلى المستوى الجزيئي حصل على اعتراف عالمي.

كان II Mechnikov من أوائل من فهموا أن نظريات المناعة الخلطية والبلعمية ليست متعارضة ، ولكنها تكمل بعضها البعض فقط. في عام 1908 مُنح متشنيكوف وإيرليش جائزة نوبل بشكل مشترك لعملهما في مجال علم المناعة.

اكتشافات إرليخ:

1. استخدام الميثيلين الأزرق في علاج الملاريا

2. استخدام التريبان الأحمر لعلاج التريبانوزوما

3.اكتشاف سلفارسان (1907)

4. تطوير طريقة لتحديد نشاط الأمصال المضادة للتسمم ودراسة تفاعل الجسم المضاد للمستضد

5. نظرية المناعة الخلطية.

نهاية القرن التاسع عشر تميزت باكتشاف عصر مملكة فيرا. كان أول ممثل لهذه المملكة هو فيروس موزاييك التبغ ، الذي يصيب أوراق التبغ ، والذي تم اكتشافه في 12 فبراير 1892 بواسطة D.I. IVANOVSKIM ، موظف في قسم علم النبات في سانت أند بي فروشيم. ومع ذلك ، لم يكن من الممكن تقدير هذه الاكتشافات على النحو الواجب في ذلك الوقت وبقيت بصعوبة ملاحظتها على خلفية النجاحات الرائعة لعلم الجراثيم.

افتتح رئيس مدرسة موسكو البكتريولوجية وأحد قادة علماء البكتيريا الروس G.N. GABRICHEVSKY (1860-1907) ، الذي ترأس في عام 1895 معهد البكتريولوجيا في جامعة موسكو ، على نفقة خاصة. عمل في مجال العلاج النوعي والوقاية من الحمى القرمزية والحمى النكسية. حظيت نظريته المتعلقة بالمكورات العقدية حول أصل الحمى القرمزية بقبول عام في نهاية المطاف. غابريشيفسكي هو مؤلف كتاب "دليل علم الجراثيم السريري للأطباء والطلاب" (1893) والكتاب المدرسي "علم الجراثيم الطبي" ، والذي تم نشره في أربع طبعات. ج. قدم غابريشيفسكي (1860-1907) العلاج المصلي في روسيا ، ودرس آليات المناعة ضد الحمى الراجعة ، والدفتيريا ، والحمى القرمزية.

أصبح معهد الطب التجريبي المركز الرئيسي لمدرسة Pererburg البكتريولوجية. S.N.VINOGRADSKY ، الذي اكتسب شهرة عالمية لعمله في مجال علم الأحياء الدقيقة العام ، تمت الموافقة عليه كرئيس لقسم علم البكتيريا. بمساعدة طريقة الثقافات الاختيارية التي طورها. اكتشف فينوغرادسكي بكتيريا الكبريت والحديد والبكتيريا الآزوتية - العوامل المسببة لعملية النترجة في التربة. أسس دور الكائنات الحية الدقيقة في الزراعة.

في. كان Timakov (1905-1977) أحد مؤسسي نظرية الميكوبلازما وأشكال L من البكتيريا ، وكان يعمل في علم الوراثة من الكائنات الحية الدقيقة ، والبكتيريا ، والوقاية من الأمراض المعدية.

في عام 1934 م. تمت دعوة تيماكوف إلى المعهد التركماني لعلم الأحياء الدقيقة وعلم الأوبئة ، حيث ترأس قسم إنتاج اللقاحات والأمصال. كان معدل الإصابة بالتهابات الأمعاء لا يزال مرتفعاً في الجمهورية في ذلك الوقت. في. يدافع تيماكوف عن أطروحته لنيل درجة الدكتوراه عن الأدوية الوقائية ضد الالتهابات المعوية. كما يجري العالم الشاب بحثه الأول حول دراسة العاثيات والفيروسات القابلة للتصفية في تركمانستان.

تحت قيادة V.D. بدأ Timakov ، إنشاء قسم جديد من علم الأحياء الدقيقة الطبية ، ودراسة أشكال L من البكتيريا والميكوبلازما. كان هذا الاتجاه استمرارًا منطقيًا لدراسة نماذج التصفية ، والتي من خلالها V.D. بدأ تيماكوف نشاطه العلمي. لسلسلة من الدراسات لتوضيح دور الأشكال L من البكتيريا وعائلة الميكوبلازما في الأمراض المعدية ، V.D. تيماكوف مع البروفيسور ج. حصل كاجان في عام 1974 على جائزة لينين.
أحد المجالات الرئيسية للنشاط العلمي لـ V.D. تيماكوف مكرس لعلم الوراثة من الكائنات الحية الدقيقة. في. اعتبر تيماكوف أنه من الضروري استخدام طرق التحليل الجينية لحل المشاكل الميكروبيولوجية والوبائية الهامة طبيا. وفي الوقت الحالي ، يعد اتجاه العمل على علم الوراثة للبكتيريا هو الاتجاه الرئيسي في معهد علم الأوبئة وعلم الأحياء الدقيقة. الجمالية. أنشطة V.D. كانت Timakova بشأن إعادة بناء علم الوراثة بعيدة عن أن تقتصر على إجراء أبحاثها الخاصة. لقد فعل الكثير لإعادة إنشاء علم الوراثة في جميع أنحاء بلدنا.
بالإضافة إلى كونه شغوفًا بعمله ، تميز فلاديمير دميترييفيتش بعقل واضح وفهم للحياة والشجاعة. وقد تجلت الصفة الأخيرة بشكل كامل في معركته ضد الاكتشافات "العظيمة" المناهضة للعلم ، مثل تلك التي ادعت أن الفيروسات يمكن أن تتحول إلى بكتيريا.

أسس عالم الأحياء الدقيقة الروسي البارز إن إف غامالية (1859-1949) ، الذي عمل في وقت مبكر من عام 1886 لصالح باستير لعلاج داء الكلب ، مع متشنيكوف وبرداخ ، أول محطة جرثومية في روسيا ، حيث تم إنتاج لقاح ضد داء الكلب وتم تطعيم الناس ضد داء الكلب . NF Gamaleya هو مؤلف للعديد من الأعمال العلمية المكرسة لداء الكلب والكوليرا وغيرها من مشاكل علم الأحياء الدقيقة والمناعة.

لا زيلبر (1894-1966) هو مؤسس النظرية الفيروسية لأصل الأورام ، وعزل العامل المسبب لالتهاب الدماغ الذي ينتقل عن طريق القراد في الشرق الأقصى.

ألهم التقدم في دراسة مستضدات الأورام L.A. Zilber لمحاولة التطعيم ضد الأورام ، والتي بدأها حوالي عام 1950. مع Z.L Baydakova و R.M Radzikhovskaya على نموذجين: ورم Brown-Pierce في الأرانب وسرطان الثدي التلقائي في الفئران.

ب. تناول ZDRODOVSKY (1890-1976) مشكلة الريكتسيات والملاريا وداء البروسيلات وتنظيم المناعة.

Zinaida Vissarionovna YERMOLYEVA - مبتكر أول مضاد حيوي محلي. من بين كل إنجازات التقدم العلمي والتكنولوجي ، فإن اكتشاف المضادات الحيوية ، وقبل كل شيء البنسلين ، هو بلا شك ذو أهمية قصوى للحفاظ على صحة الناس وزيادة متوسط العمر المتوقع. من بين العلماء البارزين في بلدنا الذين قدموا مساهمة كبيرة في تطوير هذا المجال من الطب ، ينتمي أحد الأماكن الرائدة بحق إلى مبتكر أول مضاد حيوي محلي ، عالم ميكروبيولوجي بارز ، منظم رعاية صحية موهوب ، جيد شخصية عامة معروفة ، مدرس رائع ، أكاديمي في أكاديمية العلوم الطبية في اتحاد الجمهوريات الاشتراكية السوفياتية ، عالم مشرف في جمهورية روسيا الاتحادية الاشتراكية السوفياتية ، الحائز على جائزة الدولة لاتحاد الجمهوريات الاشتراكية السوفياتية Zinaida Vissarionovna Yermolyeva. إلى جانب علماء آخرين ، وقفت على أصول الكيمياء البكتيرية الطبية ودراسة المضادات الحيوية في بلدنا ، وكانت شخصًا يتمتع بموهبة تنظيمية كبيرة وطاقة لا تنضب ، وقد أكسب نشاطها الدؤوب وخصائصها الشخصية الاستثنائية احترامها وتقديرها العالميين.

تعتبر دراسة الكوليرا من المجالات المهمة للنشاط العلمي لـ Zinaida Vissarionovna. بناءً على دراسات عميقة وشاملة حول مورفولوجيا وبيولوجيا الكوليرا والضمات الشبيهة بالكوليرا ، اقترح ZV Ermolyeva طريقة جديدة للتشخيص التفريقي لهذه الكائنات الدقيقة.

في عام 1942 ، نُشر كتاب Z.V. Ermolyeva بعنوان "الكوليرا" ، حيث تم تلخيص نتائج ما يقرب من 20 عامًا من دراسة ضمة الكوليرا. في هذه الدراسة ، تم تقديم طرق جديدة للتشخيص المخبري وعلاج الكوليرا والوقاية منها.
كرست Zinaida Vissarionovna جزءًا كبيرًا من عملها العلمي لعزل ودراسة المواد التي لها تأثير مضاد للجراثيم. تم عزل أول مادة تسمى "الليزوزيم" بواسطة Z.V. Ermolyeva مع I. S. Buyanovskaya مرة أخرى في عام 1929. كما أظهرت نتائج دراسات أخرى ، يوجد الليزوزيم في العديد من الأنسجة ، من أصل حيواني ونباتي.

في عام 1960 ، تلقت مجموعة من العلماء برئاسة Z.V. Ermolyeva ، لأول مرة في بلدنا ، عقار مضاد للفيروسات مضاد للفيروسات. تم استخدام هذا الدواء لأول مرة لعلاج الأنفلونزا الشديدة في عام 1962 وكوضع وقائي. يستخدم الدواء حاليًا للوقاية من الأنفلونزا والالتهابات الفيروسية التنفسية الحادة الأخرى ، وكذلك لعلاج عدد من الأمراض الفيروسية في ممارسة العين والجلد.

أكثر من 30 عامًا من حياتها (1942-1974) كرست Zinaida Vissarionovna لدراسة المضادات الحيوية.

يرتبط اسم Z.V. Ermolyeva ارتباطًا وثيقًا بإنشاء أول بنسلين محلي ، وتطوير علم المضادات الحيوية ، واستخدامها على نطاق واسع في بلدنا. تطلب عدد كبير من الجرحى في الفترة الأولى من الحرب الوطنية العظمى تطويرًا مكثفًا وإدخالًا فوريًا في الممارسة الطبية للأدوية عالية الفعالية لمكافحة عدوى الجروح. في هذا الوقت (1942) ، عثرت ZV Ermolyeva ومعاونوها في معهد All-Union لعلم الأوبئة وعلم الأحياء الدقيقة على منتج نشط للبنسلين وعزلوا أول بنسلين محلي ، crustosin. بالفعل في عام 1943 ، بدأ المختبر في تحضير البنسلين للتجارب السريرية.

في وقت لاحق ، تحت قيادة Z. V. المستحضرات المركبة من المضادات الحيوية (ديباسفين ، إريسيكلين ، إلخ). يجب التأكيد على أن Zinaida Vissarionovna شاركت دائمًا بنشاط في تنظيم الإنتاج الصناعي للمضادات الحيوية في بلدنا.