Τα ένζυμα είναι πρωτεϊνικοί καταλύτες για βιοχημικές αντιδράσεις, τα περισσότερα απόπου απουσία του ενζύμου θα προχωρούσε εξαιρετικά αργά. Σε αντίθεση με τους χημικούς καταλύτες, κάθε ένζυμο μπορεί να καταλύσει μόνο έναν πολύ μικρό αριθμό αντιδράσεων, συχνά μόνο μία.

Έτσι, τα ένζυμα είναι ειδικοί για την αντίδραση καταλύτες. Σχεδόν όλες οι βιοχημικές αντιδράσεις καταλύονται από ένζυμα.

Πολλά ένζυμα έχουν καταλυτική επίδραση στα υποστρώματα μόνο με την παρουσία μιας συγκεκριμένης θερμοσταθερής οργανικής ένωσης χαμηλού μοριακού βάρους, ενός συνενζύμου.

Σε τέτοιες περιπτώσεις, το ολοένζυμο (καταλυτικά ενεργό σύμπλοκο) αποτελείται από ένα αποένζυμο (μέρος πρωτεΐνης) και ένα σχετικό συνένζυμο (Παράρτημα Η). Το συνένζυμο μπορεί να συσχετιστεί με το αποένζυμο με ομοιοπολικούς και μη ομοιοπολικούς δεσμούς. Ο όρος "προσθετική ομάδα" αναφέρεται σε ένα ομοιοπολικά συνδεδεμένο συνένζυμο. Οι αντιδράσεις που απαιτούν την παρουσία ενός συνενζύμου περιλαμβάνουν: αντιδράσεις οξειδοαναγωγής, ομαδική μεταφορά, ισομερισμό και συμπύκνωση (σύμφωνα με το σύστημα IUB, αυτές είναι οι κατηγορίες 1, 2, 5, 6). Οι αντιδράσεις διάσπασης προχωρούν απουσία συνενζύμων (σύμφωνα με το σύστημα IUB, αυτές είναι οι κατηγορίες 3 και 4).

^ 4.1 Εργαστηριακές εργασίες«Προσδιορισμός δραστικότητας αμυλάσης
βύνη σύμφωνα με τη μέθοδο Wolgemuth

Η μέθοδος Wohlgemuth βασίζεται στον προσδιορισμό της ελάχιστης ποσότητας ενός ενζύμου ικανού να υδρολύσει πλήρως 1 ml διαλύματος αμύλου 0,1% υπό ορισμένες συνθήκες. Η δράση αμυλάσης της βύνης εκφράζεται ως ο αριθμός των χιλιοστόλιτρων ενός διαλύματος αμύλου 0,1% που μπορεί να υδρολυθεί με 1 ml εκχυλίσματος βύνης σε θερμοκρασία 38 °C για 30 λεπτά. Η κανονική δραστηριότητα αμυλάσης είναι από 160 έως 320 μονάδες δραστικότητας.

Η μέθοδος Wohlgemuth χρησιμοποιείται ευρέως στην κλινική πρακτική για τον προσδιορισμό της δραστηριότητας αμυλάσης του αίματος και των ούρων, στην παρασκευή - για τον προσδιορισμό της δραστηριότητας αμυλάσης της βύνης. Μια απότομη αύξηση της δραστηριότητας της αμυλάσης στο αίμα και τα ούρα (10-30 φορές) παρατηρείται σε οξεία παγκρεατίτιδα, όγκους του παγκρέατος.

^ Υλικά και αντιδραστήρια: εκχύλισμα από βύνη σιτηρών, αραιωμένο 10 φορές. 0,1% διάλυμα αμύλου; Διάλυμα ιωδίου 0,1% σε διάλυμα ιωδιούχου καλίου 0,2%.

Εξοπλισμός:ράφι με δοκιμαστικούς σωλήνες, πιπέτες, σταγονόμετρα, θερμοστάτη.

^ Πρόοδος.Ρίξτε 1 ml απεσταγμένου νερού σε δέκα δοκιμαστικούς σωλήνες. 1 ml από το εκχύλισμα αραιωμένο 10 φορές προστίθεται στον πρώτο δοκιμαστικό σωλήνα, αναμιγνύεται, 1 ml του μείγματος μεταφέρεται στον δεύτερο δοκιμαστικό σωλήνα. Τα περιεχόμενα αυτού του σωλήνα αναμειγνύονται ξανά και 1 ml μεταφέρεται στον τρίτο σωλήνα και ούτω καθεξής μέχρι το δέκατο σωληνάριο. Λαμβάνεται 1 ml από το τελευταίο σωληνάριο και απορρίπτεται. Έτσι, σε κάθε επόμενο σωλήνα, η περιεκτικότητα σε ένζυμο είναι δύο φορές μικρότερη από ό,τι στον προηγούμενο. Η αραίωση του εκχυλίσματος σε δέκα δοκιμαστικούς σωλήνες θα είναι: 1:10; 1:20; 1:40; 1:80; 1:160; 1:320; 1:640; 1:1280; 1:2560; 1:5120; 1:10240.

Στη συνέχεια, 1 ml νερού και 2 ml διαλύματος αμύλου προστίθενται σε όλους τους δοκιμαστικούς σωλήνες, αναμιγνύονται και τοποθετούνται σε θερμοστάτη σε θερμοκρασία 38 °C για 30 λεπτά. Μετά την επώαση, οι σωλήνες ψύχονται νερό βρύσηςγια να σταματήσει η δράση του ενζύμου, προσθέστε δύο σταγόνες διαλύματος ιωδίου, ανακινήστε καλά και παρατηρήστε την αλλαγή χρώματος. Όταν αντιδρά με ιώδιο, το υγρό γίνεται κίτρινο, ροζ και μοβ.

Σημειώνοντας ποια αναπαραγωγή συνέβη πλήρη υδρόλυσηάμυλο με ελάχιστη περιεκτικότητα σε ένζυμα (δοκιμαστικός σωλήνας με κιτρινωπό χρώμα των περιεχομένων), η δραστηριότητα αμυλάσης του εκχυλίσματος υπολογίζεται από την ποσότητα του μη αραιωμένου εκχυλίσματος (Α) σε αυτόν τον δοκιμαστικό σωλήνα
(Ένα ml εκχυλίσματος διασπά Χ ml διαλύματος αμύλου 0,1%).

Για παράδειγμα, κίτρινοςεμφανίστηκε στον τέταρτο δοκιμαστικό σωλήνα, όπου το εκχύλισμα αραιώθηκε 160 φορές. Αυτή η ποσότητα εκχυλίσματος μπορεί να υδρολύσει 2 ml διαλύματος αμύλου 0,1% και 1 ml μη αραιωμένου εκχυλίσματος υδρολύει 320 ml υπό τις ίδιες συνθήκες: Χ = 2 × 160/1. Επομένως, η δραστικότητα αμυλάσης είναι 320.

^ 4.2 Εργαστηριακή εργασία «Προσδιορισμός δραστικότητας καταλάσης

του Μπαχ"

Η μέθοδος βασίζεται στον προσδιορισμό της ποσότητας του υπεροξειδίου του υδρογόνου που απομένει μετά τη δράση της καταλάσης σε αυτό με τιτλοδότηση ενός διαλύματος KMnO 4 σε αυτό. Η αντίδραση προχωρά σύμφωνα με την εξίσωση

1 ml διαλύματος υπερμαγγανικού καλίου 0,1 mol/l αντιστοιχεί σε 85 mg υπεροξειδίου του υδρογόνου.

^ Υλικά και αντιδραστήρια: παρασκεύασμα καταλάσης (1 g φύτρων βύνης κριθαριού αλέθεται σε γουδί πορσελάνης με 6 ml ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών και διηθείται). 10% διάλυμα H 2 SO 4; Διάλυμα υπεροξειδίου του υδρογόνου 0,1% σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών, pH=7,0 (35,0 ml 0,2 mol/l NaH 2 PO 4 σε 13,6 ml 0,2 mol/l NaH 2 PO 4); Διάλυμα KMnO 4 0,1 mol/l.

Εξοπλισμός:Φιάλες 100 ml, πιπέτες, προχοΐδες, θερμοστάτης.

^ Πρόοδος. 2 ml του παρασκευάσματος καταλάσης προστίθενται σε δύο φιάλες, 1 ml διαλύματος 10% H 2 SO 4 προστίθεται σε μία από αυτές (δείγμα), και στη συνέχεια 2 ml διαλύματος υπεροξειδίου του υδρογόνου χύνονται σε κάθε φιάλη, τοποθετούνται σε θερμοστάτη για 40 λεπτά σε θερμοκρασία 38 °C. Μετά το χρόνο επώασης, 1 ml διαλύματος H 2 SO 4 10% προστίθεται στη δεύτερη φιάλη (μάρτυρας) και και τα δύο διαλύματα τιτλοδοτούνται με διάλυμα KMnO 4 0,1 mol/l μέχρι να εμφανιστεί ένα επίμονο ροζ χρώμα από την περίσσεια υπερμαγγανικού καλίου.

Η δραστικότητα της καταλάσης προσδιορίζεται από την ποσότητα του αποσυντεθειμένου υπεροξειδίου του υδρογόνου (ml) και υπολογίζεται από τον τύπο:

,

Οπου
- τη διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων της τιτλοδότησης των δειγμάτων ελέγχου και δοκιμής με διάλυμα KMnO 4 0,001 N, ml.

Q είναι η ποσότητα υπεροξειδίου του υδρογόνου (85 mg), που αντιστοιχεί σε
1 ml διαλύματος KMnO 4 0,1 mol/l.

^ 4.3 Εργαστηριακή εργασία «Μέθοδος στάγδην
(σύμφωνα με τους Klimovsky και Rodzevich)"

Η αμυλολυτική δράση, κυρίως λόγω της παρουσίας α-αμυλάσης στο παρασκεύασμα, χαρακτηρίζει την ικανότητα του ενζύμου να καταλύει την υδρόλυση του αμύλου σε προϊόντα που δεν χρωματίζονται με ιώδιο. Παρουσία α-αμυλάσης και γλυκοαμυλάσης στο παρασκεύασμα, αυτή η μέθοδος καθορίζει τη συνολική επίδραση όλων των αμυλολυτικών ενζύμων.

Η μονάδα αμυλολυτικής δράσης σε αυτή τη μέθοδο λαμβάνεται ως η ποσότητα του ενζύμου που καταλύει τη διάσπαση 1 g διαλυτού αμύλου σε προϊόντα που δεν χρωματίζονται με ιώδιο σε 1 ώρα σε θερμοκρασία 30 ºС υπό αυστηρά καθορισμένες συνθήκες. Η αμυλολυτική δράση του AS εκφράζεται με τον αριθμό των ενδεικνυόμενων μονάδων σε 1 g του παρασκευάσματος, καλλιέργεια ή σε 1 cm 3 διαλύματος. Η τιμή AC δείχνει πόσα γραμμάρια αμύλου μπορούν να υδρολυθούν σε ενώσεις που δεν χρωματίζονται με ιώδιο σε 1 g παρασκευάσματος, καλλιέργεια ή 1 cm 3 διαλύματος σε 1 ώρα υπό τις συνθήκες προσδιορισμού. Το τέλος της αντίδρασης ελέγχεται οπτικά με τη δοκιμή ιωδίου.

Καθορίζεται η ευαισθησία της μεθόδου το ελάχιστο ποσόχρόνος για τον οποίο μπορείτε να πιάσετε οπτικά την αλλαγή χρώματος του ιωδίου. Υποτίθεται ότι ο ρυθμός της ενζυματικής αντίδρασης είναι ευθέως ανάλογος με την ποσότητα του ενζύμου που χρησιμοποιείται και παραμένει σταθερός για 5 λεπτά έως 1 ώρα, δηλαδή η αντίδραση υπακούει στο νόμο της αντίδρασης μηδενική σειρά. Επιπλέον, η επίδραση της τιμής του pH και χημική φύση buffer κατά τιμή AC. Με ρυθμιστικό διάλυμα οξικού (pH=4,7), η τιμή AS στα παρασκευάσματα μυκήτων είναι κατά μέσο όρο 1,5 φορές υψηλότερη από ό,τι όταν προσδιορίζεται με ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (pH=6,0). Επομένως, κατά τον προσδιορισμό της τιμής AS των μυκητιακών καλλιεργειών, συνιστάται η λήψη ενός ρυθμιστικού διαλύματος οξικού.

Το μειονέκτημα της μεθόδου είναι η ασάφεια οπτικός ορισμόςτο τέλος της αντίδρασης.

^ Υλικά και αντιδραστήρια: οξικό ρυθμιστικό pH=4,7 για ένζυμα μυκητιακής προέλευσης. ρυθμιστικό φωσφορικών pH=6,0 για ένζυμα βακτηριακής προέλευσης. Διάλυμα αμύλου 1% (το διάλυμα αμύλου που χρησιμοποιείται για την ανάλυση παρασκευασμάτων μυκήτων πρέπει να έχει pH = 4,7, για την ανάλυση βακτηριακών παρασκευασμάτων - 6,0). διαλύματα ιωδίου. Για την παρασκευή του βασικού διαλύματος ιωδίου, 4,4 g ιωδιούχου καλίου, 1,4 g μεταλλικού ιωδίου ζυγίζονται σε ένα απόβαρο ποτήρι με αλεσμένο καπάκι, προστίθενται περίπου 2 cm 3 απεσταγμένου νερού. Το ποτήρι κλείνεται με καπάκι, το περιεχόμενο αναδεύεται και μετά τη διάλυση του ιωδίου, το διάλυμα μεταφέρεται σε ογκομετρική φιάλη όγκου 100 cm 3 με αλεσμένο πώμα. Αραιώστε τον όγκο με απεσταγμένο νερό μέχρι τη χαραγή. Το περιεχόμενο της φιάλης αποθηκεύεται σε σκοτεινό δροσερό μέρος. Το βασικό διάλυμα ιωδίου μπορεί να χρησιμοποιηθεί εντός 30 ημερών από την ημερομηνία παρασκευής του. Το διάλυμα εργασίας ιωδίου παρασκευάζεται από το αρχικό διάλυμα. Για να γίνει αυτό, 20 cm 3 του βασικού διαλύματος ιωδίου χύνεται σε ογκομετρική φιάλη χωρητικότητας 100 cm 3, προστίθενται 4,4 g ιωδιούχου καλίου και ο συνολικός όγκος του διαλύματος ρυθμίζεται στα 100 cm 3. Το διάλυμα εργασίας ιωδίου μπορεί να καταναλωθεί εντός έξι ημερών από την παρασκευή του.

Εξοπλισμός:φαρδιοί δοκιμαστικοί σωλήνες, γυάλινες ράβδοι, σιφώνια, ποτήρια ζέσεως 50 ml, τρυβλία Petri, θερμοστάτης.

^ Πρόοδος.Για τον προσδιορισμό της τιμής AC, είναι σημαντικό να τηρούνται αυστηρά οι συνθήκες αντίδρασης. Για να γίνει αυτό, όλα τα διαλύματα - υπόστρωμα (διάλυμα αμύλου 1%), διάλυμα ενζύμου και απεσταγμένο νερό πρέπει να θερμανθούν σε θερμοκρασία 30 ° C.

Το υπόστρωμα σε ποσότητα 25 cm 3 (12,5 ml) τοποθετείται σε φαρδύ δοκιμαστικό σωλήνα στον οποίο εισάγεται μια γυάλινη ράβδος. 30 cm 3 (15 ml) εκχυλίσματος και 30 cm 3 (15 ml) νερού χύνονται σε χωριστούς δοκιμαστικούς σωλήνες, τοποθετούνται σε θερμοστάτη και διατηρούνται σε θερμοκρασία 30 ºС για
10 λεπτά.

Στη συνέχεια, από 1 έως 25 cm 3 του αρχικού διαλύματος ενζύμου και η αντίστοιχη ποσότητα νερού προστίθενται σε ένα φαρδύ δοκιμαστικό σωλήνα στο διάλυμα αμύλου, χωρίς να αφαιρεθούν οι δοκιμαστικοί σωλήνες από τον θερμοστάτη, χρησιμοποιώντας σιφώνια έτσι ώστε ο συνολικός όγκος της αντίδρασης το μείγμα είναι 50 cm 3 . Εάν το εκχύλισμα ενζύμου είναι ανενεργό, τότε μπορείτε να το προσθέσετε μόνο σε ποσότητα 25 cm 3 και μην προσθέσετε καθόλου νερό.

Τα περιεχόμενα του δοκιμαστικού σωλήνα αναμιγνύονται με ένα ραβδί και σημειώνεται ο χρόνος με χρονόμετρο κατά την προσθήκη του εκχυλίσματος στο διάλυμα αμύλου. Κάθε 60 δευτερόλεπτα, λαμβάνεται μια σταγόνα δείγματος από τον δοκιμαστικό σωλήνα χωρίς να αφαιρείται από τον θερμοστάτη. Μια σταγόνα τοποθετείται σε ένα λευκό πορσελάνινο πιάτο, αυτή η σταγόνα συνδυάζεται με μια σταγόνα διαλύματος εργασίας ιωδίου και παρατηρείται το χρώμα. Η αντίδραση πέψης αμύλου θεωρείται ολοκληρωμένη όταν το ιώδιο παύει να δίνει αλλαγή χρώματος όταν συνδυάζεται με μια σταγόνα του διαλύματος δοκιμής μέσα στα πρώτα 10 δευτερόλεπτα. Η αλλαγή στο χρώμα είναι σαφώς ορατή στο όριο επαφής μεταξύ δύο σταγόνων - ιωδίου και του μίγματος αντίδρασης.

Ο χρόνος που χρειάζεται για να διασπαστεί το άμυλο σε προϊόντα που δεν λερώνονται με ιώδιο θα πρέπει να είναι μεταξύ 10 και
20 λεπτά.

Εάν ο χρόνος υδρόλυσης είναι μικρότερος από 10 λεπτά, ο προσδιορισμός επαναλαμβάνεται, λαμβάνοντας λιγότερο εκχύλισμα και περισσότερο νερό για υδρόλυση. Εάν η υδρόλυση δεν τελειώσει μέσα σε 20 λεπτά, τότε η ανάλυση επαναλαμβάνεται επίσης, λαμβάνοντας περισσότερο εκχύλισμα ενζύμου και λιγότερο νερό για προσδιορισμό. Η ποσότητα του ενζυμικού εκχυλίσματος που πρέπει να ληφθεί επανανάλυση, υπολογίζεται λαμβάνοντας υπόψη τον λαμβανόμενο χρόνο υδρόλυσης.

Εάν το εκχύλισμα ενζύμου έχει λίγο ή πάρα πολύ υψηλή δραστηριότητακαι η ποσότητα του διαλύματος ενζύμου από 1 έως 25 cm 3 δεν παρέχει τη διάρκεια της υδρόλυσης αμύλου για 10 ... 20 λεπτά, τότε δεν λαμβάνονται 25 cm 3 διαλύματος αμύλου για ανάλυση, αλλά περισσότερο ή λιγότερο από αυτό, για για παράδειγμα, αντίστοιχη τροπολογία σε τύπος υπολογισμού(αντίστοιχα 0,1 ή 0,4 αντί για το συνηθισμένο 0,25).

Η τιμή της αμυλολυτικής δραστηριότητας του AS (μονάδες/g) υπολογίζεται με τον τύπο:

Όπου 0,25 είναι η ποσότητα αμύλου που βρίσκεται σε 25 cm 3 διαλύματος 1%, g.

60 - συντελεστής μετατροπής για 1 ώρα.

Ν είναι η ποσότητα του ενζύμου που συμμετέχει στην αντίδραση, g ή cm 3 (αυτή η τιμή προσδιορίζεται λαμβάνοντας υπόψη τη συγκέντρωση του αρχικού εκχυλίσματος και την επακόλουθη αραίωση).

T είναι ο χρόνος κατά τον οποίο το άμυλο αποικοδομήθηκε σε προϊόντα που δεν χρωματίστηκαν με ιώδιο, min.

Παράδειγμα.Ένα ενζυματικό εκχύλισμα της καλλιέργειας αέρα του μύκητα λήφθηκε για ανάλυση. Το αποθεματικό διάλυμα παρασκευάστηκε με ρυθμό 5 g καλλιέργειας σε 100 cm3 ρυθμισμένου νερού. Είναι γνωστό ότι αυτή η καλλιέργεια είναι πολύ δραστική, επομένως, έγινε μια πρόσθετη αραίωση του αρχικού διαλύματος: 20 cm 3 μεταφέρθηκαν σε ογκομετρική φιάλη στα 50 cm 3 με απεσταγμένο νερό και από εκεί ελήφθησαν 2 cm 3 για ανάλυση, Εγώ. ελήφθη η ακόλουθη σειρά αναπαραγωγής:

5 g → 100 cm 3 → 20 cm 3 → 50 cm 3 → 2 cm 3.

Χρειάστηκαν 12 λεπτά για την υδρόλυση 0,25 αμύλου (25 cm 3 ενός διαλύματος αμύλου 1%) με το τελευταίο διάλυμα ενζύμου αραίωσης (2 cm 3). Τότε το AC της ξηρής καλλιέργειας στον αέρα (μονάδα/g) θα είναι:

Κατά τον επανυπολογισμό ενζυματική δραστηριότηταδεν πρέπει να λαμβάνεται πλήρως υπόψη. ξηρή ύληπροετοιμασία ενζύμων και λαμβάνοντας υπόψη την υγρασία. Ο υπολογισμός πρέπει να γίνει σύμφωνα με τον τύπο:

,

Όπου W είναι η περιεκτικότητα σε υγρασία της καλλιέργειας ή του παρασκευάσματος.

^ 4.4 Εργαστηριακή εργασία «Μέθοδος Wilstetter
και Waldschmidt-Leitz ορισμός του πρωτεολυτικού
ενζυμική δραστηριότητα στην τροποποίηση"

Η μέθοδος βασίζεται στον προσδιορισμό των ελεύθερων καρβοξυλομάδων σε αλκοολικά διαλύματα αμινοξέων και πολυπεπτιδίων.

Η δραστικότητα (PS) εκφράζεται με τον αριθμό των χιλιοστόγραμμα του αζώτου αμίνης, το οποίο σχηματίζεται κατά την υδρόλυση ορισμένης ποσότητας διαλύματος ζελατίνης 5% με τιμή pH 7,3 έως 7,5 1 g του φαρμάκου ή 1 cm 3 του διάλυμα ενζύμου για 1 ώρα σε θερμοκρασία 40 ºС.

Μονάδα πρωτεολυτικής δραστηριότητας είναι η ποσότητα του ενζύμου που σχηματίζει 1 mg αμινοζώτου σε 1 ώρα υπό τις αποδεκτές πειραματικές συνθήκες.

^ Υλικά και αντιδραστήρια: 96% αιθυλική αλκοόλη; Διάλυμα θυμολφθαλεΐνης 1%. Διάλυμα NaOH 0,1 N; υπόστρωμα - διάλυμα ζελατίνης 5%. εκχύλισμα από το αναλυθέν φυτό.

Παρασκευή του εκχυλίσματος για τον προσδιορισμό της πρωτεολυτικής δράσης: δείγμα 0,25 g φυτικού υλικού τοποθετείται σε γουδί πορσελάνης και αλέθεται για 2,5 λεπτά με 2,5 ml ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών (pH=7,3), και στη συνέχεια η μάζα διηθείται.

Παρασκευή διαλύματος ζελατίνης 5% (υπόστρωμα): 5 g ζελατίνης προ-εμποτίζονται σε γυάλινο φλιτζάνι σε 15...20 cm 3 απεσταγμένο νερό για 20...30 λεπτά. Η διογκωμένη πρωτεΐνη χύνεται σε 20 ... 25 cm 3 ρυθμιστικού διαλύματος σε θερμοκρασία 70 έως 80 ° C και αναμιγνύεται καλά με μια γυάλινη ράβδο. Το διαλυμένο μέρος χύνεται σε ογκομετρική φιάλη με όγκο 100 cm 3, άλλα 20 ... 25 cm 3 ρυθμιστικού διαλύματος προστίθενται στο αδιάλυτο μέρος και το προκύπτον διάλυμα μεταφέρεται ξανά στην ίδια φιάλη. Το διάλυμα ζελατίνης που έχει ψυχθεί στους 40 °C φέρεται στο σημάδι με ένα ρυθμιστικό διάλυμα της ίδιας θερμοκρασίας. Το παρασκευασμένο διάλυμα ζελατίνης φυλάσσεται σε ψυγείο σε θερμοκρασία 2 έως 5 °C και χρησιμοποιείται για ανάλυση εντός δύο ημερών. Πριν από την ανάλυση, το διάλυμα ζελατίνης θερμαίνεται σε θερμοκρασία 40 °C σε υδατόλουτρο.

Εξοπλισμός:κωνικές φιάλες όγκου 200 έως 250 ml, ογκομετρικές φιάλες όγκου 50 ml, γυάλινες ράβδοι, πιπέτες, προχοΐδες, θερμοστάτης.

^ Πρόοδος.Σε 10 cm 3 ενός διαλύματος ζελατίνης 5% με τιμή pH 7,3 έως 7,5, προσθέστε 2 cm 3 από το διάλυμα του ενζύμου δοκιμής και αμέσως πάρτε 1 cm 3 από το μείγμα αντίδρασης σε μια κωνική φιάλη χωρητικότητας 50 έως 100 cm 3, όπου προηγουμένως χύστε 20 cm 3 96% εθυλική αλκοόληκαι 0,2 cm 3 1% θυμολφθαλεΐνη. Το δείγμα τιτλοδοτείται με 0,1 N NaOH μέχρι να εμφανιστεί ένα μπλε χρώμα.

Το υπόλοιπο μείγμα ζελατίνης με το ενζυμικό διάλυμα τοποθετείται σε θερμοστάτη με θερμοκρασία 40 ºС για υδρόλυση. Μετά από 3 ώρες, 1 cm3 του μίγματος της αντίδρασης λαμβάνεται σε μια δεύτερη φιάλη με χωρητικότητα 50 έως 100 cm3, όπου αρχικά χύνονται 20 cm3 αιθυλικής αλκοόλης 96% και 0,2 cm3 θυμολφθαλεΐνης 1%. Το δείγμα τιτλοδοτείται όπως στην περίπτωση της παραλλαγής ελέγχου.

Ο υπολογισμός της πρωτεολυτικής δραστηριότητας του PS πραγματοποιείται σύμφωνα με τον τύπο:

,

Όπου Α είναι η ποσότητα αζώτου αμίνης που συσσωρεύτηκε κατά τη διάρκεια του πειράματος από το μέσο αντίδρασης, ml.

T είναι η διάρκεια της πρωτεόλυσης, h;

Το P είναι ένας συντελεστής που λαμβάνει υπόψη την αραίωση και τον εκ νέου υπολογισμό για 1 g του φαρμάκου ή 1 cm 3 ενός υγρού διαλύματος ενζύμου.

Η τιμή του Α υπολογίζεται από τον τύπο:

,

Όπου a είναι η ποσότητα διαλύματος NaOH 0,1 n που χρησιμοποιείται για την τιτλοδότηση 1 cm 3 του πειραματικού δείγματος, cm 3.

Και k - το ίδιο για το δείγμα ελέγχου.

1,4 είναι ο συντελεστής για τη μετατροπή της ποσότητας 0,1 n αλκαλικού διαλύματος σε χιλιοστόγραμμα αζώτου αμινοξέων και πολυπεπτιδίων.

K - διόρθωση στον τίτλο του αλκαλίου.

Προσδιορισμός δραστικότητας καταλάσης

(σύμφωνα με τους A.N. Bach και A.I. Oparin)

Οι οξειδορεδουκτάσες είναι μια κατηγορία ενζύμων που καταλύουν τις οξειδοαναγωγικές αντιδράσεις. Η οξείδωση των μονομερών που σχηματίζονται κατά τον καταβολισμό των πολυμερών είναι μια πολύπλοκη διαδικασία πολλαπλών σταδίων.

Η οξείδωση των ουσιών στα κύτταρα προχωρά κυρίως με διάσπαση υδρογόνου (αφυδρογόνωση) ή διάσπαση ηλεκτρονίων ή με προσθήκη οξυγόνου στο μόριο της οξειδωμένης ένωσης.

Οι δέκτες υδρογόνου για τις αφυδρογονάσες είναι NAD +, NADP, FAD και FMN, για ορισμένα οξέα φλαβίνης - οξυγόνο (ονομάζονται οξειδάσες), για αίμη που περιέχουν (υπεροξειδάσες και καταλάση) - H 2 O 2 (υπεροξείδιο του υδρογόνου).

Οι δέκτες και οι φορείς ηλεκτρονίων είναι κυτοχρώματα (αιμοπρωτεΐνες) που περιέχουν αίμη.

Η καταλάση (EC 1.11.1.6) αναφέρεται σε αιμοπρωτεΐνες, καταλύει τη διαδικασία καταστροφής του υπεροξειδίου του υδρογόνου, δηλητηριώδους για τα κύτταρα, σε νερό και οξυγόνο: 2 H 2 O 2 \u003d 2 H 2 O + O 2.

Για ένα ζωντανό κύτταρο, το υπεροξείδιο του υδρογόνου είναι ένα ισχυρό δηλητήριο, επομένως όλα τα ένζυμα που σχηματίζουν και εξουδετερώνουν το H 2 O 2 βρίσκονται σε υπεροξισώματα - οργανίδια καλυμμένα με μεμβράνη. Οι κύριοι καταναλωτές του H 2 O 2 είναι οι υπεροξειδάσες (EC 1.11.1.7.), οι οποίες οξειδώνουν φαινόλες, αμίνες, ορισμένες ετεροκυκλικές ενώσεις και άλλα υποστρώματα με αφυδρογόνωση, μεταφέροντας αφαιρούμενα από τα υποστρώματα σε H 2 O 2, μειώνοντάς τα σε 2 H 2 Ο. Μόρια υπεροξειδίου του υδρογόνου, που δεν απαιτούνται από τις υπεροξειδάσες, εξουδετερώνονται από την καταλάση.

Η μέθοδος για τον προσδιορισμό της δραστικότητας της καταλάσης βασίζεται στον προσδιορισμό της ποσότητας του υπεροξειδίου του υδρογόνου που διασπάται κατά τη διάρκεια της επώασης με το ένζυμο. Η ποσότητα του Η2Ο2 στο μίγμα της αντίδρασης προσδιορίζεται με τιτλοδότηση σε όξινο περιβάλλονδιάλυμα με συγκέντρωση υπερμαγγανικού καλίου 0,02 mol / l:

5 H 2 O 2 + 2KMnO 4 + 3H 2 SO 4 = 2MnSO 4 + K 2 SO 4 + 5O 2 + 8H 2 O

Με βάση την παραπάνω εξίσωση αντίδρασης, μπορεί να υπολογιστεί ότι 1 ml διαλύματος με συγκέντρωση υπερμαγγανικού καλίου 0,02 mol/l αντιστοιχεί σε 1,7 mg (50 μmol) υπεροξειδίου του υδρογόνου.

ΠΡΟΟΔΟΣ. 2-3 g ωμές πατάτες (ή άλλο φρέσκο ​​φυτικό υλικό) αλέθονται προσεκτικά σε γουδί με χαλαζιακή άμμο ή γυαλί. Για να μειωθεί η όξινη αντίδραση, προστίθεται CaCO 3 στην άκρη του νυστεριού μέχρι να σταματήσει η απελευθέρωση των φυσαλίδων CO 2. Κατά τη διαδικασία λείανσης, προστίθενται 40-50 ml νερού σε μικρές μερίδες στο γουδί. Η κονιοποιημένη μάζα μεταφέρεται ποσοτικά σε ογκομετρική φιάλη των 100 ml, αραιώνεται με νερό μέχρι τη χαραγή και αναμειγνύεται. Το μείγμα αφήνεται σε ηρεμία για 10-15 λεπτά και, μετά από ανάδευση, διηθείται.

Λαμβάνονται δύο κωνικές φιάλες χωρητικότητας 150-200 ml και προσθέτονται σε αυτές 20 ml από το διήθημα που προκύπτει. Τα περιεχόμενα μιας φιάλης βράζονται για 1 λεπτό και ψύχονται σε θερμοκρασία δωματίου (έλεγχος). Μια άλλη πειραματική φιάλη περιέχει ένα ενεργό ένζυμο. Στο περιεχόμενο της πειραματικής φιάλης και της φιάλης ελέγχου, προσθέστε 20 ml νερού και 3 ml διαλύματος με κλάσμα μάζαςΗ2Ο2 1%. Τα περιεχόμενα αναμειγνύονται καλά και αφήνονται σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. Στο τέλος της επώασης, 5 ml διαλύματος με κλάσμα μάζας θειικού οξέος 10% προστίθενται και στις δύο φιάλες, αναμειγνύονται και η περίσσεια H 2 O 2 σε κάθε φιάλη τιτλοδοτείται με διάλυμα με συγκέντρωση υπερμαγγανικού καλίου 0,02 mol / l μέχρι να σχηματιστεί ένα ροζ χρώμα που δεν εξαφανίζεται για 1 λεπτό.

Η δράση καταλάσης εκφράζεται σε μmol υπεροξειδίου του υδρογόνου που αποσυντίθεται υπό τη δράση του ενζύμου ανά 1 g του υλικού δοκιμής (ή 1 mg εκχυλίσματος από αυτό) για 1 λεπτό. Ο υπολογισμός γίνεται σύμφωνα με τον τύπο:

όπου Χ– δραστηριότητα καταλάσης, U/g;

(α-β)- τη διαφορά μεταξύ των όγκων ενός διαλύματος με συγκέντρωση υπερμαγγανικού καλίου 0,02 mol / l, το οποίο χρησιμοποιήθηκε για την τιτλοδότηση του ελέγχου (ένα)και έμπειροι (σι)δείγματα, ml;

Τείναι ο τίτλος του διαλύματος υπερμαγγανικού καλίου που χρησιμοποιείται για την τιτλοδότηση.

50 είναι ο συντελεστής μετατροπής ανά μmol H 2 O 2 .

100 είναι ο συνολικός όγκος του παρασκευασμένου εκχυλίσματος.

m είναι η μάζα του υλικού που λαμβάνεται για ανάλυση, g.

20 είναι ο όγκος του διηθήματος που λαμβάνεται για ανάλυση, ml.

30 – χρόνος επώασης, min.

Καταγράφεται η αρχή του προσδιορισμού, η σειρά ανάλυσης και το αποτέλεσμα της ανάλυσης.

Η δραστικότητα της καταλάσης μπορεί επίσης να προσδιοριστεί από τον όγκο του οξυγόνου που απελευθερώνεται μετά την προσθήκη H 2 O 2 στο υπό μελέτη αντικείμενο.

Αυτή η αρχή χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της δραστηριότητας της καταλάσης στο γάλα, εκφρασμένη με τον αριθμό καταλάσης, που είναι ο όγκος του οξυγόνου (ml) που απελευθερώνεται σε 2 ώρες στους 25 ° C από 5 mg διαλύματος που προστίθεται σε 15 ml γάλακτος με κλάσμα μάζας H 2 O 2 1%. Το γάλα που λαμβάνεται από υγιή ζώα απελευθερώνει 0,7-2,5 ml οξυγόνου, δηλ. ο αριθμός καταλάσης του φυσικού γάλακτος δεν είναι μεγαλύτερος από 2,5. Το γάλα που λαμβάνεται από άρρωστα ζώα (μαστίτιδα κ.λπ.) και το πρωτόγαλα έχουν αυξημένα ποσοστά καταλάσης, που φθάνουν έως και το 15.

ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ. Απεσταγμένο νερό; ανθρακικό ασβέστιο (σκόνη); διάλυμα με συγκέντρωση υπερμαγγανικού καλίου 0,02 mol/l. διαλύματα με κλάσματα μάζας: υπεροξείδιο του υδρογόνου 1% (10 ml διαλύματος με κλάσμα μάζας H 2 O 2 30% αραιωμένο με νερό έως 300 ml), θειικό οξύ 10%.

ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΤΕΣΤ.

1. Κύρια μονοπάτια οξείδωσης του υποστρώματος στο κύτταρο.

2. Χαρακτηριστικά της δομής και της δράσης των NAD + - και των εξαρτώμενων από NADP αφυδρογονασών.

3. Χαρακτηριστικά της δομής και της δράσης των εξαρτώμενων από FAD αφυδρογονασών.

4. Ποια ένζυμα ονομάζονται οξειδάσες; τους συμπαράγοντες τους.

5. Χαρακτηριστικά της δομής και της δράσης υπεροξειδασών και καταλάσεων.

6. Χαρακτηριστικά της δομής και της δράσης των κυτοχρωμάτων.

7. Χημεία, σχηματισμός και τρόποι εξουδετέρωσης του υπεροξειδίου του υδρογόνου στα κύτταρα.

8. Μέθοδος προσδιορισμού της δραστικότητας της καταλάσης.

№	Όνομα εργαστηριακών θεμάτων	Αριθμός ωρών
	Καλλιέργεια μικροοργανισμών με επιφανειακή μέθοδο σε στερεά θρεπτικά μέσα.
	Εκχύλιση ενζύμων που αναπτύσσονται στην επιφάνεια
	Καλλιέργεια μικροοργανισμών με βαθιά μέθοδο
	Προσδιορισμός της δραστικότητας των αμυλασών βύνης.
	Παρασκευή της ενζυμικής παρασκευής και επεξεργασία πολτού
	Προσδιορισμός καταλληλότητας τυριού γάλακτος με δοκιμή πυτιάς
	Προσδιορισμός βακτηριακής μόλυνσης του γάλακτος
	Μελέτη της επίδρασης της θερμικής επεξεργασίας στις ιδιότητες του γάλακτος.
	ΣΥΝΟΛΟ:

Ένζυμα

Τα ένζυμα είναι βιολογικοί καταλύτες πρωτεϊνικής φύσης, που σχηματίζονται από οποιοδήποτε ζωντανό κύτταρο και έχουν την ικανότητα να ενεργοποιούν διάφορες χημικές ενώσεις.

Ο μηχανισμός δράσης των ενζύμων, όπως και όλων των άλλων καταλυτών, σχετίζεται με μείωση της ενέργειας ενεργοποίησης που απαιτείται για τη διέλευση του χημική αντίδραση, κατευθύνοντάς το κυκλικά μέσα από ενδιάμεσες αντιδράσεις που απαιτούν πολύ χαμηλότερη ενέργεια ενεργοποίησης. Έτσι, η αντίδραση ΑΒ Α + Β παρουσία ενός ενζύμου προχωρά ως εξής: AB + F → AVF; AVF→A+VF; WF→W+F. →

Όλα τα ένζυμα χωρίζονται σε δύο μεγάλες κατηγορίες: ενός συστατικού και δύο συστατικών.

Η πρώτη κατηγορία περιλαμβάνει ένζυμα που αποτελούνται μόνο από μια πρωτεΐνη με καταλυτικές ιδιότητες και η δεύτερη κατηγορία περιλαμβάνει ένζυμα που αποτελούνται από μια πρωτεΐνη και ένα μη πρωτεϊνικό μέρος που σχετίζεται με αυτήν, τη λεγόμενη ενεργή ομάδα. Ο όρος συνένζυμο, ή προσθετική ομάδα, χρησιμοποιείται συχνά για την ονομασία των ενεργών ομάδων των ενζύμων δύο συστατικών. Στα ένζυμα ενός συστατικού, ο ρόλος των ενεργών ομάδων εκτελείται από ορισμένες χημικές ομάδες που περιλαμβάνονται στην πρωτεΐνη. Αυτές οι ομάδες ονομάζονται ενεργά ή καταλυτικά κέντρα.

Μία από τις ιδιότητες των ενζύμων που διαφέρουν από τις ιδιότητες ανόργανους καταλύτες, είναι η μεγάλη τους αστάθεια - εξάρτηση από μια σειρά επιρροών: συγκέντρωση ιόντων υδρογόνου, θερμοκρασία, συνθήκες οξειδοαναγωγής, συγκέντρωση ορισμένων ενώσεων (μεταβολικά προϊόντα), ιόντα μετάλλων κ.λπ.

Το δεύτερο είναι πολύ ουσιαστικό χαρακτηριστικόΗ καταλυτική δράση των ενζύμων έγκειται στο ότι είναι αυστηρά ειδική, δηλαδή η δράση των ενζύμων κατευθύνεται σε πολύ συγκεκριμένους χημικούς δεσμούς.

Σύμφωνα με τη φύση της καταλυτικής τους δράσης, τα ένζυμα χωρίζονται σε έξι κατηγορίες:

1) οξειδορεδουκτάσες ή οξειδοαναγωγικά ένζυμα.

2) τρανσφεράσες, δηλ. ένζυμα που καταλύουν τη μεταφορά διάφορες ομάδεςάτομα από το ένα μόριο στο άλλο.

3) υδρολάσες που καταλύουν υδρολυτικές αντιδράσεις.

4) λυάσες - ένζυμα που αποκόπτουν τη μία ή την άλλη ομάδα από υποστρώματα (όχι με υδρόλυση) με το σχηματισμό διπλού δεσμού ή αντίστροφα, προσκολλώνται σε διπλούς δεσμούς.

5) ισομεράσες, δηλ. ένζυμα που καταλύουν τις αντιδράσεις ισομερισμού ΟΡΓΑΝΙΚΕΣ ΕΝΩΣΕΙΣ;

6) λιγάσες ή συνθετάσες - ένζυμα που καταλύουν συνθετικές αντιδράσεις ανήκουν σε αυτή την κατηγορία.

Κάθε μία από αυτές τις κατηγορίες υποδιαιρείται σε υποκατηγορίες, και αυτές οι τελευταίες, με τη σειρά τους, σε μικρότερες ομάδες.

Σε όλα τα στάδια της μεταποίησης των σιτηρών σε αλεύρι, κατά την αποθήκευσή του, καθώς και κατά την παρασκευή της ζύμης και του ψησίματος του ψωμιού, η δράση των υδρολυτικών και οξειδωτικών ενζύμων εκδηλώνεται σε μεγαλύτερο ή μικρότερο βαθμό, τα οποία έχουν σημαντικό αντίκτυπο στην ποιότητα του το προϊόν.

Στους κόκκους, τα ένζυμα βρίσκονται στους ιστούς του εμβρύου, στο στρώμα αλευρόνης και στο ενδοσπέρμιο. Είναι χαρακτηριστικό των ζωντανών φυτικά κύτταραένζυμα που καθορίζουν συγκεκριμένες λειτουργίες στις μεταβολικές διεργασίες.

Από τα πολλά ένζυμα που βρίσκονται στους κόκκους των δημητριακών, μόνο εκείνα που έχουν ή μπορούν να έχουν αντίκτυπο στην ποιότητα των προϊόντων επεξεργασίας σιτηρών έχουν υποβληθεί σε ενδελεχή μελέτη. Αυτές περιλαμβάνουν αμυλάσες, πρωτεάσες, λιπάσες, λιποξυγενάσες, οξειδάσες πολυφαινόλης κ.λπ. Μαζί με αυτό, διαπιστώθηκε ότι ορισμένα ένζυμα των κόκκων μπορούν να είναι καλοί δείκτες της φυσιολογικής τους κατάστασης. Έτσι, η καταλάση, όντας πολύ θερμοευαίσθητη, αντανακλά καλά τη μείωση της βλάστησης κατά την ξήρανση των σπόρων και η δραστηριότητά της μπορεί να χρησιμεύσει ως δείκτης για τον έλεγχο της διαδικασίας ξήρανσης.

Εξαιρετικά μεγάλο βιολογικής σημασίαςαμυλάση κατά την ωρίμανση και τη βλάστηση των κόκκων, καθώς και σε μια σειρά από τεχνολογικές διαδικασίεςβιομηχανίες τροφίμων, οι οποίες βασίζονται σε υδρολυτικούς μετασχηματισμούς του αμύλου υπό την επίδραση αμυλασών σιτηρών.

Ο κόκκος των δημητριακών περιέχει δύο συγκεκριμένα ένζυμα που καθορίζουν την υδρόλυση του αμύλου, και συγκεκριμένα:

1) -1,4 - γλυκανυδρολάση ή αα-αμυλάση, υδρολύοντας δεσμούς α-1,4 - γλυκάνης αμύλου και σχετικών πολυσακχαριτών, και αυτοί οι δεσμοί διασπώνται τυχαία.

2) -1,4 - γλυκανμαλτοϋδρολάση ή αβ - αμυλάση, υδρολύοντας δεσμούς α-1,4 - γλυκάνης σε πολυσακχαρίτες, αποκόπτοντας διαδοχικά τα υπολείμματα μαλτόζης από τα άκρα της μη αναγωγικής αλυσίδας.

Παρά το γεγονός ότι οι πρωτεάσες δεν είναι λιγότερο σημαντικές για την τεχνολογία, έχουν μελετηθεί πολύ λιγότερο από τις αμυλάσες. Ο λόγος για αυτό είναι ότι οι κλασικές μέθοδοι μελέτης πρωτεασών ζωικής προέλευσης (ένζυμα που υδρολύουν πρωτεΐνες) αποδείχθηκαν αναποτελεσματικές στη μελέτη πρωτεολυτικά ένζυμασπόροι δημητριακών. Υπό την επίδραση των πρωτεασών, συμβαίνει υγροποίηση της γλουτένης, η οποία, με τη σειρά της, οδηγεί σε υποβάθμιση της ποιότητας του ψημένου ψωμιού.

Οι λιπάσες προκαλούν την υδρόλυση των λιπών, δηλ. διαίρεση εστέρεςγλυκερίνη με το σχηματισμό ελεύθερων λιπαρών οξέων, με αποτέλεσμα την αύξηση της οξύτητας των δημητριακών και του αλευριού.

Με τη συμμετοχή των λιποξυγενασών οξειδώνονται ακόρεστα λιπαρά οξέα, σχηματίζονται χαμηλού μοριακού βάρους καρβονυλο και καρβοξυλικές ενώσεις που έχουν άσχημη μυρωδιάκαι πικρή γεύση. Αυτή η διαδικασία ονομάζεται τάγγιση των λιπών (αλεύρι).

Εργαστηριακή εργασία №1.

Θέμα:Καλλιέργεια μικροοργανισμών με επιφανειακή μέθοδο σε στερεά θρεπτικά μέσα.

Σκοπός:Ανάπτυξη παραγωγών διαφόρων ενζύμων σε στερεά κοκκώδη μέσα και ανάλυση των καλλιεργειών που προκύπτουν για τη δράση των ενζύμων που περιέχουν.

Μέθοδος επιφανειακής καλλιέργειας. Η επιφανειακή καλλιέργεια αερόβιων πραγματοποιείται σε πυκνό ή χαλαρό μέσο, ​​καθώς και σε ένα λεπτό στρώμα υγρού μέσου σε γυάλινα σκεύη με φαρδύ πάτο: πιάτα Petri, φιάλες Winogradsky, στρώματα, κυβέτες. Τα δοχεία με σπόρους καλλιεργούνται σε σταθερή θερμοκρασία σε θερμοστάτες ή θερμοστατικούς χώρους (θερμοθάλαμοι). Οι μικροοργανισμοί αναπτύσσονται στην επιφάνεια του περιβάλλοντος και χρησιμοποιούν οξυγόνο απευθείας από τον αέρα. Σε υγρά μέσα, τα υποχρεωτικά αερόβια αναπτύσσονται με τη μορφή άφθονων φιλμ. Τα προαιρετικά αερόβια (αναερόβια) αναπτύσσονται τόσο στο πάχος του υγρού μέσου, σχηματίζοντας αιωρήματα, νιφάδες, ίζημα, όσο και στην επιφάνεια με τη μορφή λεπτής μεμβράνης. Σε πυκνά μέσα, οι μικροοργανισμοί αναπτύσσονται με τη μορφή μεμονωμένων αποικιών ή συνεχούς χλοοτάπητα. Επιφανειακή καλλιέργεια σε εργαστηριακές συνθήκεςχρησιμοποιούνται ευρέως για την απόκτηση συσσωρευτικών και αγνούς πολιτισμούς, την αποθήκευση τους, τη μελέτη μορφολογικών, πολιτιστικών και βιοχημικών χαρακτηριστικών μικροοργανισμών. Στη βιομηχανία, η μέθοδος των επιφανειακών καλλιεργειών σε υγρά μέσα χρησιμοποιείται για τη λήψη κιτρικού οξέος, σε χαλαρά μέσα - για την παραγωγή ενζυμικών παρασκευασμάτων.

1. Προετοιμασία πιάτων και αποστείρωση τους.

2. Προετοιμασία θρεπτικού μέσου και αποστείρωση του.

3. Υπολογισμός της ποσότητας νερού που απαιτείται για την υγρασία του θρεπτικού μέσου.

4. Υγρασία αποστειρωμένου θρεπτικού μέσου, εμβολιασμός και διάταξη σε κυβέτες για καλλιέργεια.

1. Προετοιμασία πιάτων για αποστείρωση. Όλα τα σκεύη πρέπει να πλένονται καλά και να στεγνώνουν σε φούρνο πριν την αποστείρωση.

Για την αποστείρωση, τα ακόλουθα αντικείμενα πρέπει να τυλιχτούν σε χαρτί και να δεθούν προσεκτικά με κορδόνια: μια κυβέτα, ένα καπάκι στην κυβέτα.

Η αποστείρωση των πιάτων και του νερού πρέπει να πραγματοποιείται σε αυτόκλειστο σε θερμοκρασία 120ºС για 0,5 ώρες.

Τα αποστειρωμένα πιάτα μετά την αποστείρωση σε αυτόκλειστο θα πρέπει να στεγνώσουν σε φούρνο στους 105 ºС, καθώς το χαρτί υγραίνεται ελαφρά κατά την αποστείρωση.

2. Παρασκευή και αποστείρωση του θρεπτικού μέσου. Για κάθε μικροοργανισμό παρασκευάζεται το δικό του θρεπτικό μέσο, ​​το οποίο εξασφαλίζει τη βιοσύνθεση ορισμένων ενζύμων.Το μέσο για κάθε κυψελίδα αποστειρώνεται χωριστά. Το παρασκευασμένο μέσο τοποθετείται είτε σε σακούλα, είτε σε χαρτοπετσέτα πολλαπλών στρώσεων, είτε σε φαρδύ γυάλινο ποτήρι. Για τον Ασπ. oryzae, για παράδειγμα, χρησιμοποιούνται οι ακόλουθες παραλλαγές θρεπτικών μέσων: πίτουρο σίτου-100,70; φύτρα βύνης-30; πολτός τεύτλων-50; πυρήνες σταφυλιών-20; φύτρα βύνης-50; φλοιός ρυζιού-50.

3. Για φυσιολογική ανάπτυξημικροσκοπικός μύκητας και εντατικός σχηματισμός ενζύμων, είναι απαραίτητο το περιβάλλον να έχει υγρασία 58-63%.

Ο υπολογισμός της ποσότητας του προστιθέμενου νερού πραγματοποιείται σύμφωνα με τα ακόλουθα δεδομένα:

Acp είναι η μάζα του θρεπτικού μέσου με την αρχική περιεκτικότητα σε υγρασία.

Cav είναι η μάζα του θρεπτικού μέσου με την απαιτούμενη περιεκτικότητα σε υγρασία.

Το Gav είναι η μάζα του θρεπτικού μέσου μετά την αποστείρωση.

D είναι η ποσότητα νερού που πρέπει να προστεθεί για να ληφθεί ένα θρεπτικό μέσο της απαιτούμενης υγρασίας.

Εργαστήριο #2

Θέμα:Εκχύλιση ενζύμων που αναπτύσσονται στην επιφάνεια

Σκοπός:Να μπορεί να καλλιεργεί μικροοργανισμούς με επιφανειακή μέθοδο σε στερεά θρεπτικά μέσα.

Μέθοδος Εκχύλισης Επιφανειακής Καλλιέργειας. Η επιφανειακή καλλιέργεια αερόβιων πραγματοποιείται σε πυκνό ή χαλαρό μέσο, ​​καθώς και σε ένα λεπτό στρώμα υγρού μέσου σε γυάλινα σκεύη με φαρδύ πάτο: πιάτα Petri, φιάλες Winogradsky, στρώματα, κυβέτες. Τα δοχεία με σπόρους καλλιεργούνται σε σταθερή θερμοκρασία σε θερμοστάτες ή θερμοστατικούς χώρους (θερμοθάλαμοι). Οι μικροοργανισμοί αναπτύσσονται στην επιφάνεια του περιβάλλοντος και χρησιμοποιούν οξυγόνο απευθείας από τον αέρα. Σε υγρά μέσα, τα υποχρεωτικά αερόβια αναπτύσσονται με τη μορφή άφθονων φιλμ. Τα προαιρετικά αερόβια (αναερόβια) αναπτύσσονται τόσο στο πάχος του υγρού μέσου, σχηματίζοντας αιωρήματα, νιφάδες, ίζημα, όσο και στην επιφάνεια με τη μορφή λεπτής μεμβράνης. Σε πυκνά μέσα, οι μικροοργανισμοί αναπτύσσονται με τη μορφή μεμονωμένων αποικιών ή συνεχούς χλοοτάπητα. Η επιφανειακή καλλιέργεια σε εργαστηριακές συνθήκες χρησιμοποιείται ευρέως για την απόκτηση εμπλουτισμού και καθαρών καλλιεργειών, την αποθήκευση τους και τη μελέτη μορφολογικών, πολιτισμικών και βιοχημικών χαρακτηριστικών μικροοργανισμών. Στη βιομηχανία, η μέθοδος των επιφανειακών καλλιεργειών σε υγρά μέσα χρησιμοποιείται για τη λήψη κιτρικού οξέος, σε καλλιέργειες χύμα - για την παραγωγή ενζυμικών παρασκευασμάτων.

Σε αυτήν την εργαστηριακή εργασία, είναι πιο βολικό να χρησιμοποιείτε μικροσκοπικούς μύκητες ή μικροοργανισμούς που μοιάζουν με ζύμη, όπως το Asp niger. Rh. Delemar κλπ.

Εργαστήριο #3

Θέμα:Καλλιέργεια μικροοργανισμών με βαθιά μέθοδο.

Σκοπός:Να μπορεί να καλλιεργεί μικροοργανισμούς με βαθύ τρόπο.

Βαθιά καλλιέργεια. Η βαθιά καλλιέργεια μικροοργανισμών μπορεί να είναι περιοδική και συνεχής. Σε μια διαδικασία παρτίδας, ολόκληρος ο όγκος του θρεπτικού μέσου εμβολιάζεται με εμβόλιο και η καλλιέργεια πραγματοποιείται υπό βέλτιστες συνθήκες για ορισμένο χρονικό διάστημα έως ότου σωστό ποσόβιομάζα ή προϊόν-στόχο. Για να εξασφαλιστεί η ανάπτυξη αερόβιων καλλιεργειών στα βαθιά στρώματα του υγρού, είναι απαραίτητη η παροχή οξυγόνου. Δεδομένου ότι τα μικροβιακά κύτταρα μπορούν να χρησιμοποιούν μόνο διαλυμένο οξυγόνο και η διαλυτότητά του είναι χαμηλή (4-7 mg / g)

Απλό και προσιτό τρόποπεριοδική βυθισμένη καλλιέργεια είναι η καλλιέργεια αερόβιων καλλιεργειών σε αιωρούμενη κατάσταση σε υγρό μέσο που χύνεται σε μικρούς όγκους σε δοκιμαστικούς σωλήνες και φιάλες.

Η συνεχής βαθιά καλλιέργεια πραγματοποιείται σε εργαστηριακούς ζυμωτήρες. Η διαδικασία της συνεχούς καλλιέργειας στον ζυμωτήρα πραγματοποιείται σύμφωνα με τον τύπο χημειοστάτη ή τουρμπιδοστάτη.

Σκοπός αυτής της εργασίας είναι να αναπτυχθούν παραγωγοί διαφόρων ενζύμων σε υγρά θρεπτικά μέσα με τη βαθιά μέθοδο και να αναλυθούν οι ληφθείσες καλλιέργειες μικροοργανισμών για την περιεκτικότητα ορισμένων ενζύμων σε αυτές.

Όπως και στην πρώτη εργαστηριακή εργασία, είναι απαραίτητο να προσδιοριστεί το εμβόλιο, το οποίο παρασκευάζεται με ανάπτυξη του παραγωγού σε διάφορα περάσματα σε μέσα άγαρ σε δοκιμαστικούς σωλήνες ή στρώματα.

Στην εργαστηριακή εργασία ο μαθητής παρασκευάζει 0,7 dm 3 του θρεπτικού μέσου. Αρχικά ζυγίζεται ένα ποτήρι ζέσεως σε τεχνική ζυγαριά και στη συνέχεια όλα τα απαραίτητα συστατικά του μέσου ζυγίζονται μέσα στο ποτήρι ζέσεως. Τα υγρά συστατικά του μέσου μετρώνται κατ' όγκο.

Τα άλατα διαλύονται χωρίς ιδιαίτερες προφυλάξεις. Το άμυλο ή το αλεύρι αναμειγνύονται σε αναλογία 1:10 με κρύο νερόκαι παρασκευάζεται σε λουτρό με βραστό νερό.

Παραλλαγές θρεπτικών μέσων για την καλλιέργεια μικροοργανισμών-παραγωγών ενζύμων.

Τραπέζι 1

Συστατικά του μέσου καλλιέργειας	Παραλλαγές θρεπτικών μέσων και περιεκτικότητα σε συστατικά,%
ασπίδα. Oryzae	0,3
Εκχύλισμα καλαμποκιού	0,3	0,4	2,0
αλεύρι σόγιας	0,5	4,0	2,0
Καλαμποκάλευρο	2,0	-	0,5
μαγιά ζωοτροφών	-	-	0,2
Ανθρακικό ασβέστιο	-	0,1	0,2
Φλαμουριά. bitatae	1,0
Πολυαλκοολικό διήθημα αποχρωματισμού	98,3	96,8	-
Άμυλο καλαμποκιού	1,5	-	0,2
Τεχνικός μαγνησίτης	0,2	0,2	1,5
αλεύρι σίκαλης	-	2,5	1,0
Εκχύλισμα καλαμποκιού	0,2	0,5	1,0

Για κάθε επιλογή, λαμβάνονται τέσσερις φιάλες, 120 cm 3 του παρασκευασμένου μέσου χύνονται σε καθεμία. Οι φιάλες κλείνονται με βαμβακερά πώματα, τα πώματα καλύπτονται με χοντρά χάρτινα πώματα για να μην υγραίνονται κατά την αποστείρωση. Ταυτόχρονα με τις κουνιστές φιάλες, τοποθετείται μια φιάλη με 50 cm 3 μέσου για αποστείρωση για τον μετέπειτα προσδιορισμό του pH της.

Ορισμοί μεσαίου pH

Το pH του μέσου προσδιορίζεται με την ηλεκτρομετρική μέθοδο δύο φορές: πριν και μετά την αποστείρωση, κάθε φορά πραγματοποιούνται τρεις επαναλήψεις αυτών των προσδιορισμών και στη συνέχεια αναλύεται η αξιοπιστία αυτών των αποτελεσμάτων.

Εμβολιασμός του θρεπτικού μέσου

Αφού ολοκληρωθεί η αποστείρωση και ανοίξει το αυτόκλειστο, οι πιπέτες τοποθετούνται για 10-15 λεπτά. Σε ζεστό φούρνο για να στεγνώσει το χαρτί, οι φιάλες και άλλα πιάτα αφήνονται στο αυτόκλειστο για 10-15 λεπτά. Ο εμβολιασμός του θρεπτικού μέσου πραγματοποιείται σε κουτί.

Εργαστήριο #4

Προσδιορισμός δραστικότητας καταλάσης

Η καταλάση ανήκει στην πρώτη κατηγορία ενζύμων (οξειδορεδουκτάσες) και καταλύει την αποσύνθεση του υπεροξειδίου του υδρογόνου σε νερό και οξυγόνο σύμφωνα με την εξίσωση:

Το Catalase παίζει σημαντικός ρόλοςστη ζωτική δραστηριότητα των οργανισμών, καθώς καταστρέφει το υπεροξείδιο του υδρογόνου, το οποίο είναι δηλητηριώδες για τα κύτταρα και σχηματίζεται κατά την αναπνοή.

Ο ποσοτικός προσδιορισμός της καταλάσης βασίζεται στον υπολογισμό του υπεροξειδίου του υδρογόνου με τιτλοδότηση με υπερμαγγανικό κάλιο. Η αντίδραση γίνεται σύμφωνα με την εξίσωση:

2KMnO 4 + 5H 2 O 2 + 4H 2 SO 4 2KHSO → 4 + 2MnSO 4 + 8H 2 O + 5O 2

Η ποσότητα του υπεροξειδίου του υδρογόνου που καταστρέφεται από το ένζυμο κρίνεται από τη διαφορά μεταξύ των ποσοτήτων διαλύματος 0,1 mol/DM 3 KMnO 4 που χρησιμοποιούνται για τιτλοδότηση στα πειράματα ελέγχου και εργασίας.

Υλικό δοκιμής:βύνη (φυτρωμένο σιτάρι)

Αντιδραστήρια:διάλυμα υπεροξειδίου του υδρογόνου ω (H 2 O 2) = 1%

διάλυμα θειικού οξέος ω (H 2 SO 4) = 10%

διάλυμα υπερμαγγανικού καλίου C (1/5 KMnO 4) = 0,1 mol / dm 3

5 g του υλικού δοκιμής εγχύονται σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά με 100 cm 3 νερό, αναδεύοντας περιοδικά τα περιεχόμενα της φιάλης. Μετά την έγχυση, το υγρό διηθείται μέσω ενός ξηρού πτυχωμένου φίλτρου και δύο δόσεις των 20 cm 3 το καθένα (ένα πειραματικό και ένα μάρτυρας) λαμβάνονται από ένα διαυγές διάλυμα με μια πιπέτα και το καθένα μεταφέρεται σε ξεχωριστή κωνική φιάλη για 200 cm 3 . Ο μάρτυρας βράζεται για 3 λεπτά για να απενεργοποιηθεί το ένζυμο.

20 cm 3 απεσταγμένου νερού, 4 cm 3 υπεροξειδίου του υδρογόνου προστίθενται στα πειραματικά δείγματα και τα δείγματα ελέγχου και αφήνονται για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου για να δράσει το ένζυμο. Μετά από 20 λεπτά, 5 cm 3 θειικού οξέος προστίθενται στα δείγματα και το υπόλοιπο (μη αποσυντεθειμένο) υπεροξείδιο του υδρογόνου τιτλοδοτείται με διάλυμα υπερμαγγανικού καλίου.

Η δράση της καταλάσης εκφράζεται σε μικρογραμμομόρια υπεροξειδίου του υδρογόνου που αποσυντίθεται υπό τη δράση του ενζύμου σε 1 λεπτό ανά 1 g του υλικού δοκιμής.

Η δραστικότητα της καταλάσης προσδιορίζεται από τον τύπο:

όπου Χ είναι η δραστηριότητα της καταλάσης.

α - η ποσότητα 0,1 mol / dm 3 διαλύματος KMnO 4 που χρησιμοποιείται για την τιτλοδότηση του διαλύματος ελέγχου, cm 3.

β - την ποσότητα του διαλύματος 0,1 mol/DM 3 KMnO 4 που χρησιμοποιείται για την τιτλοδότηση του διαλύματος δοκιμής, cm 3 .

K - διόρθωση στον τίτλο.

100 είναι ο συνολικός όγκος του εκχυλίσματος, cm3.

50 είναι ο συντελεστής μετατροπής για μικρογραμμομόρια Η 2 Ο 2 .

20-όγκος διαλύματος ενζύμου, cm3;

20 – χρόνος ενζυματικής αντίδρασης, min;

P - δείγμα του υλικού δοκιμής που ελήφθη για ανάλυση, ζ.

Εργαστηριακή εργασία №5.

Χρωματομετρική μέθοδος προσδιορισμού της δραστικότητας της α- και β-αμυλάσης

Κάτω από τη δράση των αμυλασών στα φυτά, η υδρόλυση ενός υδατάνθρακα υψηλής πολυμερούς - αμύλου - συμβαίνει με το σχηματισμό δεξτρινών και μαλτόζης. Στα φυτά ανευρίσκονται α- και β-αμυλάσες.

Ο ξεχωριστός ποσοτικός προσδιορισμός της δραστικότητας των α- και β-αμυλασών βασίζεται στη διαφορετική θερμική σταθερότητά τους: η β-αμυλάση καταστρέφεται με θέρμανση στους 70 °C, ενώ η α-αμυλάση διατηρεί τη δραστηριότητά της.

Οι μέθοδοι για τον προσδιορισμό της δραστικότητας της αμυλάσης βασίζονται είτε στη συνεκτίμηση της ποσότητας σακχάρου που σχηματίζεται κατά τη δράση του ενζύμου στο άμυλο είτε στη λήψη υπόψη της ποσότητας αμύλου που δεν αποικοδομείται από το ένζυμο, η οποία προσδιορίζεται φωτομετρικά μετά την επεξεργασία με διάλυμα ιωδίου.

Αντιδραστήρια:οξικό ρυθμιστικό pH 5,5;

διάλυμα χλωριούχου νατρίου ω (NаСl) = 1%;

διάλυμα αμύλου ω \u003d 10%, (2 g αμύλου αναμεμειγμένο σε 20 cm 3 κρύο νερό, χύνεται σε 80 cm 3 βραστό νερό, μετά από το οποίο θερμαίνονται σε λουτρό βραστό νερό μέχρι το διάλυμα να γίνει διαυγές).

λύση του υδροχλωρικού οξέος C (HCl) \u003d 1 mol / dm 3

διάλυμα υδροχλωρικού οξέος C (HCl) \u003d 0,1 mol / dm 3

διάλυμα ιωδίου ω = 0,3% σε διάλυμα ιωδιούχου καλίου 3%.

Μια μερίδα 0,5 - 1 g αλεύρου ή δενδρυλλίων αλέθεται σε γουδί με μικρή ποσότητα διαλύματος NaCl 1% και μεταφέρεται σε κωνική φιάλη 50 cm 3. Η αναλογία μεταξύ του δείγματος και του διαλύματος NaCl είναι 1:10 ή 1:20. Το περιεχόμενο της φιάλης αναμειγνύεται καλά και αφήνεται να παραμείνει σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά, ανακινώντας περιστασιακά. Στη συνέχεια διηθήθηκε μέσω ενός πυκνού πτυχωμένου φίλτρου. Όταν η διήθηση είναι δύσκολη, η διήθηση και η φυγοκέντρηση στις 4000-5000 rpm μπορούν να συνδυαστούν. Ως ενζυμικό παρασκεύασμα χρησιμοποιείται ένα διαυγές διάλυμα.

Για να προσδιοριστεί η δραστικότητα της α- και β-αμυλάσης, λαμβάνονται 4 δοκιμαστικοί σωλήνες (2 πειραματικοί και 2 έλεγχοι) και προστίθενται σε αυτούς 3 cm 3 οξικού ρυθμιστικού και 3 cm 3 διαλύματος αμύλου 2%. Το μείγμα θερμαίνεται σε λουτρό νερού ή σε θερμοστάτη στους 40°C. Στη συνέχεια, 0,2-1,0 cm 3 του παρασκευάσματος ενζύμου προστίθενται στους δοκιμαστικούς σωλήνες (ανάλογα με τη δραστηριότητα των αμυλασών στο αντικείμενο μελέτης) και η ίδια ποσότητα Η 2 Ο προστίθεται στους σωλήνες ελέγχου. Οι σωλήνες αναμειγνύονται και τοποθετούνται σε θερμοστάτη στους 40 ° C για 30 ή 60 λεπτά. Μετά την επώαση, 2 cm 3 1 N χύνονται αμέσως σε κάθε δοκιμαστικό σωλήνα. Διάλυμα HCl για τη διακοπή της δράσης των αμυλασών.

Για την ανίχνευση αμύλου που δεν αντέδρασε με το ένζυμο, πραγματοποιείται αντίδραση με ιώδιο. Περίπου 30 cm 3 νερού χύνονται σε ογκομετρικές φιάλες ανά 50 cm 3, 1 cm 3 0,1 n. HCl, 5 σταγόνες διαλύματος ιωδίου 0,3% και προσθέστε 0,5 cm 3 του μείγματος από κάθε σωλήνα. Τα περιεχόμενα των φιαλών αναμειγνύονται καλά, φέρονται στο σημάδι με νερό και χρωματομετρικά σε φωτοηλεκτρικό χρωματόμετρο με φίλτρο κόκκινου φωτός ή σε φασματοφωτόμετρο στα 595 nm σε κυψελίδα με μήκος εργασίας 1 cm.

Για να προσδιοριστεί η δράση της α-αμυλάσης, 5 cm 3 του διηθήματος (παρασκεύασμα ενζύμου) χύνεται σε κωνική φιάλη 100 cm 3, προστίθεται ξηρό οξικό ασβέστιο στην άκρη ενός μαχαιριού και διατηρείται για 15 λεπτά σε υπερθερμοστάτη ή σε ένα λουτρό νερού στους 70 ° C (οι διακυμάνσεις της θερμοκρασίας επιτρέπονται όχι περισσότερες από 0,5 ° C). Τα περιεχόμενα της φιάλης στη συνέχεια ψύχονται ταχέως σε δοχείο με κρύο νερό. Με μια τέτοια θέρμανση, η β-αμυλάση απενεργοποιείται πλήρως και η α-αμυλάση διατηρεί τη δράση της. Περαιτέρω, ο προσδιορισμός της δραστικότητας της α-αμυλάσης μειώνεται στη διαδικασία που περιγράφηκε παραπάνω.

Η δράση και των δύο ενζύμων εκφράζεται σε χιλιοστόγραμμα υδρολυμένου αμύλου υπό πειραματικές συνθήκες (για 30 λεπτά ή 1 ώρα) ανά 1 g αλεύρου (φύτρα). Η δραστικότητα της β-αμυλάσης προσδιορίζεται από τη διαφορά μεταξύ της συνολικής δραστικότητας των α- και β-αμυλασών και της δραστικότητας της α-αμυλάσης. Η δραστικότητα αμυλάσης ανά 1 g αλεύρου για 1 ώρα υπολογίζεται χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο:

όπου D είναι η οπτική πυκνότητα του διαλύματος ελέγχου.

D 1 - οπτική πυκνότητα του διαλύματος δοκιμής.

α - η ποσότητα του προστιθέμενου αμύλου (60 mg).

m - βάρος δείγματος, g;

V είναι ο όγκος του αρχικού εκχυλίσματος ενζύμου, cm 3

V 1 - όγκος εκχυλίσματος που ελήφθη για επώαση, cm 3 .

Εργαστήριο #6

©2015-2019 ιστότοπος
Όλα τα δικαιώματα ανήκουν στους δημιουργούς τους. Αυτός ο ιστότοπος δεν διεκδικεί την πνευματική ιδιοκτησία, αλλά παρέχει δωρεάν χρήση.
Ημερομηνία δημιουργίας σελίδας: 13-02-2016

Εργαστήριο #1

Θέμα: Καταλυτική δράση ενζύμων σε ζωντανά κύτταρα

Στόχος:Προσδιορίστε την καταλυτική λειτουργία των πρωτεϊνών σε ζωντανά κύτταρα, σχηματίστε γνώση για το ρόλο των ενζύμων στα κύτταρα, παγιώστε την ικανότητα εργασίας με μικροσκόπιο, διεξαγωγή πειραμάτων και επεξήγηση των αποτελεσμάτων της εργασίας. Εξοπλισμός:ωμές και βραστές πατάτες, φύλλο elodea (άλλο φυτό), φρέσκο ​​διάλυμα υπεροξειδίου του υδρογόνου 3%, δοκιμαστικοί σωλήνες, τσιμπιδάκια, άμμος, γουδί και γουδοχέρι, σημειωματάριο, στυλό, μολύβι, χάρακας.

Πρόοδος:

Ετοιμάστε δύο δοκιμαστικούς σωλήνες και βάλτε λίγη άμμο στον πρώτο, ένα κομμάτι ωμής πατάτας στο δεύτερο, ένα κομμάτι βραστή πατάτα στον τρίτο.Ρίξτε λίγο υπεροξείδιο του υδρογόνου σε καθέναν από τους δοκιμαστικούς σωλήνες. Παρατηρήστε τι θα συμβεί σε κάθε έναν από τους δοκιμαστικούς σωλήνες.

Αλέστε ένα κομμάτι ωμής πατάτας με μια μικρή ποσότητα άμμου σε ένα γουδί.

Μεταφέρετε τις θρυμματισμένες πατάτες μαζί με την άμμο σε δοκιμαστικό σωλήνα και ρίχνετε λίγο υπεροξείδιο του υδρογόνου.

Συγκρίνετε τη δραστηριότητα του θρυμματισμένου και ολόκληρου φυτικού ιστού.

Δημιουργήστε έναν πίνακα που δείχνει τη δραστηριότητα κάθε ιστού κάτω από διαφορετικές θεραπείες. Εξηγήστε τα αποτελέσματά σας. Απάντησε στις ερωτήσεις:

Παρατηρήσεις

Υπεροξείδιο του υδρογόνου και ωμές πατάτες

Απελευθερώνεται οξυγόνο, η πρωτεΐνη διασπάται σε πρωτογενής δομήκαι μετατρέπεται σε αφρό

Υπεροξείδιο του υδρογόνου και βραστές πατάτες

Καμία αντίδραση

Απαντήστε στις ερωτήσεις: Σε ποιους δοκιμαστικούς σωλήνες εκδηλώθηκε η δραστηριότητα του ενζύμου καταλάση; Εξήγησε γιατί.

Η καταλάση είναι ένα ένζυμο που καταλύει την αποσύνθεση του υπεροξειδίου του υδρογόνου σε νερό και μοριακό οξυγόνο: H2O2 + H2O2 = O2 + 2H2O. Βιολογικός ρόλοςΤο Κ. συνίσταται στην αποικοδόμηση του υπεροξειδίου του υδρογόνου, το οποίο σχηματίζεται στα κύτταρα ως αποτέλεσμα της δράσης ενός αριθμού φλαβοπρωτεϊνικών οξειδασών (οξειδάση ξανθίνης, οξειδάση γλυκόζης, μονοαμινοξειδάση κ.λπ.) και την παροχή αποτελεσματικής προστασίας κυτταρικές δομέςαπό την καταστροφή από το υπεροξείδιο του υδρογόνου. Η γενετικά καθορισμένη ανεπάρκεια του Κ. είναι μία από τις αιτίες της λεγόμενης ακαταλασίας, μιας κληρονομικής νόσου που κλινικά εκδηλώνεται με εξέλκωση του ρινικού και στοματικού βλεννογόνου, μερικές φορές έντονες ατροφικές αλλαγές στα κυψελιδικά διαφράγματα και απώλεια δοντιών. Η δραστηριότητα εμφανίστηκε σε 1,3 δοκιμαστικούς σωλήνες, tk. είχαν ωμές τροφές που περιείχαν πρωτεΐνες. Και στους υπόλοιπους δοκιμαστικούς σωλήνες υπήρχαν προϊόντα με πρωτεΐνη που καταστράφηκε κατά τη διαδικασία μαγειρέματος και η αντίδραση δεν εκδηλώθηκε. Επομένως, το σώμα απορροφάται καλύτερα από τροφές που περιέχουν πρωτεΐνη.

Πώς εκδηλώνεται η ενζυμική δραστηριότητα σε ζωντανούς και νεκρούς ιστούς;Εξηγήστε το παρατηρούμενο φαινόμενο. Στους νεκρούς ιστούς, η ενζυμική δραστηριότητα απουσιάζει, επειδή. η πρωτεΐνη σε αυτά καταστράφηκε κατά το μαγείρεμα. Και στους ζωντανούς ιστούς, κατά την αλληλεπίδραση με το υπεροξείδιο του υδρογόνου, απελευθερώθηκε οξυγόνο και η πρωτεΐνη, που χωρίστηκε στην πρωτογενή δομή, μετατράπηκε σε αφρό.

Πώς η άλεση ιστών επηρεάζει τη δραστηριότητα του ενζύμου σε ζωντανούς ιστούς φυτών και ζώων;Κατά την άλεση ζωντανού ιστού, η αντίδραση είναι ταχύτερη, γιατί. η περιοχή επαφής μεταξύ πρωτεΐνης και υπεροξειδίου του υδρογόνου αυξάνεται Πώς θα προτείνατε να μετρήσετε τον ρυθμό αποσύνθεσης του υπεροξειδίου του υδρογόνου; v=kc(a)c(b) όπου v είναι ο ρυθμός μιας χημικής αντίδρασης k είναι η σταθερά ταχύτητας c είναι η μεταβολή της συγκέντρωσης Πιστεύετε ότι όλοι οι ζωντανοί οργανισμοί περιέχουν το ένζυμο καταλάση, το οποίο αποσυνθέτει το υπεροξείδιο του υδρογόνου;

Να αιτιολογήσετε την απάντηση. Δεδομένου ότι αυτό είναι ένα ένζυμο της κατηγορίας οξειδοαναγωγάσης, καταλύει την αποσύνθεση του υπεροξειδίου του υδρογόνου, το οποίο είναι τοξικό για τα ζωντανά κύτταρα, σε νερό και οξυγόνο. Βρίσκεται στα λυσοσώματα. Μπορεί να συναχθεί το συμπέρασμα ότι περιέχεται σε όλα τα κύτταρα των ζωντανών οργανισμών. Εξηγήστε τις παρατηρήσεις σας. Διατυπώστε ένα συμπέρασμα.

Συμπέρασμα: η πρωτεΐνη βρίσκεται μόνο σε ζωντανές τροφές, και στα μαγειρεμένα τρόφιμα, η πρωτεΐνη καταστρέφεται, επομένως δεν εμφανίζεται καμία αντίδραση με αυτά. Εάν αλέσετε τα προϊόντα, τότε η αντίδραση θα γίνει πιο γρήγορα.

Εισαγωγή

Αυτό το εγχειρίδιο έχει σκοπό να εξοικειώσει τους μαθητές τόσο με τις κλασικές μεθόδους μελέτης των ενζύμων όσο και με τις σύγχρονες, εξαιρετικά ευαίσθητες μεθόδους. Αναλυτικές μέθοδοιχρησιμοποιώντας ένζυμα ως ερευνητικά εργαλεία. Το εγχειρίδιο αποτελείται από πέντε ενότητες:

1. Μέθοδοι προσδιορισμού της δραστικότητας των ενζύμων.

2. Μελέτη των κινητικών παραμέτρων των ενζυματικών αντιδράσεων.

3. Μέθοδοι απομόνωσης και καθαρισμού ενζύμων.

4. Μελέτη υποκυτταρικού εντοπισμού ενζύμων.

5. Χρήση ενζύμων ως αναλυτικά αντιδραστήρια.

Όλες οι ενότητες της «Πρακτικής» έχουν ανεξάρτητα καθήκονταΩστόσο, οι απαιτήσεις για τους μαθητές παραμένουν οι ίδιες. Κάθε προτεινόμενη εργασία είναι μια μικρή πιλοτική μελέτη. Κατά την εκτέλεση οποιουδήποτε από αυτά, ο μαθητής πρέπει να προετοιμάσει ανεξάρτητα όλες τις απαραίτητες λύσεις, να κυριαρχήσει τις απαραίτητες μεθόδους έρευνας, να πραγματοποιήσει ένα πείραμα και να συντάξει τα αποτελέσματα με τη μορφή αναφοράς, απεικονίζοντας τα δεδομένα που ελήφθησαν με πίνακες και γραφήματα.

Επίπεδο που χρησιμοποιείται μεθοδολογικές τεχνικέςσυμμορφώνεται με τις απαιτήσεις σύγχρονη επιστήμη. Εάν είναι απαραίτητο, η περιγραφή της εργασίας παρέχει σύντομη θεωρητικές πληροφορίες. Όλα τα έργα που περιλαμβάνονται στο «Εργαστήρι» εκτελέστηκαν επανειλημμένα από μαθητές.

Εργασία 1. Τιτρομετρικός προσδιορισμός δραστικότητας καταλάσης

Εξοπλισμός και αντιδραστήρια: λουτρό βραστό νερό. πιπέτες για 5, 10, 20 και 25 ml. κύλινδροι μέτρησης με μύτη για 10 και 25 ml. Ογκομετρική φιάλη 100 ml. Κωνικές φιάλες των 200 ml. κονίαμα και γουδοχέρι πορσελάνη? υπερμαγγανικό κάλιο (0,1 N); θειικό οξύ(δέκα %); ανθρακικό νάτριο; υπεροξείδιο του υδρογόνου (0,1 Ν); φρέσκο ​​φυτικό υλικό (πατάτες ή καρότα).

2 g ωμές πατάτες (ή καρότα) αλέθονται σε γουδί, προσθέτοντας σταδιακά 2-3 ml νερό. Για να μειώσετε την όξινη αντίδραση, προσθέστε ανθρακικό νάτριο στην άκρη της σπάτουλας μέχρι να σταματήσουν οι φυσαλίδες διοξείδιο του άνθρακα. Η κονιοποιημένη μάζα μεταφέρεται ποσοτικά σε ογκομετρική φιάλη και ρυθμίζεται με νερό σε όγκο 100 ml. Το μείγμα αφήνεται σε ηρεμία για 30 λεπτά και στη συνέχεια διηθείται. Στη συνέχεια, η δραστηριότητα προσδιορίζεται σύμφωνα με το σχήμα (2 πειραματικά δείγματα και 2 δείγματα ελέγχου):

Η εμπειρία και ο έλεγχος τιτλοδοτούνται με 0,1 N. διάλυμα υπερμαγγανικού καλίου (μέχρι να σταθεροποιηθεί ένα ανοιχτό ροζ χρώμα για περίπου 1 λεπτό). Σημειώνεται η ποσότητα διαλύματος υπερμαγγανικού καλίου που χρησιμοποιείται για την τιτλοδότηση του υπολειπόμενου (μετά από ενζυματική αποσύνθεση) υπεροξειδίου του υδρογόνου στη δοκιμαστική φιάλη και για την τιτλοδότηση όλου του υπεροξειδίου του υδρογόνου στη φιάλη ελέγχου. Η διαφορά μεταξύ της πειραματικής και της τιτλοδότησης ελέγχου χρησιμοποιείται για να βρεθεί η ποσότητα υπερμαγγανικού που ισοδυναμεί με την ποσότητα υπεροξειδίου του υδρογόνου που αποσυντίθεται από το ένζυμο.

Ο υπολογισμός πραγματοποιείται σύμφωνα με την εξίσωση αντίδρασης:

5H2O2 + 2KMnO4 + 3H2SO4 > 2MnSO4 + K2SO4 + 5O2 + 8H2O,

σύμφωνα με την οποία 1 ml διαλύματος υπερμαγγανικού καλίου 0,1 n αντιστοιχεί σε 1,7 mg υπεροξειδίου του υδρογόνου.

Παράδειγμα υπολογισμού: εκχύλισμα καταλάσης με όγκο 100 ml παρασκευάστηκε από 1,25 g καρότων: 15,5 ml ξοδεύτηκαν για τιτλοδότηση του πειραματικού δείγματος, 30,2 ml δείγματος ελέγχου χρησιμοποιήθηκαν με διάλυμα υπερμαγγανικού καλίου 0,1 Ν. Η ποσότητα του αποσυντεθειμένου υπεροξειδίου του υδρογόνου στο δείγμα είναι ισοδύναμη με (30,2 - 15,5) 14,7 ml 0,1 N. διάλυμα υπερμαγγανικού καλίου και, επομένως, ίσο με (14,7 1,7) 24,99 mg. Αυτό σημαίνει ότι 1 g ωμά καρότα περιέχει την ποσότητα καταλάσης που μπορεί να αποσυντεθεί = 99,96 mg υπεροξειδίου του υδρογόνου και για 1 λεπτό - (99,96:30) 3,33 mg. Δεδομένου ότι 1 μmol υπεροξειδίου του υδρογόνου είναι 0,034 mg, τότε 1 g καρότου περιέχει (3,33:0,034) 100 U καταλάσης.

1. Υπολογίστε την περιεκτικότητα σε καταλάση στο υλικό δοκιμής.

2. Γράψτε τη συστηματική ονομασία αυτού του ενζύμου, τον κωδικό του σύμφωνα με τον συστηματικό κατάλογο και περιγράψτε τον βιολογικό του ρόλο.