Ензимите са протеинови катализатори за биохимични реакции, повечето откоето при липса на ензима би протекло изключително бавно. За разлика от химическите катализатори, всеки ензим може да катализира само много малък брой реакции, често само една.

По този начин ензимите са специфични за реакцията катализатори. Почти всички биохимични реакции се катализират от ензими.

Много ензими имат каталитичен ефект върху субстратите само в присъствието на специфично термостабилно нискомолекулно органично съединение, коензим.

В такива случаи холоензимът (каталитично активен комплекс) се състои от апоензим (протеинова част) и свързан коензим (Приложение H). Коензимът може да бъде свързан с апоензима чрез ковалентни и нековалентни връзки. Терминът "простетична група" се отнася до ковалентно свързан коензим. Реакциите, изискващи наличието на коензим, включват: редокс, групов трансфер, изомеризация и реакции на кондензация (според системата IUB това са класове 1, 2, 5, 6). Реакциите на разцепване протичат в отсъствието на коензими (според системата IUB това са класове 3 и 4).

^ 4.1 Лабораторна работа„Определяне на амилазна активност
малц по метода на Волгемут

Методът на Wohlgemuth се основава на определяне на минималното количество ензим, способен да хидролизира напълно 1 ml 0,1% разтвор на нишесте при определени условия. Амилазната активност на малца се изразява като брой милилитри от 0,1% разтвор на нишесте, които могат да бъдат хидролизирани с 1 ml екстракт от малц при температура 38 ° C за 30 минути. Нормалната активност на амилазата е от 160 до 320 единици активност.

Методът на Wohlgemuth се използва широко в клиничната практика за определяне на амилазната активност на кръвта и урината, в пивоварството - за определяне на амилазната активност на малца. Рязко повишаване на активността на амилазата в кръвта и урината (10-30 пъти) се наблюдава при остър панкреатит, тумори на панкреаса.

^ Материали и реактиви: екстракт от зърнен малц, разреден 10 пъти; 0,1% разтвор на нишесте; 0,1% разтвор на йод в 0,2% разтвор на калиев йодид.

Оборудване:стелаж с епруветки, пипети, капкомери, термостат.

^ Напредък.Налейте 1 ml дестилирана вода в десет епруветки. В първата епруветка се добавя 1 ml 10 пъти разреден екстракт, разбърква се, 1 ml от сместа се прехвърля във втората епруветка. Съдържанието на тази епруветка се смесва отново и 1 ml се прехвърля в третата епруветка и така до десетата епруветка. От последната епруветка се взема 1 ml и се изхвърля. Така във всяка следваща епруветка съдържанието на ензим е два пъти по-малко от предишната. Разреждането на екстракта в десет епруветки ще бъде: 1:10; 1:20; 1:40; 1:80; 1:160; 1:320; 1:640; 1:1280; 1:2560; 1:5120; 1:10240.

След това към всички епруветки се добавят 1 ml вода и 2 ml разтвор на нишесте, смесват се и се поставят в термостат при температура 38 °C за 30 минути. След инкубиране епруветките се охлаждат вода от чешматаза да спрете действието на ензима, добавете две капки йоден разтвор, разклатете добре и наблюдавайте промяната на цвета. При реакция с йод течността става жълта, розова и лилава.

Отбелязвайки при какво е настъпило размножаването пълна хидролизанишесте с минимално съдържание на ензими (епруветка с жълтеникав цвят на съдържанието), амилазната активност на екстракта се изчислява от количеството неразреден екстракт (А) в тази епруветка
(Един ml от екстракта разгражда X ml от 0,1% разтвор на нишесте).

Например, жълтосе появи в четвъртата епруветка, където екстрактът беше разреден 160 пъти. Това количество екстракт е в състояние да хидролизира 2 ml 0,1% разтвор на нишесте, а 1 ml неразреден екстракт хидролизира 320 ml при същите условия: X = 2 × 160/1. Следователно активността на амилазата е 320.

^ 4.2 Лабораторна работа „Определяне на активността на каталазата

от Бах"

Методът се основава на определяне на количеството водороден пероксид, оставащ след действието на каталазата върху него, чрез титруване на разтвор на KMnO 4 върху него. Реакцията протича съгласно уравнението

1 ml от 0,1 mol/l разтвор на калиев перманганат съответства на 85 mg водороден прекис.

^ Материали и реактиви: каталазен препарат (1 g кълнове от ечемичен малц се смилат в порцеланов хаван с 6 ml фосфатен буфер и се филтрират); 10% разтвор на H2SO4; 0,1% разтвор на водороден прекис във фосфатен буфер, pH=7,0 (35,0 ml 0,2 mol/l NaH2PO4 в 13,6 ml 0,2 mol/l NaH2PO4); 0,1 mol/l разтвор на KMnO 4 .

Оборудване:Колби от 100 ml, пипети, бюрети, термостат.

^ Напредък. 2 ml от каталазния препарат се добавят към две колби, 1 ml 10% разтвор на H 2 SO 4 се добавя към една от тях (проба), след това 2 ml разтвор на водороден пероксид се излива във всяка колба, поставена в термостат за 40 минути при температура 38 °C. След времето за инкубация, 1 ml от 10% разтвор на H 2 SO 4 се добавя към втората колба (контрола) и двата разтвора се титруват с 0,1 mol/l разтвор на KMnO 4, докато се появи устойчиво розово оцветяване от излишния калиев перманганат.

Активността на каталазата се определя от количеството на разградения водороден прекис (ml) и се изчислява по формулата:

,

Където
- разликата между резултатите от титруването на контролните и тестовите проби с 0,001 N разтвор на KMnO 4 , ml;

Q е количеството водороден прекис (85 mg), съответстващо на
1 ml 0,1 mol/l разтвор на KMnO 4 .

^ 4.3 Лабораторна работа „Капков метод
(според Климовски и Родзевич)"

Амилолитичната активност, главно поради наличието на α-амилаза в препарата, характеризира способността на ензима да катализира хидролизата на нишестето до продукти, които не са оцветени с йод. При наличие на α-амилаза и глюкоамилаза в препарата, този метод определя общия ефект на всички амилолитични ензими.

За единица амилолитична активност при този метод се приема количеството ензим, което катализира разграждането на 1 g разтворимо нишесте до продукти, които не са оцветени с йод за 1 час при температура 30 ºС при строго определени условия. Амилолитичната активност на AS се изразява с броя на посочените единици в 1 g от препарата, културата или в 1 cm 3 разтвор. Стойността на AC показва колко грама нишесте могат да бъдат хидролизирани до съединения, които не са оцветени с йод в 1 g препарат, култура или 1 cm 3 разтвор за 1 час при условията на определяне. Краят на реакцията се контролира визуално чрез йоден тест.

Определя се чувствителността на метода минималната сумавреме, за което можете визуално да уловите промяната на цвета на йода. Приема се, че скоростта на ензимната реакция е право пропорционална на количеството използван ензим и остава постоянна за 5 минути до 1 час, т.е. реакцията се подчинява на закона за реакцията нулев ред. В допълнение, влиянието на стойността на pH и химическа природабуфер по AC стойност. С ацетатен буфер (pH=4,7) стойността на AS в гъбични препарати е средно 1,5 пъти по-висока, отколкото при определяне с фосфатен буфер (pH=6,0). Ето защо, когато се определя стойността на AS на гъбични култури, се препоръчва да се вземе ацетатен буфер.

Недостатъкът на метода е размитостта визуална дефинициякрай на реакцията.

^ Материали и реактиви: ацетатен буфер pH=4.7 за ензими от гъбичен произход; фосфатен буфер pH=6.0 за ензими от бактериален произход; 1% разтвор на нишесте (разтворът на нишесте, използван за анализ на гъбични препарати, трябва да има рН = 4,7, за анализ на бактериални препарати - 6,0); йодни разтвори. За да се приготви основен разтвор на йод, 4,4 g калиев йодид, 1,4 g метален йод се претеглят в тарирана чаша със смлян капак, добавят се около 2 cm 3 дестилирана вода. Стъклото се затваря с капак, съдържанието се разбърква и след разтварянето на йода разтворът се прехвърля в мерителна колба с обем 100 cm 3 със смляна запушалка. Разредете обема с дестилирана вода до марката. Съдържанието на колбата се съхранява на тъмно и хладно място. Основният разтвор на йод може да се използва в рамките на 30 дни от датата на приготвянето му. Работният разтвор на йод се приготвя от основния разтвор. За да направите това, 20 cm 3 от основния разтвор на йод се излива в мерителна колба с вместимост 100 cm 3, добавят се 4,4 g калиев йодид и общият обем на разтвора се регулира до 100 cm 3. Работният разтвор на йод може да се консумира в рамките на шест дни след приготвянето му.

Оборудване:широки епруветки, стъклени пръчици, пипети, чаши 50 ml, петриеви панички, термостат.

^ Напредък.За да се определи стойността на AC, е важно да се спазват стриктно условията на реакцията. За да направите това, всички разтвори - субстрат (1% разтвор на нишесте), ензимен разтвор и дестилирана вода трябва да се нагреят до температура 30 ° C.

Субстратът в количество от 25 cm 3 (12,5 ml) се поставя в широка епруветка, в която е поставена стъклена пръчка. 30 cm 3 (15 ml) от екстракта и 30 cm 3 (15 ml) вода се изсипват в отделни епруветки, поставят се в термостат и се държат при температура 30 ºС в продължение на
10 минути.

След това от 1 до 25 cm 3 от първоначалния ензимен разтвор и съответното количество вода се добавят в широка епруветка към разтвора на нишестето, без да се изваждат епруветките от термостата, като се използват пипети, така че общият обем на реакцията сместа е 50 cm 3 . Ако ензимният екстракт е неактивен, тогава можете да го добавите само в количество от 25 см 3 и изобщо не добавяйте вода.

Съдържанието на епруветката се разбърква с клечка и с хронометър се отчита времето, когато екстрактът е добавен към разтвора на нишестето. На всеки 60 секунди се взема капка проба от епруветката, без да се изважда от термостата. Капка се поставя върху бяла порцеланова чиния, тази капка се смесва с капка работен разтвор на йод и се наблюдава цветът. Реакцията на разграждане на нишестето се счита за завършена, когато йодът престане да променя цвета си, когато се комбинира с капка от тестовия разтвор в рамките на първите 10 секунди. Промяната в цвета е ясно видима на границата на контакт между две капки - йод и реакционната смес.

Времето, необходимо на нишестето да се разгради до продукти, които не оцветяват с йод, трябва да бъде между 10 и
20 минути.

Ако времето за хидролиза е по-малко от 10 минути, определянето се повтаря, като се взема по-малко екстракт и повече вода за хидролиза. Ако хидролизата не приключи в рамките на 20 минути, тогава анализът също се повтаря, като се вземат повече ензимен екстракт и по-малко вода за определяне. Количеството ензимен екстракт, което трябва да се приеме за повторен анализ, изчислено като се вземе предвид полученото време на хидролиза.

Ако ензимният екстракт има малко или твърде много висока активност, а количеството на ензимния разтвор от 1 до 25 cm 3 не осигурява продължителността на хидролизата на нишестето за 10 ... 20 минути, тогава за анализ не се вземат 25 cm 3 разтвор на нишесте, а повече или по-малко от него, за пример, съответно изменение на формула за изчисление(съответно 0,1 или 0,4 вместо обичайните 0,25).

Стойността на амилолитичната активност на AS (единици/g) се изчислява по формулата:

Където 0,25 е количеството нишесте, което е в 25 cm 3 от 1% разтвор, g;

60 - коефициент на преобразуване за 1 час;

N е количеството на ензима, участващ в реакцията, g или cm3 (тази стойност се определя, като се вземе предвид концентрацията на първоначалния екстракт и последващото разреждане);

T е времето, през което нишестето се разгражда до продукти, които не са оцветени с йод, мин.

Пример.Взет е за анализ ензимен екстракт от въздушна култура на гъбата. Изходният разтвор се приготвя в размер на 5 g култура в 100 cm 3 буферирана вода. Известно е, че тази култура е много активна, поради което е направено допълнително разреждане на първоначалния разтвор: 20 cm 3 се довеждат в мерителна колба до 50 cm 3 с дестилирана вода и оттам 2 cm 3 се вземат за анализ, аз се получава следната последователност на размножаване:

5 g → 100 cm 3 → 20 cm 3 → 50 cm 3 → 2 cm 3.

Отне 12 минути, за да се хидролизира 0,25 нишесте (25 cm 3 от 1% разтвор на нишесте) с последния разтвор на ензим за разреждане (2 cm 3). Тогава AC на въздушно-сухата култура (единица/g) ще бъде:

При преизчисляване ензимна активностне трябва да се вземат предвид напълно. сухо веществоензимен препарат и като се вземе предвид влажността. Изчислението трябва да се извърши по формулата:

,

Където W е съдържанието на влага в културата или препарата.

^ 4.4 Лабораторна работа „Метод на Wilstetter
и дефиницията на Waldschmidt-Leitz за протеолитичен
ензимна активност в модификацията"

Методът се основава на определянето на свободни карбоксилни групи в алкохолни разтвори на аминокиселини и полипептиди.

Активността (PS) се изразява с броя милиграми аминен азот, който се образува по време на хидролизата на определено количество 5% разтвор на желатин с рН от 7,3 до 7,5 1 g от лекарството или 1 cm 3 от ензимен разтвор за 1 час при температура 40 ºС.

Единица протеолитична активност е количеството ензим, което образува 1 mg аминен азот за 1 час при приетите експериментални условия.

^ Материали и реактиви: 96% етилов алкохол; 1% разтвор на тимолфталеин; 0,1 N разтвор на NaOH; субстрат - 5% разтвор на желатин; екстракт от анализираното растение.

Приготвяне на екстракта за определяне на протеолитичната активност: проба от 0,25 g растителен материал се поставя в порцеланов хаван и се стрива 2,5 минути с 2,5 ml фосфатен буфер (pH=7,3), след което масата се филтрира.

Приготвяне на 5% разтвор на желатин (субстрат): 5 g желатин се накисват предварително в стъклена чаша в 15...20 cm 3 дестилирана вода за 20...30 минути. Набъбналият протеин се излива в 20 ... 25 cm 3 буферен разтвор при температура от 70 до 80 ° C и се смесва добре със стъклена пръчка. Разтворената част се излива в мерителна колба с обем 100 cm 3, към неразтворената част се добавят още 20 ... 25 cm 3 буферен разтвор и полученият разтвор отново се прехвърля в същата колба. Охладеният до 40 °C желатинов разтвор се довежда до марката с буферен разтвор със същата температура. Приготвеният желатинов разтвор се съхранява в хладилник при температура от 2 до 5 °C и се използва за анализ в рамките на два дни. Преди анализа желатиновият разтвор се загрява до температура 40 °C на водна баня.

Оборудване:конусовидни колби с обем от 200 до 250 ml, мерителни колби с обем 50 ml, стъклени пръчици, пипети, бюрети, термостат.

^ Напредък.Към 10 cm 3 от 5% разтвор на желатин с рН от 7,3 до 7,5, добавете 2 cm 3 от тестовия ензимен разтвор и незабавно вземете 1 cm 3 от реакционната смес в конична колба с вместимост от 50 до 100 cm 3, където преди това изсипете 20 cm 3 96% етилов алкохоли 0.2 cm 1% тимолфталеин. Пробата се титрува с 0,1 N NaOH до поява на син цвят.

Останалата смес от желатин с ензимния разтвор се поставя в термостат с температура 40 ºС за хидролиза. След 3 часа 1 cm 3 от реакционната смес се поема във втора колба с вместимост от 50 до 100 cm 3, където първо се изсипват 20 cm 3 96% етилов алкохол и 0,2 cm 3 1% тимолфталеин. Пробата се титрува както при контролния вариант.

Изчисляването на протеолитичната активност на PS се извършва по формулата:

,

Където А е количеството аминен азот, натрупан по време на експеримента от реакционната среда, ml;

T е продължителността на протеолизата, h;

P е коефициент, който отчита разреждането и преизчисляването на 1 g от лекарството или 1 cm 3 течен ензимен разтвор.

Стойността на А се изчислява по формулата:

,

Където a е количеството 0,1 n разтвор на NaOH, използвано за титруване на 1 cm 3 от експерименталната проба, cm 3;

И k - същото за контролната проба;

1,4 е коефициентът за превръщане на количеството от 0,1 n алкален разтвор в милиграми азот на аминокиселини и полипептиди;

K - корекция на титъра на основата.

Определяне на каталазната активност

(според А. Н. Бах и А. И. Опарин)

Оксидоредуктазите са клас ензими, които катализират редокс реакции. Окисляването на мономерите, образувани по време на катаболизма на полимерите, е сложен многоетапен процес.

Окисляването на веществата в клетките протича главно чрез отделяне на водород (дехидрогениране) или отделяне на електрони, или чрез добавяне на кислород към молекулата на окисленото съединение.

Водородни акцептори за дехидрогеназите са NAD +, NADP, FAD и FMN, за някои флавинови киселини - кислород (те се наричат ​​оксидази), за хем-съдържащи (пероксидази и каталаза) - H 2 O 2 (водороден пероксид).

Акцептори и преносители на електрони са цитохроми, съдържащи хем (хемопротеини).

Каталазата (EC 1.11.1.6) се отнася до хемопротеините, катализира процеса на разрушаване на водороден пероксид, отровен за клетките, във вода и кислород: 2 H 2 O 2 \u003d 2 H 2 O + O 2.

За жива клетка водородният пероксид е силна отрова, така че всички ензими, които образуват и неутрализират H 2 O 2, се намират в пероксизоми - покрити с мембрана органели. Основните потребители на H 2 O 2 са пероксидазите (EC 1.11.1.7.), които окисляват феноли, амини, някои хетероциклични съединения и други субстрати чрез дехидрогениране, прехвърлят отстранени от субстратите към H 2 O 2, редуциращи го до 2 H 2 О. Молекулите водороден пероксид, непотърсени от пероксидазите, се неутрализират от каталазата.

Методът за определяне на активността на каталазата се основава на определяне на количеството водороден пероксид, разделен по време на инкубацията с ензима. Количеството H 2 O 2 в реакционната смес се определя чрез титруване в кисела средаразтвор с концентрация на калиев перманганат 0,02 mol / l:

5 H 2 O 2 + 2KMnO 4 + 3H 2 SO 4 = 2MnSO 4 + K 2 SO 4 + 5O 2 + 8H 2 O

Въз основа на горното уравнение на реакцията може да се изчисли, че 1 ml разтвор с концентрация на калиев перманганат 0,02 mol/l съответства на 1,7 mg (50 µmol) водороден прекис.

НАПРЕДЪК. 2-3 г сурови картофи (или друг пресен растителен материал) внимателно се счукват в хаванче с кварцов пясък или стъкло. За да се намали киселинната реакция, CaCO 3 се добавя на върха на скалпела, докато спре отделянето на мехурчета CO 2 . В процеса на смилане към хоросана се добавят на малки порции 40-50 ml вода. Прахообразната маса се прехвърля количествено в мерителна колба от 100 ml, разрежда се с вода до марката и се разбърква. Сместа се оставя да престои 10-15 минути и след разбъркване се прецежда.

Вземете две конични колби с вместимост 150-200 ml и към тях добавете 20 ml от получения филтрат. Съдържанието на една колба се вари 1 min и се охлажда до стайна температура (контрола). Друга експериментална колба съдържа активен ензим. Към съдържанието на опитната и контролната колби се добавят 20 ml вода и 3 ml разтвор с масова част H2O2 1%. Съдържанието се разбърква старателно и се оставя на стайна температура за 30 минути. В края на инкубацията 5 ml разтвор с масова част на сярна киселина от 10% се добавят към двете колби, смесват се и излишъкът от H 2 O 2 във всяка колба се титрува с разтвор с концентрация на калиев перманганат от 0,02 mol / l, докато се образува розов цвят, който не изчезва за 1 минута.

Каталазната активност се изразява в µmol водороден пероксид, разложен под действието на ензима на 1 g от изпитвания материал (или 1 mg екстракт от него) за 1 min. Изчислението се извършва по формулата:

където х– активност на каталаза, U/g;

(a-b)- разликата между обемите на разтвор с концентрация на калиев перманганат 0,02 mol / l, който се използва за титруване на контролата (а)и опитен б)проби, ml;

Tе титърът на разтвора на калиев перманганат, използван за титруване;

50 е коефициентът на преобразуване на µmol H 2 O 2 ;

100 е общият обем на приготвения екстракт;

m е масата на материала, взет за анализ, g;

20 е обемът на филтрата, взет за анализ, ml;

30 – време на инкубация, мин.

Записват се принципът на определяне, редът на анализ и резултатът от анализа.

Активността на каталазата може да се определи и от обема на отделения кислород след добавянето на H 2 O 2 към изследвания обект.

Този принцип се използва за определяне на активността на каталазата в млякото, изразена чрез каталазното число, което е обемът кислород (ml), освободен за 2 часа при 25 °C от 5 mg разтвор, добавен към 15 ml мляко с масова част на H 2 O 2 1%. Млякото, получено от здрави животни, отделя 0,7-2,5 ml кислород, т.е. каталазното число на естественото мляко е не повече от 2,5. Млякото, получено от болни животни (мастит и др.) и коластрата имат повишени каталазни числа, достигащи до 15.

РЕАКТИВИ. Дестилирана вода; калциев карбонат (на прах); разтвор с концентрация на калиев перманганат 0,02 mol/l; разтвори с масови фракции: водороден прекис 1% (10 ml разтвор с масова част на H 2 O 2 30%, разреден с вода до 300 ml), сярна киселина 10%.

ТЕСТОВИ ВЪПРОСИ.

1. Основни пътища на окисление на субстрата в клетката.

2. Характеристики на структурата и действието на NAD + - и NADP-зависимите дехидрогенази.

3. Характеристики на структурата и действието на FAD-зависимите дехидрогенази.

4. Какви ензими се наричат ​​оксидази? техните кофактори.

5. Характеристики на структурата и действието на пероксидазите и каталазите.

6. Характеристики на структурата и действието на цитохромите.

7. Химия, образуване и начини за неутрализиране на водородния прекис в клетките.

8. Метод за определяне активността на каталазата.

№	Име на лабораторните теми	Брой часове
	Култивиране на микроорганизми по повърхностен метод върху твърди хранителни среди.
	Екстракция на повърхностно отглеждани ензими
	Култивиране на микроорганизми по дълбок метод
	Определяне на активността на малцовите амилази.
	Приготвяне на ензимния препарат и обработка на пулпа
	Определяне на годността на млякото за сирене чрез тест за сирище
	Определяне на бактериално замърсяване на млякото
	Изследване на влиянието на термичната обработка върху свойствата на млякото.
	ОБЩА СУМА:

Ензими

Ензимите са биологични катализатори от протеинова природа, образувани от всяка жива клетка и имащи способността да активират различни химични съединения.

Механизмът на действие на ензимите, подобно на всички други катализатори, е свързан с намаляване на енергията на активиране, необходима за преминаването на химическа реакция, насочвайки го по заобиколен път през междинни реакции, които изискват много по-ниска енергия на активиране. Така реакцията AB A + B в присъствието на ензим протича по следния начин: AB + F → AVF; AVF→A+VF; WF→W+F. →

Всички ензими се разделят на два големи класа: еднокомпонентни и двукомпонентни.

Първият клас включва ензими, които се състоят само от протеин с каталитични свойства, а вторият клас включва ензими, които се състоят от протеин и свързана с него непротеинова част, така наречената активна група. Терминът коензим или простетична група често се използва за назоваване на активните групи на двукомпонентни ензими. При еднокомпонентните ензими ролята на активни групи се изпълнява от определени химични групи, включени в протеина. Тези групи се наричат ​​активни или каталитични центрове.

Едно от свойствата на ензимите, които се различават от свойствата неорганични катализатори, е тяхната голяма лабилност - зависимост от редица влияния: концентрация на водородни йони, температура, редокс условия, концентрация на определени съединения (продукти на обмяната на веществата), метални йони и др.

Второто е много съществена характеристикаКаталитичното действие на ензимите се състои в това, че то е строго специфично, тоест действието на ензимите е насочено към много специфични химични връзки.

Според естеството на тяхното каталитично действие ензимите се делят на шест класа:

1) оксидоредуктази или редокс ензими;

2) трансферази, т.е. ензими, които катализират трансфера различни групиатоми от една молекула в друга;

3) хидролази, катализиращи хидролитични реакции;

4) лиази - ензими, които разцепват една или друга група от субстрати (не чрез хидролиза) с образуването на двойна връзка или обратно, прикрепват се към двойни връзки;

5) изомерази, т.е. ензими, които катализират реакциите на изомеризация органични съединения;

6) лигази или синтетази - към този клас принадлежат ензими, които катализират синтетичните реакции.

Всеки от тези класове е подразделен на подкласове, а последните от своя страна на по-малки групи.

На всички етапи от преработката на зърното в брашно, по време на съхранението му, както и при приготвянето на тестото и печенето на хляб, в по-голяма или по-малка степен се проявява активността на хидролитичните и окислителните ензими, които оказват значително влияние върху качеството на продуктът.

В зърното ензимите се намират в тъканите на ембриона, алейроновия слой и ендосперма. Характерно е за живите растителни клеткиензими, които определят специфични функции в метаболитните процеси.

От многото ензими, открити в зърнените култури, само тези, които оказват или могат да окажат влияние върху качеството на продуктите от зърнопреработката, са подложени на задълбочено изследване. Те включват амилази, протеази, липази, липоксигенази, полифенолоксидази и др. Наред с това е установено, че някои зърнени ензими могат да бъдат добри индикатори за неговото физиологично състояние. По този начин каталазата, тъй като е много термолабилна, отразява добре намаляването на кълняемостта по време на сушенето на семенното зърно и нейната активност може да служи като индикатор за контролиране на процеса на сушене.

Изключително голям биологично значениеамилаза по време на узряването и покълването на зърното, както и в редица технологични процесихранително-вкусовата промишленост, която се основава на хидролитични трансформации на нишесте под въздействието на зърнени амилази.

Зърното от зърнени култури съдържа два специфични ензима, които определят хидролизата на нишестето, а именно:

1) -1,4 - глюканхидролаза или αα-амилаза, хидролизираща α-1,4 - глюканови връзки на нишесте и свързани полизахариди и тези връзки се разкъсват произволно;

2) -1,4 - глюканмалтохидролаза или αβ - амилаза, хидролизираща α-1,4 - глюканови връзки в полизахаридите, последователно отцепвайки малтозните остатъци от нередуциращите краища на веригата.

Въпреки факта, че протеазите са не по-малко важни за технологиите, те са много по-малко проучени от амилазите. Причината за това е, че класическите методи за изследване на протеази от животински произход (ензими, които хидролизират протеини) се оказаха неефективни при изследване протеолитични ензимижитни зърна. Под въздействието на протеазите се получава втечняване на глутена, което от своя страна води до влошаване на качеството на изпечения хляб.

Липазите предизвикват хидролизата на мазнините, т.е. разделяне естериглицерин с образуването на свободни мастни киселини, което води до повишаване на киселинността на зърното и брашното.

С участието на липоксигенази се окисляват ненаситени мастни киселини, образуват се карбонилни и карбоксилни съединения с ниско молекулно тегло, които имат лоша миризмаи горчив вкус. Този процес се нарича гранясване на мазнини (брашно).

Лабораторна работа №1.

Тема:Култивиране на микроорганизми по повърхностен метод върху твърди хранителни среди.

Обективен:Отглеждане на продуценти на различни ензими върху твърди гранулирани среди и анализиране на получените култури за активността на ензимите, които съдържат.

Метод на повърхностна култура. Повърхностното култивиране на аероби се извършва върху плътна или рохкава среда, както и в тънък слой течна среда в стъклени съдове с широко дъно: чаши на Петри, колби на Виноградски, матраци, кювети. Посадените съдове се отглеждат при постоянна температура в термостати или термостатични помещения (термични камери). Микроорганизмите растат на повърхността на околната среда и използват кислород директно от въздуха. В течна среда облигатните аероби растат под формата на обилни филми. Факултативните аероби (анаероби) се развиват както в дебелината на течната среда, образувайки суспензии, люспи, утайки, така и на повърхността под формата на тънък филм. На плътна среда микроорганизмите растат под формата на отделни колонии или непрекъсната морава. Повърхностно отглеждане в лабораторни условиясе използват широко за получаване на акумулативни и чисти култури, тяхното съхранение, изследване на морфологични, културни и биохимични характеристики на микроорганизмите. В промишлеността методът на повърхностните култури върху течна среда се използва за получаване на лимонена киселина, върху свободна среда - за производството на ензимни препарати.

1. Подготовка на съдовете и тяхната стерилизация;

2. Приготвяне на хранителна среда и нейната стерилизация;

3. Изчисляване на количеството вода, необходимо за овлажняване на хранителната среда;

4. Овлажняване на стерилна хранителна среда, нейното засяване и разпределяне в кювети за култивиране;

1. Подготовка на съдовете за стерилизация. Всички прибори трябва да бъдат старателно измити и изсушени във фурна преди стерилизация.

За стерилизация трябва да се увият в хартия и внимателно да се завържат с конци следните предмети: кювета, капак към кюветата.

Стерилизирането на съдове и вода трябва да се извърши в автоклав при температура 120ºС за 0,5 часа.

Стерилните съдове след автоклавиране трябва да се изсушат в пещ при 105 ºС, тъй като хартията е леко навлажнена по време на стерилизация.

2. Подготовка и стерилизация на хранителната среда. За всеки микроорганизъм се приготвя собствена хранителна среда, която осигурява биосинтезата на определени ензими.Средата за всяка кювета се стерилизира отделно. Приготвената среда се поставя или в торба, или в многослойна марля, или в широка стъклена чаша. За Asp. oryzae например се използват следните варианти на хранителни среди: пшенични трици-100,70; малцови кълнове-30; цвеклова каша-50; джибри от грозде-20; малцови кълнове-50; оризова кора - 50.

3. За нормално развитиемикроскопични гъбички и интензивно образуване на ензими, е необходимо околната среда да има влажност 58-63%.

Изчисляването на количеството добавена вода се извършва съгласно следните данни:

Acp е масата на хранителната среда с начално съдържание на влага;

Cav е масата на хранителната среда с необходимата влажност;

Gav е масата на хранителната среда след стерилизация;

D е количеството вода, което трябва да се добави, за да се получи хранителна среда с необходимата влажност.

Лаборатория №2

Тема:Екстракция на повърхностно отглеждани ензими

Обективен:Да умее да култивира микроорганизми по повърхностен метод върху твърди хранителни среди.

Метод за екстракция на повърхностни култури. Повърхностното култивиране на аероби се извършва върху плътна или рохкава среда, както и в тънък слой течна среда в стъклени съдове с широко дъно: чаши на Петри, колби на Виноградски, матраци, кювети. Посадените съдове се отглеждат при постоянна температура в термостати или термостатични помещения (термични камери). Микроорганизмите се развиват на повърхността на околната среда и използват кислород директно от въздуха. В течна среда облигатните аероби растат под формата на обилни филми. Факултативните аероби (анаероби) се развиват както в дебелината на течната среда, образувайки суспензии, люспи, утайки, така и на повърхността под формата на тънък филм. На плътна среда микроорганизмите растат под формата на отделни колонии или непрекъсната морава. Повърхностното култивиране в лабораторни условия се използва широко за получаване на обогатителни и чисти култури, тяхното съхранение и изследване на морфологичните, културните и биохимичните характеристики на микроорганизмите. В промишлеността методът на повърхностните култури върху течни среди се използва за получаване на лимонена киселина, върху насипни култури - за производството на ензимни препарати.

В тази лабораторна работа е най-удобно да се използват микроскопични гъбички или дрождеподобни микроорганизми, като Asp niger. Rh. Делемар и др.

Лаборатория #3

Тема:Култивиране на микроорганизми по дълбок метод.

Обективен:За да можете да култивирате микроорганизми по дълбок начин.

Дълбоко култивиране. Дълбочинното култивиране на микроорганизми може да бъде периодично и непрекъснато. При партиден процес целият обем на хранителната среда се инокулира с инокулум и култивирането се извършва при оптимални условия за определен период от време до точно количествобиомаса или целеви продукт. За да се осигури растеж на аеробни култури в дълбоките слоеве на течността, е необходимо снабдяване с кислород. Тъй като микробните клетки са в състояние да използват само разтворен кислород и неговата разтворимост е ниска (4-7 mg / g)

Обикновено и достъпен начинпериодичното потопено култивиране е култивирането на аеробни култури в суспендирано състояние в течна среда, излята в малки обеми в епруветки и колби.

Непрекъснато дълбоко култивиране се извършва в лабораторни ферментатори. Процесът на непрекъснато култивиране във ферментатора се извършва според типа хемостат или турбидостат.

Целта на тази работа е да се отглеждат производители на различни ензими върху течни хранителни среди по дълбок метод и да се анализират получените култури от микроорганизми за съдържанието на определени ензими в тях.

Както при първата лабораторна работа, е необходимо да се определи инокулумът, който се приготвя чрез отглеждане на производителя в няколко пасажа върху агарова среда в епруветки или дюшеци.

В лабораторната работа студентът приготвя 0,7 dm 3 от хранителната среда. Първоначално една чаша се претегля на технически везни, а след това всички необходими компоненти на средата се претеглят в чашата. Течните компоненти на средата се измерват по обем.

Солите се разтварят без специални предпазни мерки. Нишесте или брашно се смесват в съотношение 1:10 с студена водаи се запарва във вряща водна баня.

Варианти на хранителни среди за култивиране на микроорганизми-продуценти на ензими.

маса 1

Компоненти на хранителната среда	Варианти на хранителни среди и съдържание на компоненти,%
аспид Oryzae	0,3
Екстракт от царевица	0,3	0,4	2,0
соево брашно	0,5	4,0	2,0
Царевично брашно	2,0	-	0,5
фуражна мая	-	-	0,2
Калциев карбонат	-	0,1	0,2
Пепел. bitatae	1,0
Филтрат от полиалкохолен дестилаж	98,3	96,8	-
Царевично нишесте	1,5	-	0,2
Технически магнезит	0,2	0,2	1,5
ръжено брашно	-	2,5	1,0
Екстракт от царевица	0,2	0,5	1,0

За всяка опция се вземат четири колби, във всяка се изсипват 120 cm 3 от приготвената среда. Колбите се затварят с памучни запушалки, запушалките се покриват с плътни хартиени капачки, за да не се овлажняват по време на стерилизацията. Едновременно с люлеещите се колби се поставя колба с 50 cm3 среда за стерилизация за последващо определяне на нейното pH.

Определения за средно рН

pH на средата се определя чрез електрометричен метод два пъти: преди и след стерилизация, всеки път, когато се извършват три повторения на тези определяния и след това се анализира надеждността на тези резултати.

Инокулация на хранителната среда

След приключване на стерилизацията и отваряне на автоклава, пипетите се поставят за 10-15 минути. В гореща пещ за сушене на хартия, колби и други съдове се оставят в автоклава за 10-15 минути. Засяването на хранителната среда се извършва в кутия.

Лаборатория #4

Определяне на каталазната активност

Каталазата принадлежи към първия клас ензими (оксидоредуктази) и катализира разграждането на водороден пероксид във вода и кислород съгласно уравнението:

Каталаза играе важна роляв жизнената дейност на организмите, тъй като разрушава водородния прекис, който е отровен за клетките и се образува при дишане.

Количественото определяне на каталазата се основава на отчитане на водородния прекис чрез титруването му с калиев перманганат. Реакцията протича по уравнението:

2KMnO 4 + 5H 2 O 2 + 4H 2 SO 4 2KHSO → 4 + 2MnSO 4 + 8H 2 O + 5O 2

За количеството водороден пероксид, унищожен от ензима, се съди по разликата между количествата 0,1 mol/DM 3 KMnO 4 разтвор, използвани за титруване в контролния и работния опит.

Тестови материали:малц (покълнало зърно)

Реактиви:разтвор на водороден прекис ω (H 2 O 2) = 1%

разтвор на сярна киселина ω (H 2 SO 4) = 10%

разтвор на калиев перманганат C (1/5 KMnO 4) = 0,1 mol / dm 3

5 g от изпитвания материал се влива при стайна температура в продължение на 30 минути със 100 cm 3 вода, като периодично се разбърква съдържанието на колбата. След вливането течността се филтрира през сух нагънат филтър и две порции от по 20 cm 3 (една опитна и една контрола) се вземат от бистър разтвор с пипета и всяка се прехвърля в отделна конична колба за 200 cm 3. Контролата се вари в продължение на 3 минути за инактивиране на ензима.

Към опитните и контролните проби се добавят 20 cm 3 дестилирана вода, 4 cm 3 водороден прекис и се оставят за 20 минути на стайна температура за действие на ензима. След 20 минути към пробите се добавят 5 cm 3 сярна киселина и останалият (неразложен) водороден пероксид се титрува с разтвор на калиев перманганат.

Каталазната активност се изразява в микромоли водороден пероксид, разграден под действието на ензима за 1 min на 1 g от изпитвания материал.

Активността на каталазата се определя по формулата:

където X е активността на каталазата;

a - количеството от 0,1 mol / dm 3 разтвор на KMnO 4, използвано за титруване на контролния разтвор, cm 3;

b - количеството 0,1 mol/DM 3 KMnO 4 разтвор, използвано за титруване на тестовия разтвор, cm 3 ;

К - корекция на титъра;

100 е общият обем на екстракта, cm3;

50 е коефициентът на преобразуване за микромола H 2 O 2 ;

20 - обем на ензимния разтвор, cm3;

20 – време за ензимна реакция, min;

P - взета за анализ проба от изследвания материал, g.

Лабораторна работа №5.

Колориметричен метод за определяне активността на α- и β-амилаза

Под действието на амилазите в растенията се извършва хидролизата на високополимерен въглехидрат - нишесте - с образуването на декстрини и малтоза. В растенията се откриват α- и β-амилази.

Отделното количествено определяне на активността на α- и β-амилазите се основава на тяхната различна термична стабилност: β-амилазата се разрушава при нагряване до 70 ° C, докато α-амилазата запазва своята активност.

Методите за определяне на активността на амилазата се основават или на отчитане на количеството захар, образувано по време на действието на ензима върху нишестето, или на отчитане на количеството неразградено от ензима нишесте, което се определя фотометрично след третиране с разтвор на йод.

Реактиви:ацетатен буфер рН 5.5;

разтвор на натриев хлорид ω (NаСl) = 1%;

разтвор на нишесте ω \u003d 10%, (2 g нишесте, смесени в 20 cm 3 студена вода, изсипват се в 80 cm 3 вряща вода, след което се нагряват във вряща водна баня, докато разтворът стане бистър);

решение на солна киселина C (HCl) \u003d 1 mol / dm 3

разтвор на солна киселина C (HCl) \u003d 0,1 mol / dm 3

йоден разтвор ω = 0,3% в 3% разтвор на калиев йодид.

Част от 0,5 - 1 g брашно или разсад се смила в хаван с малко количество 1% разтвор на NaCl и се прехвърля в 50 cm 3 конична колба. Съотношението между пробата и разтвора на NaCl е 1:10 или 1:20. Съдържанието на колбата се разбърква добре и се оставя да престои на стайна температура 30 минути, като периодично се разклаща. След това се филтрира през плътен нагънат филтър. Когато филтрирането е трудно, може да се комбинират филтриране и центрофугиране при 4000-5000 rpm. Като ензимен препарат се използва бистър разтвор.

За да се определи активността на α- и β-амилазата, се вземат 4 епруветки (2 експериментални и 2 контролни) и към тях се добавят 3 cm 3 ацетатен буфер и 3 cm 3 2% разтвор на нишесте. Сместа се загрява на водна баня или в термостат до 40°С. След това към епруветките се добавят 0,2-1,0 cm 3 от ензимния препарат (в зависимост от активността на амилазите в обекта на изследване) и същото количество H 2 O се добавя към контролните епруветки. епруветките се смесват и се поставят в термостат при 40 °C за 30 или 60 min. След инкубиране във всяка епруветка веднага се изсипват 2 cm 3 1 N. HCl разтвор за спиране на действието на амилазите.

За да се открие нереагирало нишесте с ензима, се провежда реакция с йод. Около 30 cm 3 вода се изсипват в мерителни колби на 50 cm 3, 1 cm 3 0,1 n. HCl, 5 капки 0,3% разтвор на йод и добавете 0,5 cm 3 от сместа от всяка епруветка. Съдържанието на колбите се смесва добре, довежда се до марката с вода и се колориметрира на фотоелектричен колориметър с филтър за червена светлина или на спектрофотометър при 595 nm в кювета с работна дължина 1 cm.

За да се определи активността на α-амилазата, 5 cm 3 от филтрата (ензимен препарат) се изсипват в 100 cm 3 конична колба, добавя се сух калциев ацетат на върха на ножа и се държи 15 минути в ултратермостат или в водна баня при 70 ° C (температурните колебания са разрешени не повече от 0,5 ° C). След това съдържанието на колбата се охлажда бързо в съд със студена вода. При такова нагряване β-амилазата се инактивира напълно и α-амилазата запазва своята активност. Освен това, определянето на а-амилазната активност се свежда до процедурата, описана по-горе.

Действието на двата ензима се изразява в милиграми хидролизирано нишесте при експериментални условия (за 30 минути или 1 час) на 1 g брашно (кълнове). Активността на β-амилазата се определя от разликата между общата активност на α- и β-амилазите и активността на α-амилазата. Активността на амилазата на 1 g брашно за 1 час се изчислява по следната формула:

където D е оптичната плътност на контролния разтвор;

D 1 - оптична плътност на тестовия разтвор;

а - количеството на добавеното нишесте (60 mg);

m - тегло на пробата, g;

V е обемът на първоначалния ензимен екстракт, cm3

V 1 - обем на екстракта, взет за инкубация, cm 3 .

Лаборатория №6

©2015-2019 сайт
Всички права принадлежат на техните автори. Този сайт не претендира за авторство, но предоставя безплатно използване.
Дата на създаване на страницата: 2016-02-13

Лаборатория №1

Тема: Каталитична активност на ензимите в живите клетки

Цел:идентифицирайте каталитичната функция на протеините в живите клетки, формирайте знания за ролята на ензимите в клетките, консолидирайте способността да работите с микроскоп, провеждайте експерименти и обяснявайте резултатите от работата. Оборудване:сурови и варени картофи, лист от елодея (друго растение), пресен 3% разтвор на водороден прекис, епруветки, пинсети, пясък, хаванче и пестик, тетрадка, химикал, молив, линийка.

Напредък:

Пригответе две епруветки, като в първата сложете малко пясък, във втората - парче суров картоф, в третата - парче сварен картоф.Във всяка от епруветките капнете малко водороден прекис. Наблюдавайте какво ще се случи във всяка от епруветките.

Смелете парче суров картоф с малко количество пясък в хаванче.

Прехвърлете натрошените картофи заедно с пясъка в епруветка и капнете малко водороден прекис.

Сравнете активността на натрошена и цяла растителна тъкан.

Направете таблица, показваща активността на всяка тъкан при различни лечения. Обяснете вашите резултати. Отговори на въпросите:

Наблюдения

Водороден прекис и сурови картофи

Освобождава се кислород, протеинът се разгражда до първична структураи се превръща в пяна

Водороден прекис и варени картофи

Никаква реакция

Отговорете на въпросите: В какви епруветки се проявява активността на ензима каталаза? Обясни защо.

Каталазата е ензим, който катализира разграждането на водороден пероксид във вода и молекулярен кислород: H2O2 + H2O2 = O2 + 2H2O. Биологична роляК. се състои в разграждането на водородния пероксид, който се образува в клетките в резултат на действието на редица флавопротеинови оксидази (ксантиноксидаза, глюкозооксидаза, моноаминооксидаза и др.), И осигуряването на ефективна защита клетъчни структуриот разрушаване от водороден прекис. Генетично обусловената недостатъчност на K. е една от причините за така наречената акаталазия, наследствено заболяване, което се проявява клинично чрез язви на носната и устната лигавица, понякога изразени атрофични промени в алвеоларните прегради и загуба на зъби. Активността се появи в 1.3 епруветки, т.к. имаха сурови храни, съдържащи протеини. А в останалите епруветки имаше продукти с унищожен протеин в процеса на готвене и реакцията не се прояви. Поради това тялото се усвоява по-добре от храни, съдържащи протеини.

Как се проявява ензимната активност в живите и мъртвите тъкани?Обяснете наблюдаваното явление. В мъртвите тъкани ензимната активност отсъства, т.к. белтъчините в тях са били унищожени при варенето. И в живите тъкани при взаимодействие с водороден прекис се отделя кислород и протеинът, разделяйки се на първичната структура, се превръща в пяна.

Как смилането на тъкани влияе върху активността на ензима в живите тъкани на растения и животни?При смилане на жива тъкан реакцията е по-бърза, т.к. зоната на контакт между протеина и водородния прекис се увеличава Как бихте предложили да се измери скоростта на разлагане на водородния прекис? v=kc(a)c(b) където v е скоростта на химическата реакция k е константата на скоростта c е промяната в концентрацията Смятате ли, че всички живи организми съдържат ензима каталаза, който разгражда водородния пероксид?

Обосновете отговора. Тъй като това е ензим от класа на оксидоредуктазите, той катализира разграждането на водородния пероксид, който е токсичен за живите клетки, във вода и кислород. Намира се в лизозомите. Може да се заключи, че се съдържа във всички клетки на живите организми. Обяснете вашите наблюдения. Формулирайте заключение.

Заключение: протеинът се намира само в живите храни, а в готвените храни протеинът се разрушава, така че с тях не възниква реакция. Ако смилате продуктите, реакцията ще протече по-бързо.

Въведение

Това ръководство има за цел да запознае студентите както с класическите методи за изследване на ензими, така и със съвременните, високочувствителни методи. аналитични методиизползване на ензими като изследователски инструменти. Ръководството се състои от пет раздела:

1. Методи за определяне активността на ензимите.

2. Изследване на кинетичните параметри на ензимните реакции.

3. Методи за изолиране и пречистване на ензими.

4. Изследване на субклетъчната локализация на ензимите.

5. Използване на ензими като аналитични реагенти.

Всички раздели на "Практика" имат самостоятелни задачиИзискванията към учениците обаче остават същите. Всяка предложена работа е малка пилотно проучване. При изпълнението на който и да е от тях студентът трябва самостоятелно да подготви всички необходими решения, да овладее необходимите методи за изследване, да проведе експеримент и да изготви резултатите под формата на доклад, илюстрирайки получените данни с таблици и графики.

Използвано ниво методически похватиотговаря на изискванията съвременна наука. Ако е необходимо, описанието на работата предоставя кратко теоретична информация. Всички произведения, включени в „Работилницата”, са многократно изпълнени от ученици.

Работа 1. Титриметрично определяне на активността на каталазата

Оборудване и реактиви: кипяща водна баня; пипети за 5, 10, 20 и 25 ml; мерителни цилиндри с нос за 10 и 25 ml; мерителна колба от 100 ml; 200 ml конични колби; Порцелан за хаванче и пестик; калиев перманганат (0,1 N); сярна киселина(десет%); натриев карбонат; водороден прекис (0,1 N); пресен растителен материал (картофи или моркови).

2 г сурови картофи (или моркови) се счукват в хаванче, като постепенно се добавят 2-3 мл вода. За да намалите киселинната реакция, добавете натриев карбонат на върха на шпатулата, докато мехурчетата спрат въглероден двуокис. Прахообразната маса се прехвърля количествено в мерителна колба и се довежда с вода до обем 100 ml. Сместа се оставя да престои 30 минути, след което се прецежда. След това се определя активността по схемата (2 експериментални проби и 2 контролни проби):

Опитът и контролата се титруват с 0,1 N. разтвор на калиев перманганат (докато бледорозовият цвят стане стабилен за около 1 минута). Отбелязва се количеството разтвор на калиев перманганат, използвано за титруване на останалия (след ензимно разлагане) водороден пероксид в тестовата колба и за титруване на целия водороден пероксид в контролната колба. Разликата между експерименталното и контролното титруване се използва за намиране на количеството перманганат, еквивалентно на количеството водороден пероксид, разграден от ензима.

Изчислението се извършва в съответствие с уравнението на реакцията:

5H2O2 + 2KMnO4 + 3H2SO4 > 2MnSO4 + K2SO4 + 5O2 + 8H2O,

според който 1 ml от 0,1 n разтвор на калиев перманганат съответства на 1,7 mg водороден прекис.

Пример за изчисление: от 1,25 g моркови се приготвя каталазен екстракт с обем 100 ml: 15,5 ml се изразходват за титруване на експерименталната проба, 30,2 ml контролна проба се използва с 0,1 N разтвор на калиев перманганат. Количеството разложен водороден пероксид в пробата е еквивалентно на (30,2 - 15,5) 14,7 ml 0,1 N. разтвор на калиев перманганат и следователно равен на (14,7 1,7) 24,99 mg. Това означава, че 1 g сурови моркови съдържа количеството каталаза, което може да се разложи = 99,96 mg водороден прекис, а за 1 min - (99,96:30) 3,33 mg. Тъй като 1 µmol водороден пероксид е 0,034 mg, тогава 1 g моркови съдържа (3,33:0,034) 100 U каталаза.

1. Изчислете съдържанието на каталаза в изпитвания материал.

2. Напишете систематичното наименование на този ензим, кода му според систематичния каталог и опишете биологичната му роля.