الإنزيمات عبارة عن محفزات بروتينية للتفاعلات البيوكيميائية ، معظموالتي في حالة عدم وجود الإنزيم سوف تستمر ببطء شديد. على عكس المحفزات الكيميائية ، يمكن لكل إنزيم تحفيز عدد صغير جدًا من التفاعلات ، غالبًا واحدة فقط.

وبالتالي ، فإن الإنزيمات عبارة عن محفزات خاصة بالتفاعل. يتم تحفيز جميع التفاعلات الكيميائية الحيوية تقريبًا بواسطة الإنزيمات.

العديد من الإنزيمات لها تأثير محفز على الركائز فقط في وجود مركب عضوي منخفض الوزن الجزيئي قابل للحرارة ، وهو أنزيم.

في مثل هذه الحالات ، يتكون holoenzyme (المركب النشط تحفيزيًا) من apoenzyme (جزء بروتين) وأنزيم مرتبط به (الملحق H). يمكن أن يترافق الإنزيم المساعد مع الإنزيم عن طريق الروابط التساهمية وغير التساهمية. يشير مصطلح "مجموعة الأطراف الصناعية" إلى أنزيم مرتبط تساهميًا. تشمل التفاعلات التي تتطلب وجود الإنزيم المساعد: الأكسدة والاختزال ، ونقل المجموعة ، والأزمرة ، وتفاعلات التكثيف (وفقًا لنظام IUB ، هذه هي الفئات 1 ، 2 ، 5 ، 6). تستمر تفاعلات الانقسام في غياب الإنزيمات المساعدة (وفقًا لنظام IUB ، هذه هي الفئتان 3 و 4).

^ 4.1 العمل المخبري"تحديد نشاط الأميليز
الشعير حسب طريقة Wolgemuth

تعتمد طريقة Wohlgemuth على تحديد الحد الأدنى لمقدار إنزيم قادر على التحلل المائي تمامًا لـ 1 مل من محلول نشا بنسبة 0.1٪ في ظل ظروف معينة. يتم التعبير عن نشاط الأميليز في الشعير بعدد المليلتر من محلول نشا 0.1٪ يمكن تحللها مع 1 مل من مستخلص الشعير عند درجة حرارة 38 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. يتراوح نشاط الأميليز الطبيعي من 160 إلى 320 وحدة نشاط.

تستخدم طريقة Wohlgemuth على نطاق واسع في الممارسة السريرية لتحديد نشاط الأميليز في الدم والبول ، في التخمير - لتحديد نشاط الأميليز في الشعير. لوحظ زيادة حادة في نشاط الأميليز في الدم والبول (10-30 مرة) في التهاب البنكرياس الحاد وأورام البنكرياس.

^ المواد والكواشف: مستخلص من حبوب الشعير المخفف 10 مرات ؛ 0.1٪ محلول نشا 0.1٪ من محلول اليود في 0.2٪ من محلول يوديد البوتاسيوم.

معدات:رف مع أنابيب اختبار ، ماصات ، قطارات ، ترموستات.

^ التقدم.صب 1 مل من الماء المقطر في عشرة أنابيب اختبار. يضاف 1 مل من المستخلص المخفف 10 مرات إلى أنبوب الاختبار الأول ، ويخلط ، ويتم نقل 1 مل من الخليط إلى أنبوب الاختبار الثاني. يتم خلط محتويات هذا الأنبوب مرة أخرى ويتم نقل 1 مل إلى الأنبوب الثالث وهكذا حتى الأنبوب العاشر. يؤخذ 1 مل من الأنبوب الأخير ويتم التخلص منه. وبالتالي ، في كل أنبوب لاحق ، يكون محتوى الإنزيم أقل مرتين من الأنبوب السابق. سيكون تخفيف المستخلص في عشرة أنابيب اختبار: 1:10 ؛ 1:20 ؛ 1:40 ؛ 1:80 ؛ 1: 160 1: 320 1: 640 1: 1280 1: 2560 ؛ 1: 5120 ؛ 1: 10240.

بعد ذلك ، يضاف 1 مل من الماء و 2 مل من محلول النشا إلى جميع أنابيب الاختبار ، ويخلط ويوضع في منظم حرارة عند درجة حرارة 38 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، يتم تبريد الأنابيب ماء الصنبورلإيقاف عمل الإنزيم ، أضف قطرتين من محلول اليود ، ورجه جيدًا ولاحظ تغير اللون. عند التفاعل مع اليود ، يتحول السائل إلى اللون الأصفر والوردي والأرجواني.

مع ملاحظة ما حدث التكاثر تحلل كاملالنشا مع الحد الأدنى من محتوى الإنزيم (أنبوب اختبار مع لون أصفر من المحتويات) ، يتم حساب نشاط الأميليز للمستخلص من كمية المستخلص غير المخفف (أ) في أنبوب الاختبار هذا
(يكسر مل من المستخلص X مل من محلول نشا 0.1٪).

فمثلا، الأصفرظهر في أنبوب الاختبار الرابع ، حيث تم تخفيف المستخلص 160 مرة. هذه الكمية من المستخلص قادرة على التحلل المائي 2 مل من محلول نشا 0.1٪ ، و 1 مل من المحلل المائي غير المخفف 320 مل تحت نفس الظروف: X = 2 × 160/1. لذلك ، فإن نشاط الأميليز هو 320.

^ 4.2 العمل المخبري "تحديد نشاط الكاتلاز

بقلم باخ "

تعتمد الطريقة على تحديد كمية بيروكسيد الهيدروجين المتبقية بعد عمل الكاتلاز عليها بمعايرة محلول KMnO 4 عليه. يستمر التفاعل وفقًا للمعادلة

يتوافق 1 مل من 0.1 مول / لتر من محلول برمنجنات البوتاسيوم مع 85 مجم من بيروكسيد الهيدروجين.

^ المواد والكواشف: تحضير الكاتلاز (1 غرام من براعم الشعير مطحون في ملاط ​​خزفي مع 6 مل من محلول الفوسفات وترشيحه) ؛ 10٪ محلول H 2 SO 4 ؛ 0.1 ٪ محلول بيروكسيد الهيدروجين في محلول الفوسفات ، الرقم الهيدروجيني = 7.0 (35.0 مل 0.2 مول / لتر NaH 2 PO 4 في 13.6 مل 0.2 مول / لتر NaH 2 PO 4) ؛ 0.1 مول / لتر محلول KMnO 4.

معدات: 100 مل قوارير ، ماصات ، سحاح ، ترموستات.

^ التقدم.يضاف 2 مل من مستحضر الكاتلاز إلى قارورتين ، يضاف 1 مل من محلول 10٪ من H 2 SO 4 إلى أحدهما (عينة) ، ثم يصب 2 مل من محلول بيروكسيد الهيدروجين في كل دورق ، ويوضع في ترموستات لمدة 40 دقيقة عند درجة حرارة 38 درجة مئوية. بعد وقت الحضانة ، يضاف 1 مل من محلول H 2 SO 4 بنسبة 10٪ إلى الدورق الثاني (التحكم) ، ويتم معايرة كلا المحلين بمحلول 0.1 مول / لتر KMnO 4 حتى يظهر لون وردي ثابت من برمنجنات البوتاسيوم الزائدة.

يتم تحديد نشاط الكاتلاز بكمية بيروكسيد الهيدروجين المتحلل (مل) ويتم حسابه بواسطة الصيغة:

,

أين
- الفرق بين نتائج معايرة عينات التحكم وعينات الاختبار باستخدام محلول 0.001 N من KMnO 4، ml ؛

Q هي كمية بيروكسيد الهيدروجين (85 مجم) ، المقابلة لها
1 مل 0.1 مول / لتر محلول KMnO 4.

^ 4.3 العمل المخبري "طريقة بالتنقيط
(بحسب كليموفسكي ورودزفيتش) "

نشاط التحلل النشواني ، ويرجع ذلك أساسًا إلى وجود α-amylase في المستحضر ، يميز قدرة الإنزيم على تحفيز التحلل المائي للنشا إلى المنتجات غير الملوثة باليود. في ظل وجود α-amylase و glucoamylase في التحضير ، تحدد هذه الطريقة التأثير الكلي لجميع إنزيمات amylolytic.

يتم أخذ وحدة نشاط amylolytic في هذه الطريقة على أنها كمية من الإنزيم الذي يحفز تكسير 1 جرام من النشا القابل للذوبان إلى منتجات غير ملطخة باليود في ساعة واحدة عند درجة حرارة 30 درجة مئوية تحت ظروف محددة بدقة. يتم التعبير عن نشاط انحلال الأميلوليت لـ AS بعدد الوحدات المشار إليها في 1 جم من المستحضر أو ​​الثقافة أو 1 سم 3 من المحلول. توضح قيمة AC عدد جرامات النشا التي يمكن تحللها بالماء إلى مركبات غير ملوثة باليود في 1 جرام من المستحضر أو ​​المزرعة أو 1 سم 3 من المحلول في ساعة واحدة في ظل ظروف التحديد. يتم التحكم في نهاية التفاعل بصريًا عن طريق اختبار اليود.

يتم تحديد حساسية الطريقة الحد الأدنى للمبلغالوقت الذي يمكنك من خلاله التقاط تغير لون اليود بصريًا. من المفترض أن معدل التفاعل الأنزيمي يتناسب طرديًا مع كمية الإنزيم المستخدم ويظل ثابتًا لمدة 5 دقائق إلى ساعة واحدة ، أي أن التفاعل يخضع لقانون التفاعل طلب صفر. بالإضافة إلى ذلك ، تأثير قيمة الرقم الهيدروجيني و الطبيعة الكيميائيةالمخزن المؤقت بقيمة التيار المتردد. مع محلول الأسيتات (الأس الهيدروجيني = 4.7) ، تكون قيمة AS في المستحضرات الفطرية في المتوسط ​​1.5 مرة أعلى مما كانت عليه عند تحديدها باستخدام محلول الفوسفات (الرقم الهيدروجيني = 6.0). لذلك ، عند تحديد قيمة AS للمزارع الفطرية ، يوصى بأخذ محلول خلات.

عيب الطريقة هو الغموض التعريف المرئينهاية رد الفعل.

^ المواد والكواشف: أسيتات عازلة درجة الحموضة = 4.7 للإنزيمات من أصل فطري ؛ درجة الحموضة العازلة الفوسفاتية = 6.0 للأنزيمات من أصل بكتيري ؛ 1 ٪ محلول النشا (محلول النشا المستخدم لتحليل المستحضرات الفطرية يجب أن يكون الرقم الهيدروجيني = 4.7 ، لتحليل المستحضرات البكتيرية - 6.0) ؛ حلول اليود. لتحضير المحلول الأساسي لليود ، يتم وزن 4.4 جرام من يوديد البوتاسيوم ، و 1.4 جرام من اليود المعدني في كوب زجاجي بغطاء أرضي ، ويضاف حوالي 2 سم 3 من الماء المقطر. يُغلق الزجاج بغطاء ، ويتم تقليب المحتويات ، وبعد إذابة اليود ، يتم نقل المحلول إلى دورق حجمي بحجم 100 سم 3 مع سدادة أرضية. خفف الحجم بالماء المقطر حتى العلامة. يتم تخزين محتويات القارورة في مكان بارد ومظلم. يمكن استخدام المحلول الأساسي لليود في غضون 30 يومًا من تاريخ تحضيره. يتم تحضير محلول اليود من محلول المخزون. للقيام بذلك ، يتم سكب 20 سم 3 من المحلول الأساسي لليود في دورق حجمي بسعة 100 سم 3 ، ويضاف 4.4 جم من يوديد البوتاسيوم ويتم تعديل الحجم الكلي للمحلول إلى 100 سم 3. يمكن استهلاك محلول اليود في غضون ستة أيام بعد تحضيره.

معدات:أنابيب اختبار واسعة ، قضبان زجاجية ، ماصات ، أكواب سعة 50 مل ، أطباق بتري ، ترموستات.

^ التقدم.لتحديد قيمة التيار المتردد ، من المهم مراقبة شروط التفاعل بدقة. للقيام بذلك ، يجب تسخين جميع الحلول - الركيزة (محلول النشا 1 ٪) ومحلول الإنزيم والماء المقطر إلى درجة حرارة 30 درجة مئوية.

يتم وضع الركيزة بحجم 25 سم 3 (12.5 مل) في أنبوب اختبار عريض يتم إدخال قضيب زجاجي فيه. يُسكب 30 سم 3 (15 مل) من المستخلص و 30 سم 3 (15 مل) من الماء في أنابيب اختبار منفصلة ، وتوضع في منظم الحرارة وتحفظ عند درجة حرارة 30 درجة مئوية من أجل
10 دقائق.

بعد ذلك ، يضاف من 1 إلى 25 سم 3 من محلول الإنزيم الأولي والكمية المقابلة من الماء إلى أنبوب اختبار عريض إلى محلول النشا ، دون إزالة أنابيب الاختبار من منظم الحرارة ، باستخدام ماصات بحيث يكون الحجم الكلي للتفاعل الخليط 50 سم 3. إذا كان مستخلص الإنزيم غير نشط ، فيمكنك فقط إضافته بمقدار 25 سم 3 ، وعدم إضافة الماء على الإطلاق.

يتم خلط محتويات أنبوب الاختبار بعصا ويتم ملاحظة الوقت بساعة توقيت عند إضافة المستخلص إلى محلول النشا. كل 60 ثانية ، تؤخذ قطرة عينة من أنبوب الاختبار دون إزالتها من الترموستات. يتم وضع قطرة على صفيحة خزفية بيضاء ، ويتم دمج هذه القطرة مع قطرة من محلول اليود ويلاحظ اللون. يعتبر تفاعل هضم النشا كاملاً عندما يتوقف اليود عن إحداث تغير في اللون عندما يقترن بقطرة من محلول الاختبار خلال الثواني العشر الأولى. يظهر التغيير في اللون بوضوح عند حدود التلامس بين قطرتين - اليود وخليط التفاعل.

يجب أن يكون الوقت الذي يستغرقه النشا في التحلل إلى المنتجات التي لا تترك بقعًا باليود بين 10 و
20 دقيقة.

إذا كان وقت التحلل المائي أقل من 10 دقائق ، يتم تكرار التحديد ، مع أخذ مستخلص أقل ومياه أكثر للتحلل المائي. إذا لم ينتهي التحلل المائي في غضون 20 دقيقة ، فسيتم تكرار التحليل أيضًا ، مع أخذ المزيد من مستخلص الإنزيم وماء أقل لتحديده. كمية مستخلص الإنزيم التي يجب تناولها إعادة التحليل، محسوبة مع الأخذ بعين الاعتبار وقت التحلل المائي الذي تم الحصول عليه.

إذا كان مستخلص الإنزيم يحتوي على القليل أو الكثير جدًا نشاط عالي، وكمية محلول الإنزيم من 1 إلى 25 سم 3 لا توفر مدة التحلل المائي للنشا لمدة 10 ... 20 دقيقة ، ثم لا يتم أخذ 25 سم 3 من محلول النشا للتحليل ، ولكن أكثر أو أقل ، من أجل على سبيل المثال ، التعديل المقابل لـ صيغة الحساب(على التوالي 0.1 أو 0.4 بدلاً من 0.25 المعتاد).

يتم حساب قيمة نشاط التحلل النشواني لـ AS (وحدات / جم) بالصيغة:

حيث أن 0.25 هي كمية النشا الموجودة في 25 سم 3 من محلول 1٪ ، g ؛

60 - عامل التحويل لمدة ساعة واحدة ؛

N هي كمية الإنزيم المتضمن في التفاعل ، g أو cm 3 (يتم تحديد هذه القيمة مع مراعاة تركيز المستخلص الأولي والتخفيف اللاحق) ؛

T هو الوقت الذي يتحلل فيه النشا إلى منتجات غير ملوثة باليود ، دقيقة.

مثال.تم أخذ مستخلص إنزيمي للثقافة الهوائية للفطر لتحليله. تم تحضير محلول المخزون بمعدل 5 جم من الثقافة في 100 سم 3 من الماء المخزن. من المعروف أن هذه الثقافة نشطة للغاية ، لذلك تم إجراء تخفيف إضافي للمحلول الأولي: تم إحضار 20 سم 3 في دورق حجمي إلى 50 سم 3 بالماء المقطر ، ومن هناك تم أخذ 2 سم 3 للتحليل ، أنا. تم الحصول على تسلسل التربية التالي:

5 جم ← 100 سم 3 ← 20 سم 3 ← 50 سم 3 ← 2 سم 3.

استغرق الأمر 12 دقيقة لتحلل 0.25 نشا (25 سم 3 من محلول نشا 1٪) باستخدام محلول إنزيم التخفيف الأخير (2 سم 3). ثم سيكون التيار المتردد للثقافة الجافة بالهواء (وحدة / جم):

عند إعادة الحساب النشاط الأنزيميلا ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار تماما. مادة جافةتحضير الانزيم ومراعاة الرطوبة. يجب أن يتم الحساب وفقًا للصيغة:

,

حيث W هو المحتوى الرطوبي للثقافة أو التحضير.

^ 4.4 العمل المخبري "طريقة ويلستيتير
وتعريف فالدشميت-ليتز للمحلل البروتيني
نشاط الانزيم في التعديل "

تعتمد الطريقة على تحديد مجموعات الكربوكسيل الحرة في محاليل الكحول للأحماض الأمينية وعديد الببتيدات.

يتم التعبير عن النشاط (PS) بعدد ملليغرام من نيتروجين أمين ، والذي يتكون أثناء التحلل المائي لكمية معينة من محلول جيلاتين 5٪ بقيمة pH من 7.3 إلى 7.5 1 غرام من الدواء أو 1 سم 3 من محلول إنزيم لمدة ساعة عند درجة حرارة 40 درجة مئوية.

وحدة نشاط التحلل البروتيني هي كمية الإنزيم التي تشكل 1 مجم من النيتروجين الأمين في ساعة واحدة في ظل الظروف التجريبية المقبولة.

^ المواد والكواشف: 96 ٪ كحول إيثيلي ؛ 1٪ محلول ثيمول فثالين. 0.1 ن محلول هيدروكسيد الصوديوم ؛ الركيزة - محلول جيلاتين 5٪ ؛ مستخلص من النبات الذي تم تحليله.

تحضير المستخلص لتحديد نشاط التحلل البروتيني: توضع عينة من 0.25 جم من المادة النباتية في ملاط ​​خزفي وتُطحن لمدة 2.5 دقيقة مع 2.5 مل من محلول الفوسفات (درجة الحموضة = 7.3) ، ثم يتم ترشيح الكتلة.

تحضير محلول 5٪ من الجيلاتين (الركيزة): ينقع 5 جم من الجيلاتين مسبقًا في كوب زجاجي في 15 ... 20 سم 3 من الماء المقطر لمدة 20 ... 30 دقيقة. يُسكب البروتين المتورم في 20 ... 25 سم 3 من محلول عازل عند درجة حرارة 70 إلى 80 درجة مئوية ويخلط جيدًا بقضيب زجاجي. يُسكب الجزء المذاب في دورق حجمي بحجم 100 سم 3 ، ويضاف 20 ... 25 سم 3 أخرى من محلول منظم إلى الجزء غير المنحل ، وينقل المحلول الناتج مرة أخرى إلى نفس الدورق. يتم إحضار محلول الجيلاتين المبرد إلى 40 درجة مئوية إلى العلامة بمحلول عازل بنفس درجة الحرارة. يتم تخزين محلول الجيلاتين المحضر في الثلاجة عند درجة حرارة من 2 إلى 5 درجات مئوية ويستخدم للتحليل في غضون يومين. قبل التحليل ، يتم تسخين محلول الجيلاتين إلى درجة حرارة 40 درجة مئوية في حمام مائي.

معدات:قوارير مخروطية بحجم 200 إلى 250 مل ، قوارير حجمية بحجم 50 مل ، قضبان زجاجية ، ماصات ، سحاح ، ترموستات.

^ التقدم.إلى 10 سم 3 من محلول جيلاتين 5٪ بقيمة pH من 7.3 إلى 7.5 ، أضف 2 سم 3 من محلول إنزيم الاختبار واخذ على الفور 1 سم 3 من خليط التفاعل في دورق مخروطي بسعة 50 إلى 100 سم 3 ، حيث سبق صب 20 سم 3 96٪ الكحول الإيثيليو 0.2 سم 3 1٪ ثيمول فثالين. يتم معايرة العينة بـ 0.1 N NaOH حتى يظهر لون أزرق.

يتم وضع الخليط المتبقي من الجيلاتين مع محلول الإنزيم في ترموستات بدرجة حرارة 40 درجة مئوية للتحلل المائي. بعد 3 ساعات ، يؤخذ 1 سم 3 من خليط التفاعل في دورق آخر بسعة 50 إلى 100 سم 3 ، حيث يتم سكب 20 سم 3 من كحول الإيثيل 96٪ و 0.2 سم 3 من 1٪ ثيمول فثالين. يتم معايرة العينة كما في حالة متغير التحكم.

يتم حساب نشاط التحلل للبروتين PS وفقًا للصيغة:

,

حيث A هي كمية أمين النيتروجين المتراكمة أثناء التجربة من وسط التفاعل ، مل ؛

T هي مدة تحلل البروتين ، h ؛

P هو معامل يأخذ في الاعتبار التخفيف وإعادة الحساب لـ 1 غرام من الدواء أو 1 سم 3 من محلول إنزيم سائل.

يتم حساب قيمة A بالمعادلة:

,

حيث أ مقدار 0.1 ن من محلول هيدروكسيد الصوديوم المستخدم لمعايرة 1 سم 3 من العينة التجريبية ، سم 3 ؛

و k - نفس الشيء بالنسبة لعينة التحكم ؛

1.4 هو معامل تحويل كمية 0.1 ن من المحلول القلوي إلى ملليغرام من النيتروجين من الأحماض الأمينية وعديد الببتيدات ؛

ك - تصحيح عيار القلويات.

تحديد نشاط الكاتلاز

(وفقًا لـ A.N. Bach و A.I. Oparin)

إن أوكسيدوروكتازات هي فئة من الإنزيمات التي تحفز تفاعلات الأكسدة والاختزال. إن أكسدة المونومرات التي تشكلت أثناء تقويض البوليمرات هي عملية معقدة متعددة المراحل.

تتم عملية أكسدة المواد في الخلايا بشكل أساسي عن طريق فصل الهيدروجين (نزع الهيدروجين) أو فصل الإلكترونات ، أو عن طريق إضافة الأكسجين إلى جزيء المركب المؤكسد.

مستقبلات الهيدروجين لنزعات الهيدروجين هي NAD + و NADP و FAD و FMN ، بالنسبة لبعض أحماض الفلافين - الأكسجين (يطلق عليهم أوكسيديز) ، لاحتواء الهيم (البيروكسيدات والكتلاز) - H 2 O 2 (بيروكسيد الهيدروجين).

متقبلات وحاملات الإلكترون هي السيتوكرومات المحتوية على الهيم (البروتينات الدموية).

يشير Catalase (EC 1.11.1.6) إلى البروتينات الدموية ، ويحفز عملية تدمير بيروكسيد الهيدروجين ، السام للخلايا ، في الماء والأكسجين: 2 H 2 O 2 \ u003d 2 H 2 O + O 2.

بالنسبة للخلية الحية ، يعتبر بيروكسيد الهيدروجين سمًا قويًا ، لذلك توجد جميع الإنزيمات التي تشكل H 2 O 2 في البيروكسيسومات - وهي عضيات مغطاة بالغشاء. المستهلكون الرئيسيون لـ H 2 O 2 هم البيروكسيدات (EC 1.11.1.7.) ، التي تؤكسد الفينولات ، والأمينات ، وبعض المركبات الحلقية غير المتجانسة ، وركائز أخرى عن طريق نزع الهيدروجين ، ونقلها من الركائز إلى H 2 O 2 ، وتخفيضها إلى 2 H 2 O. جزيئات بيروكسيد الهيدروجين ، التي لم يطالب بها البيروكسيداز ، يتم تحييدها بواسطة الكاتلاز.

تعتمد طريقة تحديد نشاط الكاتلاز على تحديد كمية انقسام بيروكسيد الهيدروجين أثناء الحضانة مع الإنزيم. يتم تحديد كمية H 2 O 2 في خليط التفاعل بالمعايرة في بيئة حمضيةمحلول بتركيز برمنجنات البوتاسيوم 0.02 مول / لتر:

5 H 2 O 2 + 2KMnO 4 + 3H 2 SO 4 = 2MnSO 4 + K 2 SO 4 + 5O 2 + 8H 2 O

بناءً على معادلة التفاعل أعلاه ، يمكن حساب أن 1 مل من محلول بتركيز من برمنجنات البوتاسيوم 0.02 مول / لتر يتوافق مع 1.7 مجم (50 ميكرولتر) من بيروكسيد الهيدروجين.

تقدم. يتم طحن 2-3 جرام من البطاطس النيئة (أو غيرها من المواد النباتية الطازجة) بعناية في ملاط ​​مع رمل الكوارتز أو الزجاج. لتقليل التفاعل الحمضي ، يضاف كربونات الكالسيوم 3 عند طرف المبضع حتى يتوقف إطلاق فقاعات ثاني أكسيد الكربون. في عملية الطحن ، يضاف 40-50 مل من الماء في أجزاء صغيرة إلى الهاون. يتم نقل كتلة المسحوق كميًا إلى دورق حجمي سعة 100 مل ، مخفف بالماء حتى العلامة ويخلط. يُسمح للخليط بالوقوف لمدة 10-15 دقيقة ، وبعد التحريك ، يتم ترشيحه.

خذ قوارير مخروطية بسعة 150-200 مل وأضف إليها 20 مل من المرشح الذي تم الحصول عليه. تُغلى محتويات قارورة واحدة لمدة دقيقة واحدة وتُبرد إلى درجة حرارة الغرفة (تحكم). يحتوي دورق تجريبي آخر على إنزيم نشط. لمحتويات القوارير التجريبية والتحكمية ، أضف 20 مل من الماء و 3 مل من محلول مع جزء الشامل H 2 O 2 1٪. يتم خلط المحتويات جيدًا وتترك في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. في نهاية الحضانة ، يضاف 5 مل من محلول مع كسر كتلي من حامض الكبريتيك بنسبة 10٪ إلى كلتا القوارير ، ويخلط ويتم معايرة الفائض H 2 O 2 في كل دورق بمحلول بتركيز برمنجنات البوتاسيوم من 0.02 مول / لتر حتى يتشكل لون وردي لا يختفي لمدة دقيقة واحدة.

يتم التعبير عن نشاط الكاتلاز في ميكرو مول من بيروكسيد الهيدروجين المتحلل تحت تأثير الإنزيم لكل 1 جم من مادة الاختبار (أو 1 مجم من المستخلص منه) لمدة دقيقة واحدة. يتم الحساب وفقًا للصيغة:

أين X- نشاط الكاتلاز ، U / g ؛

(أ-ب)- الفرق بين أحجام المحلول بتركيز برمنجنات البوتاسيوم 0.02 مول / لتر ، والذي تم استخدامه لمعايرة عنصر التحكم (أ)وذوي الخبرة (ب)عينات ، مل ؛

تيهو عيار محلول برمنجنات البوتاسيوم المستخدم في المعايرة ؛

50 هو عامل التحويل لكل µmol H 2 O 2 ؛

100 هو الحجم الإجمالي للمستخلص المحضر ؛

م هي كتلة المادة المأخوذة للتحليل ، ز ؛

20 هو حجم المرشح المأخوذ للتحليل ، مل ؛

30 - وقت الحضانة ، دقيقة.

يتم تسجيل مبدأ التحديد وترتيب التحليل ونتائج التحليل.

يمكن أيضًا تحديد نشاط الكاتلاز من خلال حجم الأكسجين المنطلق بعد إضافة H 2 O 2 إلى الكائن قيد الدراسة.

يستخدم هذا المبدأ لتحديد نشاط الكاتلاز في الحليب ، معبرًا عنه برقم الكاتلاز ، وهو حجم الأكسجين (مل) الذي يتم إطلاقه في ساعتين عند 25 درجة مئوية من 5 ملغ من محلول مضاف إلى 15 مل من الحليب مع الكسر الكتلي لـ H 2 O 2 1٪. يطلق الحليب المستخلص من الحيوانات السليمة 0.7-2.5 مل من الأكسجين ، أي لا يزيد عدد الكاتلاز في الحليب الطبيعي عن 2.5. يحتوي الحليب الذي يتم الحصول عليه من الحيوانات المريضة (التهاب الضرع ، إلخ) واللبأ على عدد مرتفع من الكاتلاز ، يصل إلى 15.

الكواشف. ماء مقطرة؛ كربونات الكالسيوم (مسحوق) ؛ محلول بتركيز برمنجنات البوتاسيوم 0.02 مول / لتر ؛ المحاليل ذات الكسور الكتلية: بيروكسيد الهيدروجين 1٪ (10 مل من محلول مع كسر كتلي من H 2 O 2 30٪ مخفف بالماء حتى 300 مل) ، حمض الكبريتيك 10٪.

أسئلة الاختبار.

1. المسارات الرئيسية لأكسدة الركيزة في الخلية.

2. خصائص هيكل وعمل نازعات الهيدروجين NAD + المعتمدة على NADP.

3. خصائص هيكل وعمل نازعات الهيدروجين المعتمدة على FAD.

4. ما تسمى الإنزيمات oxidases؟ العوامل المساعدة لهم.

5. خصائص هيكل وعمل البيروكسيدات والكاتالاسات.

6. خصائص هيكل وعمل السيتوكرومات.

7. كيمياء وتشكيل وطرق معادلة بيروكسيد الهيدروجين في الخلايا.

8. طريقة تحديد نشاط الكاتلاز.

№	اسم موضوعات المختبر	عدد الساعات
	زراعة الكائنات الحية الدقيقة بطريقة السطح على وسط مغذي صلب.
	استخراج الأنزيمات المزروعة على السطح
	زراعة الكائنات الحية الدقيقة بطريقة عميقة
	تحديد نشاط الأميلاز الشعير.
	تحضير تحضير الإنزيم ومعالجة اللب
	تحديد مدى ملاءمة الجبن للحليب باختبار المنفحة
	تحديد التلوث الجرثومي للحليب
	دراسة تأثير المعالجة الحرارية على خواص الحليب.
	المجموع:

الانزيمات

الإنزيمات هي محفزات بيولوجية ذات طبيعة بروتينية ، تتكون من أي خلية حية ولها القدرة على تنشيط المركبات الكيميائية المختلفة.

ترتبط آلية عمل الإنزيمات ، مثل جميع المحفزات الأخرى ، بانخفاض طاقة التنشيط المطلوبة لمرور تفاعل كيميائي، وتوجيهها بطريقة ملتوية من خلال التفاعلات الوسيطة التي تتطلب طاقة تنشيط أقل بكثير. وهكذا ، فإن التفاعل AB A + B في وجود إنزيم يستمر على النحو التالي: AB + F → AVF ؛ AVF → A + VF ؛ WF → W + F. →

تنقسم جميع الإنزيمات إلى فئتين كبيرتين: مكون واحد ومكونان.

تشمل الفئة الأولى الإنزيمات التي تتكون فقط من بروتين له خصائص تحفيزية ، وتشمل الفئة الثانية إنزيمات تتكون من بروتين وجزء غير بروتيني مرتبط به ، ما يسمى بالمجموعة النشطة. غالبًا ما يستخدم مصطلح الإنزيم المساعد ، أو المجموعة الاصطناعية ، لتسمية المجموعات النشطة من الإنزيمات المكونة من عنصرين. في الإنزيمات أحادية المكون ، يتم تنفيذ دور المجموعات النشطة بواسطة مجموعات كيميائية معينة متضمنة في البروتين. تسمى هذه المجموعات بالمراكز النشطة أو المحفزة.

من خصائص الإنزيمات التي تختلف عن خصائصها محفزات غير عضوية، هي قابليتها الكبيرة - الاعتماد على عدد من التأثيرات: تركيز أيونات الهيدروجين ، ودرجة الحرارة ، وظروف الأكسدة والاختزال ، وتركيز بعض المركبات (المنتجات الأيضية) ، وأيونات المعادن ، إلخ.

والثاني جدا ميزة أساسيةيكمن العمل التحفيزي للإنزيمات في حقيقة أنها محددة بدقة ، أي أن عمل الإنزيمات موجه إلى روابط كيميائية محددة للغاية.

وفقًا لطبيعة عملها التحفيزي ، تنقسم الإنزيمات إلى ست فئات:

1) أكسدة الأكسدة أو إنزيمات الأكسدة والاختزال ؛

2) ترانسفير ، أي الإنزيمات التي تحفز النقل مجموعات مختلفةذرات من جزيء إلى آخر ؛

3) هيدروليسات تحفز تفاعلات تحلل ؛

4) اللييز - الإنزيمات التي تشق مجموعة أو أخرى من الركائز (وليس عن طريق التحلل المائي) مع تكوين رابطة مزدوجة ، أو العكس بالعكس ، تلتصق بالروابط المزدوجة ؛

5) أيزوميراز ، أي الإنزيمات التي تحفز تفاعلات الأزمرة مركبات العضوية;

6) ligases أو synthetases - تنتمي الإنزيمات التي تحفز التفاعلات الاصطناعية إلى هذه الفئة.

تنقسم كل فئة من هذه الفئات إلى فئات فرعية ، وهذه الأخيرة بدورها إلى مجموعات أصغر.

في جميع مراحل معالجة الحبوب إلى دقيق ، أثناء التخزين ، وكذلك أثناء تحضير العجين والخبز ، يتجلى نشاط الإنزيمات المتحللة بالماء والأكسدة بدرجة أكبر أو أقل ، والتي لها تأثير كبير على جودة المنتج.

في الحبوب ، توجد الإنزيمات في أنسجة الجنين وطبقة الألورون والسويداء. إنها سمة من سمات الأحياء زرع الخلاياالإنزيمات التي تحدد وظائف محددة في عمليات التمثيل الغذائي.

من بين العديد من الإنزيمات الموجودة في الحبوب ، فقط تلك التي لها أو يمكن أن يكون لها تأثير على جودة منتجات معالجة الحبوب قد خضعت لدراسة شاملة. وتشمل هذه الأميلاز ، البروتياز ، الليباز ، ليبوكسجيناز ، بوليفينول أوكسيديز ، إلخ. إلى جانب ذلك ، وجد أن بعض إنزيمات الحبوب يمكن أن تكون مؤشرات جيدة لحالتها الفسيولوجية. وبالتالي ، فإن الكاتلاز ، نظرًا لكونه شديد القابلية للحرارة ، يعكس بشكل جيد انخفاض الإنبات أثناء تجفيف حبوب البذور ، ويمكن أن يكون نشاطه بمثابة مؤشر للتحكم في عملية التجفيف.

كبير بشكل استثنائي الأهمية البيولوجيةالأميليز أثناء نضج وإنبات الحبوب ، وكذلك في عدد من العمليات التكنولوجيةالصناعات الغذائية ، والتي تقوم على التحولات المائية للنشا تحت تأثير الأميليز الحبوب.

تحتوي حبة الحبوب على إنزيمين محددين يحددان التحلل المائي للنشا وهما:

1) -1،4 - غلوكانهيدولاز أو ألفا أميليز ، تحلل مائي α-1،4 - روابط جلوكان من النشا والسكريات ذات الصلة ، ويتم كسر هذه الروابط بشكل عشوائي ؛

2) -1،4 - غلوكانمالتوهيدرولاز أو αβ - أميليز ، تحلل هيدروليزي α-1،4 - روابط جلوكان في السكريات ، يشق بالتتابع بقايا المالتوز من نهايات السلسلة غير المختزلة.

على الرغم من حقيقة أن البروتياز لا يقل أهمية بالنسبة للتكنولوجيا ، إلا أنها أقل دراستها من الأميليز. والسبب في ذلك هو أن الطرق الكلاسيكية لدراسة البروتياز من أصل حيواني (الإنزيمات التي تحلل البروتينات) تبين أنها غير فعالة في الدراسة. الإنزيمات المحللة للبروتينحبوب الحبوب. تحت تأثير البروتياز ، يحدث تسييل الغلوتين ، والذي بدوره يؤدي إلى تدهور جودة الخبز المخبوز.

تسبب الليباز التحلل المائي للدهون ، أي ينقسم استراتالجلسرين بتكوين أحماض دهنية حرة مما يؤدي إلى زيادة حموضة الحبوب والدقيق.

بمشاركة الليبوكسيجيناز ، تتأكسد الأحماض الدهنية غير المشبعة ، وتتشكل مركبات الكربونيل والكربوكسيل ذات الوزن الجزيئي المنخفض ، والتي تحتوي على رائحة كريهةوطعم مر. وتسمى هذه العملية نتانة الدهون (الدقيق).

العمل المخبري №1.

عنوان:زراعة الكائنات الحية الدقيقة بطريقة السطح على وسط مغذي صلب.

هدف:زيادة منتجي الإنزيمات المختلفة على وسائط حبيبية صلبة وتحليل الثقافات الناتجة عن نشاط الإنزيمات التي تحتوي عليها.

طريقة ثقافة السطح. يتم إجراء الزراعة السطحية للأيروبس على وسط كثيف أو فضفاض ، وكذلك في طبقة رقيقة من وسط سائل في الأواني الزجاجية ذات قاع عريض: أطباق بتري ، قوارير Winogradsky ، مراتب ، كوفيتات. تزرع أوعية البذور عند درجة حرارة ثابتة في منظمات الحرارة أو الغرف الحرارية (غرف الحرارة). تنمو الكائنات الدقيقة على سطح البيئة وتستخدم الأكسجين مباشرة من الهواء. على الوسائط السائلة ، تنمو الأيروبس الملزمة في شكل أفلام وفيرة. تتطور الأكياس الهوائية الاختيارية (اللاهوائية) في سمك الوسط السائل ، وتشكل المعلقات ، والرقائق ، والرواسب ، وعلى السطح في شكل غشاء رقيق. على وسط كثيف ، تنمو الكائنات الحية الدقيقة في شكل مستعمرات فردية أو عشب مستمر. زراعة السطح في ظروف المختبرتستخدم على نطاق واسع للحصول على التراكمي و ثقافات نقية، وتخزينها ، ودراسة الخصائص المورفولوجية والثقافية والبيوكيميائية للكائنات الحية الدقيقة. في الصناعة ، تُستخدم طريقة المزارع السطحية على الوسائط السائلة للحصول على حامض الستريك ، على وسائط فضفاضة - لإنتاج مستحضرات الإنزيم.

1. تحضير الأطباق وتعقيمها.

2. تحضير وسط المغذيات وتعقيمه.

3. حساب كمية الماء اللازمة لترطيب وسط المغذيات.

4. ترطيب وسط غذائي معقم ، تلقيحه وتخطيطه في كوات للزراعة ؛

1. تحضير الأطباق للتعقيم. يجب غسل جميع الأواني جيدًا وتجفيفها في الفرن قبل التعقيم.

للتعقيم ، يجب تغليف العناصر التالية بالورق وربطها بعناية بخيوط: كفيت ، غطاء للحاوية.

يجب إجراء تعقيم الأطباق والماء في الأوتوكلاف عند درجة حرارة 120 درجة مئوية لمدة 0.5 ساعة.

يجب تجفيف الأطباق المعقمة بعد التعقيم في فرن عند 105 درجة مئوية ، حيث يتم ترطيب الورق قليلاً أثناء التعقيم.

2. تحضير وتعقيم الوسط الغذائي. يتم تحضير وسط غذائي خاص لكل كائن حي ، والذي يضمن التركيب الحيوي لبعض الإنزيمات ، ويتم تعقيم الوسط الخاص بكل كفيت على حدة. يتم وضع الوسط المحضر إما في كيس أو منديل شاش متعدد الطبقات أو في دورق زجاجي عريض. بالنسبة إلى Asp. oryzae ، على سبيل المثال ، يتم استخدام المتغيرات التالية لوسائط المغذيات: نخالة القمح -100.70 ؛ براعم الشعير - 30 ؛ لب البنجر - 50 ؛ ثفل العنب - 20 ؛ براعم الشعير - 50 ؛ قشر الأرز -50.

3. ل التطور الطبيعيالفطريات المجهرية والتكوين المكثف للإنزيمات ، من الضروري أن تكون درجة الرطوبة في البيئة 58-63٪.

يتم حساب كمية المياه المضافة وفقًا للبيانات التالية:

Acp هي كتلة وسيط المغذيات مع محتوى الرطوبة الأولي ؛

Cav هي كتلة وسيط المغذيات مع محتوى الرطوبة المطلوب ؛

Gav هي كتلة وسط المغذيات بعد التعقيم ؛

D هي كمية الماء التي يجب إضافتها للحصول على وسط غذائي للرطوبة المطلوبة.

معمل رقم 2

عنوان:استخراج الأنزيمات المزروعة على السطح

هدف:القدرة على زراعة الكائنات الحية الدقيقة بطريقة السطح على وسط المغذيات الصلبة.

طريقة استخراج ثقافة السطح. يتم إجراء الزراعة السطحية للأيروبس على وسط كثيف أو فضفاض ، وكذلك في طبقة رقيقة من وسط سائل في الأواني الزجاجية ذات قاع عريض: أطباق بتري ، قوارير Winogradsky ، مراتب ، كوفيتات. تزرع أوعية البذور عند درجة حرارة ثابتة في منظمات الحرارة أو الغرف الحرارية (غرف الحرارة). تتطور الكائنات الحية الدقيقة على سطح البيئة وتستخدم الأكسجين مباشرة من الهواء. على الوسائط السائلة ، تنمو الأيروبس الملزمة في شكل أفلام وفيرة. تتطور الأكياس الهوائية الاختيارية (اللاهوائية) في سمك الوسط السائل ، وتشكل المعلقات ، والرقائق ، والرواسب ، وعلى السطح في شكل غشاء رقيق. على وسط كثيف ، تنمو الكائنات الحية الدقيقة في شكل مستعمرات فردية أو عشب مستمر. تُستخدم الزراعة السطحية في ظل ظروف معملية على نطاق واسع للحصول على ثقافات مخصبة ونقية ، وتخزينها ، ودراسة الخصائص المورفولوجية والثقافية والكيميائية الحيوية للكائنات الحية الدقيقة. في الصناعة ، تُستخدم طريقة الاستنبات السطحي على الوسائط السائلة للحصول على حامض الستريك ، في المزارع السائبة - لإنتاج مستحضرات الإنزيم.

في هذا العمل المخبري ، من الأنسب استخدام الفطريات المجهرية أو الكائنات الحية الدقيقة الشبيهة بالخميرة ، مثل Asp niger. Rh. ديليمار إلخ.

معمل # 3

عنوان:زراعة الكائنات الحية الدقيقة بطريقة عميقة.

هدف:أن تكون قادرًا على زراعة الكائنات الحية الدقيقة بطريقة عميقة.

زراعة عميقة. يمكن أن تكون الزراعة العميقة للكائنات الحية الدقيقة دورية ومستمرة. في عملية دفعية ، يتم تلقيح الحجم الكامل لوسط المغذيات باللقاح ويتم الزراعة في ظل الظروف المثلى لفترة زمنية معينة حتى الكمية المناسبةالكتلة الحيوية أو المنتج المستهدف. لضمان نمو المزارع الهوائية في الطبقات العميقة للسائل ، من الضروري توفير الأكسجين. بما أن الخلايا الميكروبية قادرة على استخدام الأكسجين المذاب فقط ، وقابلية ذوبانها منخفضة (4-7 مجم / جم)

بسيط و طريقة يسهل الوصول إليهاالزراعة المغمورة الدورية هي زراعة ثقافات هوائية في حالة معلقة في وسط سائل يُسكب بكميات صغيرة في أنابيب وقوارير اختبار.

يتم إجراء الزراعة العميقة المستمرة في المخمرات المخمرة. تتم عملية الزراعة المستمرة في المخمر وفقًا لنوع ناظم كيميائي أو تربيدوستات.

الغرض من هذا العمل هو تنمية منتجي الإنزيمات المختلفة على وسائط المغذيات السائلة بالطريقة العميقة وتحليل الثقافات التي تم الحصول عليها من الكائنات الحية الدقيقة لمحتوى بعض الإنزيمات فيها.

كما هو الحال في العمل المختبري الأول ، من الضروري تحديد اللقاح ، والذي يتم تحضيره من خلال نمو المنتج في عدة ممرات على وسائط أجار في أنابيب الاختبار أو المراتب.

في العمل المخبري ، يقوم الطالب بتحضير 0.7 dm 3 من وسط المغذيات. في البداية ، يتم وزن الدورق على المقاييس الفنية ، ثم يتم وزن جميع المكونات الضرورية للوسط في الدورق. تقاس المكونات السائلة للوسط بالحجم.

تذوب الأملاح دون احتياطات خاصة. يخلط النشا أو الدقيق بنسبة 1:10 مع ماء باردويخمر في حمام مائي مغلي.

متغيرات وسائط المغذيات لزراعة الكائنات الحية الدقيقة - منتجي الإنزيمات.

الجدول 1

مكونات وسط الثقافة	متغيرات وسائط المغذيات ومحتوى المكونات ،٪
آسيا والمحيط الهادئ. اوريزي	0,3
مستخلص الذرة	0,3	0,4	2,0
دقيق الصويا	0,5	4,0	2,0
دقيق الذرة	2,0	-	0,5
خميرة العلف	-	-	0,2
كربونات الكالسيوم	-	0,1	0,2
رماد. بتاتي	1,0
المرشح المتعثر الكحولي	98,3	96,8	-
نشا الذرة	1,5	-	0,2
المغنسيت الفني	0,2	0,2	1,5
دقيق الجاودار	-	2,5	1,0
مستخلص الذرة	0,2	0,5	1,0

لكل خيار ، يتم أخذ أربعة قوارير ، يتم سكب 120 سم 3 من الوسط المحضر في كل منها. يتم إغلاق القوارير بسدادات قطنية ، وتغطى السدادات بأغطية ورقية سميكة حتى لا يتم ترطيبها أثناء التعقيم. بالتزامن مع قوارير التأرجح ، يتم وضع قارورة بقطر 50 سم 3 من الوسط للتعقيم لتحديد درجة الحموضة لاحقًا.

تعريفات متوسطة لدرجة الحموضة

يتم تحديد الأس الهيدروجيني للوسيط بالطريقة الكهربية مرتين: قبل التعقيم وبعده ، في كل مرة يتم إجراء ثلاث تكرارات لهذه التحديدات ثم تحليل موثوقية هذه النتائج.

تلقيح وسط المغذيات

بعد اكتمال التعقيم وفتح الأوتوكلاف ، يتم وضع الماصات لمدة 10-15 دقيقة. في فرن ساخن لتجفيف الورق ، تُترك القوارير والأطباق الأخرى في الأوتوكلاف لمدة 10-15 دقيقة. يتم تلقيح وسط المغذيات في صندوق.

معمل # 4

تحديد نشاط الكاتلاز

ينتمي Catalase إلى الفئة الأولى من الإنزيمات (oxidoreductases) ويحفز تحلل بيروكسيد الهيدروجين إلى ماء وأكسجين وفقًا للمعادلة:

مسرحيات كاتالاز دورا هامافي النشاط الحيوي للكائنات الحية ، حيث يدمر بيروكسيد الهيدروجين ، وهو مادة سامة للخلايا ويتكون أثناء التنفس.

يعتمد التحديد الكمي للكتلاز على حساب بيروكسيد الهيدروجين عن طريق معايرته ببرمنجنات البوتاسيوم. يسير التفاعل وفقًا للمعادلة:

2KMnO 4 + 5H 2 O 2 + 4H 2 SO 4 2KHSO → 4 + 2MnSO 4 + 8H 2 O + 5O 2

يتم الحكم على كمية بيروكسيد الهيدروجين التي دمرها الإنزيم من خلال الفرق بين كميات 0.1 مول / DM 3 محلول KMnO 4 المستخدم للمعايرة في تجارب التحكم والعمل.

مادة الاختبار:الشعير (حبوب تنبت)

الكواشف:محلول بيروكسيد الهيدروجين ω (H 2 O 2) = 1٪

محلول حامض الكبريتيك ω (H 2 SO 4) = 10٪

محلول برمنجنات البوتاسيوم C (1/5 KMnO 4) = 0.1 مول / دسم 3

يتم نقع 5 جم من مادة الاختبار في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة مع 100 سم 3 من الماء ، مع تحريك محتويات القارورة بشكل دوري. بعد التسريب ، يتم ترشيح السائل من خلال مرشح مطوي جاف ويتم أخذ جزأين 20 سم 3 لكل منهما (واحد تجريبي وآخر تحكم) من محلول واضح مع ماصة ويتم نقل كل منهما إلى دورق مخروطي منفصل بطول 200 سم 3. يغلي عنصر التحكم لمدة 3 دقائق لتعطيل الإنزيم.

يضاف 20 سم 3 من الماء المقطر ، 4 سم 3 من بيروكسيد الهيدروجين إلى العينات التجريبية والمراقبة ، ويترك لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة حتى يعمل الإنزيم. بعد 20 دقيقة ، يتم إضافة 5 سم 3 من حمض الكبريتيك إلى العينات ، ويتم معايرة بيروكسيد الهيدروجين المتبقي (غير المتحلل) بمحلول برمنجنات البوتاسيوم.

يتم التعبير عن نشاط الكاتلاز بالميكرومولات من بيروكسيد الهيدروجين المتحلل تحت تأثير الإنزيم في دقيقة واحدة لكل 1 جرام من مادة الاختبار.

يتم تحديد نشاط Catalase بواسطة الصيغة:

حيث X هو نشاط الكاتلاز ؛

أ - كمية 0.1 مول / ديسيمتر 3 من محلول KMnO 4 المستخدم لمعايرة محلول التحكم ، سم 3 ؛

ب - كمية 0.1 مول / DM 3 محلول KMnO 4 المستخدم لمعايرة محلول الاختبار ، سم 3 ؛

ك - تصحيح العيار ؛

100 هو الحجم الكلي للمستخلص ، سم 3 ؛

50 هو عامل التحويل للميكرومولات من H 2 O 2 ؛

20- حجم محلول الإنزيم ، سم 3 ؛

20 - وقت رد الفعل الأنزيمي ، دقيقة ؛

ف - عينة من مادة الاختبار المأخوذة للتحليل ز.

العمل المخبري №5.

طريقة القياس اللوني لتحديد نشاط α- و β-amylase

تحت تأثير الأميليز في النباتات ، يحدث التحلل المائي للكربوهيدرات عالية البوليمر - النشا - مع تكوين الدكسترين والمالتوز. في النباتات ، تم العثور على الأميليز ألفا وبيتا.

يعتمد التحديد الكمي المنفصل لنشاط الأميليز ألفا وبيتا على ثباتهما الحراري المختلف: يتم تدمير الأميليز بالتسخين إلى 70 درجة مئوية ، بينما يحتفظ ألفا أميليز بنشاطه.

تعتمد طرق تحديد نشاط الأميليز إما على مراعاة كمية السكر المتكون أثناء عمل الإنزيم على النشا ، أو على مراعاة كمية النشا التي لم تتحلل بفعل الإنزيم ، والتي يتم تحديدها ضوئيًا بعد العلاج باستخدام محلول اليود.

الكواشف:عازلة خلات درجة الحموضة 5.5 ؛

محلول كلوريد الصوديوم ω (ناكل) = 1٪ ؛

محلول النشا ω \ u003d 10٪ (2 جم من النشا مختلطة في 20 سم 3 ماء بارد، تُسكب في 80 سم 3 من الماء المغلي ، وبعد ذلك يتم تسخينها في حمام مائي مغلي حتى يصبح المحلول واضحًا) ؛

المحلول حمض الهيدروكلوريك C (HCl) = 1 مول / دسم 3

محلول حمض الهيدروكلوريك C (HCl) \ u003d 0.1 مول / دسم 3

محلول اليود ω = 0.3٪ في محلول 3٪ من يوديد البوتاسيوم.

يتم طحن جزء من 0.5 - 1 جم من الدقيق أو الشتلات في ملاط ​​بكمية صغيرة من محلول كلوريد الصوديوم بنسبة 1 ٪ ويتم نقله إلى دورق مخروطي بحجم 50 سم 3. النسبة بين العينة ومحلول كلوريد الصوديوم هي 1:10 أو 1:20. يتم خلط محتويات القارورة جيدًا وتترك لتقف في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ، مع الاهتزاز من حين لآخر. ثم يتم تصفيتها من خلال مرشح كثيف مطوي. عندما يكون الترشيح صعبًا ، يمكن الجمع بين الترشيح والطرد المركزي عند 4000-5000 دورة في الدقيقة. يستخدم محلول واضح كمستحضر إنزيم.

لتحديد نشاط α- و β-amylase ، يتم أخذ 4 أنابيب اختبار (2 تجريبي و 2 تحكم) وإضافة 3 سم 3 من محلول الأسيتات و 3 سم 3 من محلول نشا 2٪. يسخن الخليط في حمام مائي أو في ترموستات حتى 40 درجة مئوية. بعد ذلك ، يضاف 0.2-1.0 سم 3 من مستحضر الإنزيم إلى أنابيب الاختبار (اعتمادًا على نشاط الأميليز في موضوع الدراسة) ، وتضاف نفس الكمية من H 2 O إلى أنابيب التحكم. يتم خلط الأنابيب ووضعها في منظم حرارة عند 40 درجة مئوية لمدة 30 أو 60 دقيقة. بعد الحضانة ، يتم سكب 2 سم 3 1 نيوتن على الفور في كل أنبوب اختبار. محلول حمض الهيدروكلوريك لوقف عمل الأميلاز.

للكشف عن النشا غير المتفاعل مع الإنزيم ، يتم إجراء تفاعل مع اليود. يصب حوالي 30 سم 3 من الماء في قوارير حجمية لكل 50 سم 3 ، 1 سم 3 0.1 ن. حمض الهيدروكلوريك ، 5 قطرات من 0.3٪ محلول اليود وإضافة 0.5 سم 3 من الخليط من كل أنبوب. يتم خلط محتويات القوارير جيدًا ، ويتم إحضارها إلى العلامة بالماء والقياس اللوني على مقياس الألوان الكهروضوئي مع مرشح الضوء الأحمر أو على مقياس الطيف الضوئي عند 595 نانومتر في كفيت بطول تشغيل يبلغ 1 سم.

لتحديد نشاط α-amylase ، يُسكب 5 سم 3 من المرشح (تحضير الإنزيم) في دورق مخروطي مقاس 100 سم 3 ، وتُضاف أسيتات الكالسيوم الجافة عند طرف السكين وتُحفظ لمدة 15 دقيقة في مرموستات فائقة البرودة أو في حمام مائي عند 70 درجة مئوية (لا يسمح بتقلبات درجة الحرارة بأكثر من 0.5 درجة مئوية). ثم يتم تبريد محتويات القارورة بسرعة في وعاء من الماء البارد. مع مثل هذا التسخين ، يتم تعطيل am-amylase تمامًا ، ويحتفظ α-amylase بنشاطه. علاوة على ذلك ، يتم تقليل تحديد نشاط α-amylase إلى الإجراء الموصوف أعلاه.

يتم التعبير عن عمل كلا الإنزيمين بالملليجرامات من النشا المتحلل تحت ظروف تجريبية (لمدة 30 دقيقة أو ساعة واحدة) لكل 1 جرام من الدقيق (البراعم). يتم تحديد نشاط am-amylase من خلال الفرق بين النشاط الكلي لـ α- و β-amylases ونشاط α-amylase. يتم حساب نشاط الأميليز لكل 1 جرام من الدقيق لمدة ساعة باستخدام الصيغة التالية:

حيث D هي الكثافة الضوئية لمحلول التحكم ؛

D 1 - الكثافة البصرية لمحلول الاختبار ؛

أ - كمية النشا المضافة (60 مجم) ؛

م - وزن العينة ، ز ؛

V هو حجم مستخلص الإنزيم الأولي ، سم 3

الخامس 1 - حجم المستخلص المأخوذ للحضانة ، سم 3.

معمل # 6

© 2015-2019 الموقع
جميع الحقوق تنتمي إلى مؤلفيها. لا يدعي هذا الموقع حقوق التأليف ، ولكنه يوفر الاستخدام المجاني.
تاريخ إنشاء الصفحة: 2016-02-13

معمل رقم 1

الموضوع: النشاط التحفيزي للإنزيمات في الخلايا الحية

استهداف:تحديد الوظيفة التحفيزية للبروتينات في الخلايا الحية ، وتكوين معرفة حول دور الإنزيمات في الخلايا ، وتعزيز القدرة على العمل بالمجهر ، وإجراء التجارب وشرح نتائج العمل. معدات:البطاطس النيئة والمسلوقة ، أوراق Elodea (نبات آخر) ، محلول بيروكسيد الهيدروجين الطازج 3٪ ، أنابيب اختبار ، ملاقط ، رمل ، ملاط ​​ومدقة ، دفتر ملاحظات ، قلم ، قلم رصاص ، مسطرة.

تقدم:

تحضير أنبوبين اختبار ، وضع بعض الرمل في الأول ، وقطعة من البطاطس النيئة في الثانية ، وقطعة من البطاطس المسلوقة في الثالثة ، وإسقاط القليل من بيروكسيد الهيدروجين في كل أنبوب من أنابيب الاختبار. لاحظ ما سيحدث في كل من أنابيب الاختبار.

طحن قطعة من البطاطس النيئة بكمية قليلة من الرمل في الهاون.

انقل البطاطس المهروسة مع الرمل إلى أنبوب اختبار وقم بإسقاط القليل من بيروكسيد الهيدروجين.

قارن بين نشاط الأنسجة النباتية الكاملة المسحوقة.

قم بعمل جدول يوضح نشاط كل نسيج تحت العلاجات المختلفة. اشرح نتائجك. أجب على الأسئلة:

ملاحظات

بيروكسيد الهيدروجين والبطاطا النيئة

يتم إطلاق الأكسجين ، ويتم تكسير البروتين الهيكل الأساسيويتحول إلى رغوة

بيروكسيد الهيدروجين والبطاطس المسلوقة

لا رد فعل

أجب عن الأسئلة: في أي أنابيب اختبار ظهر نشاط إنزيم الكاتلاز؟ اشرح السبب.

الكاتلاز هو إنزيم يحفز تحلل بيروكسيد الهيدروجين في الماء والأكسجين الجزيئي: H2O2 + H2O2 = O2 + 2H2O. الدور البيولوجييتكون K. في تحلل بيروكسيد الهيدروجين ، والذي يتكون في الخلايا نتيجة لعمل عدد من أوكسيديز بروتين الفلافوبروتين (زانثين أوكسيديز ، أوكسيديز الجلوكوز ، أوكسيديز أحادي الأمين ، وما إلى ذلك) ، وتوفير حماية فعالة هياكل الخلايامن التدمير بواسطة بيروكسيد الهيدروجين. قصور محدد وراثيا لـ K. هو أحد أسباب ما يسمى acatalasia ، وهو مرض وراثي يتجلى سريريًا عن طريق تقرح الغشاء المخاطي للأنف والفم ، والذي يظهر أحيانًا تغييرات ضمورية في الحاجز السنخي ، وفقدان الأسنان. ظهر النشاط في 1.3 أنبوب اختبار ، tk. كان لديهم أطعمة نيئة تحتوي على بروتينات. وفي باقي أنابيب الاختبار ، كانت هناك منتجات تحتوي على بروتين تم تدميره أثناء عملية الطهي ولم يظهر التفاعل نفسه. لذلك ، يمتص الجسم بشكل أفضل عن طريق الأطعمة التي تحتوي على البروتين.

كيف يتجلى نشاط الإنزيم في الأنسجة الحية والميتة؟اشرح الظاهرة المرصودة. في الأنسجة الميتة ، نشاط الإنزيم غائب بسبب. تم تدمير البروتين الموجود فيها أثناء الطهي. وفي الأنسجة الحية ، عند التفاعل مع بيروكسيد الهيدروجين ، تم إطلاق الأكسجين ، وتحول البروتين ، الذي ينقسم إلى الهيكل الأساسي ، إلى رغوة.

كيف يؤثر طحن الأنسجة على نشاط الإنزيم في الأنسجة الحية للنباتات والحيوانات؟عند طحن الأنسجة الحية ، يكون رد الفعل أسرع ، لأن. تزداد مساحة التلامس بين البروتين وبيروكسيد الهيدروجين ، كيف تقترح قياس معدل تحلل بيروكسيد الهيدروجين؟ v = kc (a) c (b) حيث v هو معدل التفاعل الكيميائي k هو ثابت المعدل c هو التغير في التركيز. هل تعتقد أن جميع الكائنات الحية تحتوي على إنزيم الكاتلاز الذي يحلل بيروكسيد الهيدروجين؟

برر الجواب. نظرًا لأن هذا إنزيم من فئة أوكسيدوروكتاز ، فإنه يحفز تحلل بيروكسيد الهيدروجين ، وهو مادة سامة للخلايا الحية ، في الماء والأكسجين. وجدت في الجسيمات. يمكن الاستنتاج أنه موجود في جميع خلايا الكائنات الحية. اشرح ملاحظاتك. صياغة الاستنتاج.

الخلاصة: يوجد البروتين فقط في الأطعمة الحية ، وفي الأطعمة المطبوخة يتم تدمير البروتين ، لذلك لا يحدث أي تفاعل معها. إذا قمت بطحن المنتجات ، فسيحدث التفاعل بشكل أسرع.

مقدمة

يهدف هذا الدليل إلى تعريف الطلاب بالطرق الكلاسيكية لدراسة الإنزيمات والطرق الحديثة شديدة الحساسية. طرق تحليليةباستخدام الإنزيمات كأدوات بحث. يتكون الدليل من خمسة أقسام:

1. طرق تحديد نشاط الإنزيمات.

2. دراسة البارامترات الحركية للتفاعلات الأنزيمية.

3. طرق عزل وتنقية الانزيمات.

4. دراسة توطين الأنزيمات تحت الخلوية.

5. استخدام الإنزيمات ككواشف تحليلية.

جميع أقسام "الممارسة" لها مهام مستقلةومع ذلك ، تظل متطلبات الطلاب كما هي. كل عمل مقترح صغير دراسة الطيار. عند تنفيذ أي منها ، يجب على الطالب إعداد جميع الحلول اللازمة بشكل مستقل وإتقان طرق البحث اللازمة وإجراء تجربة ووضع النتائج في شكل تقرير يوضح البيانات التي تم الحصول عليها من خلال الجداول والرسوم البيانية.

المستوى المستخدم التقنيات المنهجيةيتوافق مع المتطلبات العلم الحديث. إذا لزم الأمر ، يقدم وصف العمل موجزًا المعلومات النظرية. تم تنفيذ جميع الأعمال المدرجة في "ورشة العمل" بشكل متكرر من قبل الطلاب.

العمل 1. قياس نشاط الكاتلاز بالمعايرة

المعدات والكواشف: حمام الماء المغلي. ماصات 5 و 10 و 20 و 25 مل ؛ قياس الاسطوانات مع الأنف لمدة 10 و 25 مل ؛ 100 مل دورق حجمي. 200 مل قوارير مخروطية هاون ومدقة الخزف. برمنجنات البوتاسيوم (0.1 ن) ؛ حامض الكبريتيك(عشرة في المائة) ؛ كربونات الصوديوم؛ بيروكسيد الهيدروجين (0.1 ن) ؛ مواد نباتية طازجة (بطاطس أو جزر).

يتم طحن 2 جرام من البطاطس النيئة (أو الجزر) في ملاط ​​، مع إضافة 2-3 مل من الماء تدريجياً. لتقليل تفاعل الحمض ، أضف كربونات الصوديوم عند طرف الملعقة حتى تتوقف الفقاعات ثاني أكسيد الكربون. يتم نقل كتلة المسحوق كميًا إلى دورق حجمي وتعديلها بالماء إلى حجم 100 مل. يُترك الخليط لمدة 30 دقيقة ، وبعد ذلك يتم ترشيحه. بعد ذلك ، يتم تحديد النشاط وفقًا للمخطط (عينتان تجريبية وعينة تحكم 2):

تتم معايرة الخبرة والتحكم بـ 0.1 ن. محلول برمنجنات البوتاسيوم (حتى يستقر اللون الوردي الباهت لمدة دقيقة واحدة). ويلاحظ مقدار محلول برمنجنات البوتاسيوم المستخدم لمعايرة باقي بيروكسيد الهيدروجين (بعد التحلل الأنزيمي) في قارورة الاختبار ولمعايرة كل بيروكسيد الهيدروجين في قارورة التحكم. يتم استخدام الفرق بين المعايرة التجريبية والمعايرة الضابطة لإيجاد كمية البرمنجنات المكافئة لكمية بيروكسيد الهيدروجين المتحللة بواسطة الإنزيم.

يتم الحساب وفقًا لمعادلة التفاعل:

5H2O2 + 2KMnO4 + 3H2SO4> 2MnSO4 + K2SO4 + 5O2 + 8H2O ،

وفقًا لذلك ، فإن 1 مل من محلول 0.1 ن من برمنجنات البوتاسيوم يتوافق مع 1.7 ملغ من بيروكسيد الهيدروجين.

مثال الحساب: تم ​​تحضير مستخلص الكاتلاز بحجم 100 مل من 1.25 جم من الجزر: تم إنفاق 15.5 مل على معايرة العينة التجريبية ، واستخدم 30.2 مل من عينة التحكم مع محلول 0.1 نيوتن من برمنجنات البوتاسيوم. كمية بيروكسيد الهيدروجين المتحلل في العينة تعادل (30.2 - 15.5) 14.7 مل من 0.1 ن. محلول برمنجنات البوتاسيوم وبالتالي يساوي (14.7 1.7) 24.99 مجم. هذا يعني أن 1 جرام من الجزر النيء يحتوي على كمية الكاتلاز التي يمكن أن تتحلل = 99.96 مجم من بيروكسيد الهيدروجين ، ولمدة دقيقة واحدة - (99.96: 30) 3.33 مجم. بما أن 1 ميكرو مول من بيروكسيد الهيدروجين هو 0.034 مجم ، فإن 1 جرام من الجزر يحتوي على (3.33: 0.034) 100 وحدة من الكاتلاز.

1. احسب محتوى الكاتلاز في مادة الاختبار.

2. اكتب الاسم المنهجي لهذا الإنزيم ورمزه وفقًا للفهرس النظامي ووصف دوره البيولوجي.