§ 9. ФІЗИКО-ХІМІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ БІЛКІВ

Білки – це дуже великі молекули, за своїми розмірами вони можуть поступатися лише окремим представникам нуклеїнових кислот та полісахаридам. У таблиці 4 представлені молекулярні характеристики деяких білків.

Таблиця 4

Молекулярні характеристики деяких білків

	Відносна молекулярна маса	Число ланцюгів	Число амінокислотних залишків
Рибонуклеаза
Міоглобін
Хімотрипсин
Гемоглобін
Глутамат-дегідрогеназа

У молекулах білків може міститися різна кількість амінокислотних залишків - від 50 і до декількох тисяч; відносні молекулярні маси білків також сильно коливаються - від кількох тисяч (інсулін, рибонуклеазу) до мільйона (глутаматдегідрогеназу) і більше. Число поліпептидних ланцюгів у складі білків може становити від одиниці до кількох десятків і навіть тисяч. Так, до складу білка вірусу тютюнової мозаїки входить 2120 протомірів.

Знаючи відносну молекулярну масу білка, можна приблизно оцінити, скільки амінокислотних залишків входить до його складу. Середня відносна молекулярна маса амінокислот, що утворюють поліпептидний ланцюг, дорівнює 128. При утворенні пептидного зв'язку відбувається відщеплення молекули води, отже, середня відносна маса амінокислотного залишку складе 128 – 18 = 110. Використовуючи ці молекули складатиметься приблизно з 909 амінокислотних залишків.

Електричні властивості білкових молекул

Електричні властивості білків визначаються присутністю на поверхні позитивно і негативно заряджених амінокислотних залишків. Наявність заряджених груп білка визначає сумарний заряд білкової молекули. Якщо в білках переважають негативно заряджені амінокислоти, його молекула в нейтральному розчині матиме негативний заряд, якщо переважають позитивно заряджені – молекула матиме позитивний заряд. Сумарний заряд білкової молекули залежить від кислотності (рН) середовища. При збільшенні концентрації іонів водню (збільшенні кислотності) відбувається пригнічення дисоціації карбоксильних груп:

і в той же час збільшується кількість протонованих аміногруп;

Таким чином, при збільшенні кислотності середовища відбувається зменшення поверхні молекули білка числа негативно заряджених і збільшення числа позитивно заряджених груп. Зовсім інша картина спостерігається при зниженні концентрації іонів водню та збільшенні концентрації гідроксид-іонів. Число дисоційованих карбоксильних груп зростає

і знижується кількість протонованих аміногруп

Отже, змінюючи кислотність середовища, можна змінити заряд молекули білка. При збільшенні кислотності середовища в молекулі білка знижується кількість негативно заряджених угруповань і збільшується кількість позитивно заряджених, молекула поступово втрачає негативний і набуває позитивного заряду. При зниженні кислотності розчину спостерігається протилежна картина. Вочевидь, що з певних значеннях рН молекула буде електронейтральної, тобто. число позитивно заряджених груп дорівнюватиме числу негативно заряджених груп, і сумарний заряд молекули дорівнюватиме нулю (рис. 14).

Значення рН, у якому сумарний заряд білка дорівнює нулю, називається изоэлектрической точкою і позначаєтьсяpI.

Рис. 14. У стані ізоелектричної точки сумарний заряд молекули білка дорівнює нулю

Ізоелектрична точка для більшості білків знаходиться в рН від 4,5 до 6,5. Однак є й винятки. Нижче наведено ізоелектричні точки деяких білків:

При значеннях рН нижче ізоелектричної точки білок несе сумарний позитивний заряд, вище сумарний негативний.

В изоэлектрической точці розчинність білка мінімальна, оскільки його молекули у такому стані електронейтральні і з-поміж них немає сил взаємного відштовхування, тому можуть «злипатися» з допомогою водневих і іонних зв'язків, гидрофобных взаємодій, ван-дер-ваальсових сил. При значеннях рН, відмінних від рI, молекули білка нестимуть однаковий заряд - або позитивний, або негативний. Внаслідок цього між молекулами існуватимуть сили електростатичного відштовхування, що перешкоджають їх «злипання», розчинність буде вищою.

Розчинність білків

Білки бувають розчинні та нерозчинні у воді. Розчинність білків залежить від їхньої структури, величини рН, сольового складу розчину, температури та інших факторів і визначається природою тих груп, які знаходяться на поверхні білкової молекули. До нерозчинних білків відносяться кератин (волосся, нігті, пір'я), колаген (сухожилля), фіброїн (клацання, павутиння). Багато інших білків розчиняються у воді. Розчинність визначається наявністю на поверхні заряджених і полярних угруповань (-СОО - , -NH 3 + , -OH та інших.). Заряджені та полярні угруповання білків притягують до себе молекули води, і навколо них формується гідратна оболонка (рис. 15), існування якої зумовлює їх розчинність у воді.

Рис. 15. Утворення гідратної оболонки навколо молекули білка.

На розчинність білка впливає наявність нейтральних солей (Na 2 SO 4 , (NH 4) 2 SO 4 та ін) у розчині. При малих концентраціях солей розчинність білка збільшується (мал. 16), оскільки в таких умовах збільшується ступінь дисоціації полярних груп і екрануються заряджені групи білкових молекул, тим самим знижується білок-білкова взаємодія, що сприяє утворенню агрегатів та випаданню білка в осад. При високих концентраціях солей розчинність білка знижується (рис. 16) внаслідок руйнування оболонки гідратів, що призводить до агрегації молекул білка.

Рис. 16. Залежність розчинності білка від концентрації солі

Існують білки, які розчиняються тільки в розчинах солей і не розчиняються у чистій воді, такі білки називають глобуліни. Існують і інші білки. альбуміни, вони на відміну від глобулінів добре розчиняються у чистій воді.
Розчинність білків залежить від рН розчинів. Як ми вже зазначали, мінімальну розчинність мають білки в изоэлектрической точці, що пояснюється відсутністю електростатичного відштовхування між молекулами білка.
За певних умов білки можуть утворювати гелі. При утворенні гелю молекули білка формують густу мережу, внутрішній простір якої заповнений розчинником. Гелі утворюють, наприклад, желатину (цей білок використовують для приготування желе) і білки молока при приготуванні кислого молока.
На розчинність білка впливає і температура. При дії високої температури багато білків випадають в осад внаслідок порушення їх структури, але про це детальніше поговоримо в наступному розділі.

Денатурація білка

Розглянемо добре нам знайоме явище. При нагріванні яєчного білка відбувається поступове помутніння, і потім утворюється твердий згусток. Яєчний білок, що згорнувся, - яєчний альбумін - після охолодження виявляється нерозчинним, в той час як до нагрівання яєчний білок добре розчинявся у воді. Такі ж явища відбуваються при нагріванні практично всіх глобулярних білків. Ті зміни, що сталися під час нагрівання, називаються денатурацією. Білки в природному стані звуться нативнихбілків, а після денатурації - денатурованих.
При денатурації відбувається порушення нативної конформації білків в результаті розриву слабких зв'язків (іонних, водневих, гідрофобних взаємодій). В результаті цього процесу можуть руйнуватися четвертинна, третинна та вторинні структури білка. Первинна структура у своїй зберігається (рис. 17).

Рис. 17. Денатурація білка

При денатурації гідрофобні радикали амінокислот, що знаходяться в нативних білках у глибині молекули, опиняються на поверхні, у результаті створюються умови для агрегації. Агрегати білкових молекул випадають осад. Денатурація супроводжується втратою біологічної функції білка.

Денатурація білка може бути спричинена не тільки підвищеною температурою, а й іншими факторами. Кислоти та луги здатні викликати денатурацію білка: в результаті їх дії відбувається перезаряджання іоногенних груп, що призводить до розриву іонних та водневих зв'язків. Сечовина руйнує водневі зв'язки, наслідком є ​​втрата білками своєї нативної структури. Денатуруючими агентами є органічні розчинники та іони важких металів: органічні розчинники руйнують гідрофобні зв'язки, а іони важких металів утворюють нерозчинні комплекси з білками.

Поряд із денатурацією існує і зворотний процес – Ренатурація.При знятті фактора, що денатурує, можливе відновлення вихідної нативної структури. Наприклад, при повільному охолодженні до кімнатної температури розчину відновлюється нативна структура та біологічна функція трипсину.

Білки можуть денатурувати і клітині при протіканні нормальних процесів життєдіяльності. Цілком очевидно, що втрата нативної структури та функції білків – вкрай небажана подія. У зв'язку з цим слід згадати про особливі білки – шаперонах. Ці білки здатні пізнавати частково денатуровані білки і, зв'язуючись з ними, відновлювати їхню нативну конформацію. Шаперони також впізнають білки, процес денатурації яких зайшов далеко, і транспортують їх у лізосоми, де відбувається їхнє розщеплення (деградація). Шаперони відіграють важливу роль і в процесі формування третинної та четвертинної структур під час синтезу білка.

Цікаво знати! В даний час часто згадується таке захворювання, як коров'ячий сказ. Цю хворобу викликають пріони. Вони можуть викликати у тварин і людини та інші захворювання, які мають нейродегенеративний характер. Пріони – це інфекційні агенти білкової природи. Пріон, потрапляючи в клітину, викликає зміну конформації свого клітинного аналога, який сам стає пріоном. Так виникає захворювання. Пріонний білок відрізняється від клітинного за вторинною структурою. Пріонна форма білка має в основномуb-складчасту структуру, а клітинна –a-Спіральну.

Донецька загальноосвітня школа І – ІІІ ступенів № 21

«Білки. Одержання білків реакцією поліконденсації амінокислот. Первинна, вторинна та третинна структури білків. Хімічні властивості білків: горіння, денатурація, гідроліз та кольорові реакції. Біохімічні функції білків».

Підготувала

вчитель хімії

вчитель – методист

м. Донецьк, 2016

«Життя – це спосіб існування білкових тіл»

Тема урока.Білки. Одержання білків реакцією поліконденсації амінокислот. Первинна, вторинна та третинна структури білків. Хімічні властивості білків: горіння, денатурація, гідроліз та кольорові реакції. Біохімічні функції білків.

Цілі уроку.Ознайомити учнів з білками як найвищим ступенем розвитку речовин у природі, які зумовили появу життя; показати їх будову, властивості та різноманітність біологічних функцій; розширити поняття про реакцію поліконденсації на прикладі отримання білків, інформувати школярів про гігієну харчування, про збереження свого здоров'я. Розвивати в учнів логічне мислення.

Реактиви та обладнання.Таблиця «Первинна, вторинна та третинна структури білків». Реактиви: HNO3, NaOH, CuSO4, курячий білок, вовняна нитка, хімічний посуд.

Метод уроку.Інформаційно – розвиваючий.

Тип уроку.Урок засвоєння нових знань та вмінь.

Хід уроку

І. Організаційний момент.

ІІ. Перевірка домашнього завдання, актуалізація та корекція опорних знань.

Бліц опитування

1. Поясніть термін «амінокислота».

2. Назвіть функціональні групи, які входять до складу амінокислот.

3. Номенклатура амінокислот та їх ізомерія.

4. Чому амінокислоти виявляють амфотерні властивості? Напишіть рівняння хімічних реакцій.

5. Завдяки яким властивостям амінокислоти утворюють поліпептиди. Напишіть реакцію поліконденсації амінокислот.

ІІІ. Повідомлення теми, цілі уроку, мотивація навчальної діяльності.

IV. Сприйняття та первинне усвідомлення нового матеріалу.

Вчитель.

«Повсюди, де ми зустрічаємо життя, ми бачимо, що вона пов'язані з яким – чи білковим тілом» - так написав Ф. Енгельс у своїй книзі «Анти – Дюрінг». Нестача білка в їжі призводить до загального послаблення організму, у дітей – до уповільнення розумового та фізичного розвитку. На сьогоднішній день більше половини людства не отримує з їжею необхідної кількості білків. На добу людині необхідно 115 г білка, про запас білок не відкладається на відміну від вуглеводів та жирів, тому слід слідкувати за своїм раціоном. Ми знайомі з вами з кератином - білком з якого складається волосся, нігті, пір'я, шкіра, - він виконує будівельну функцію; знайомі з білком пепсином – він міститься у шлунковому соку та здатний руйнувати інші білки при травленні; білок тромбін бере участь у згортанні крові; гормон підшлункової залози – інсулін – регулює обмін глюкози; гемоглобін транспортує О2 до всіх клітин і тканин організму і т.д.

Звідки ж береться це нескінченне різноманіття білкових молекул, різноманіття їхніх функцій та їхня особлива роль у життєвих процесах? Для того, щоб відповісти на це питання звернемося до складу та будови білків.

До складу білків входять атоми?

Щоб відповісти на це запитання, проведемо розминку. Відгадайте загадки та поясніть зміст відповідей.

1. Він скрізь і скрізь:

У камені, у повітрі, у воді.

Він і в ранковій росі

І в небесах блакиті.

(кисень)

2. Я – найлегший елемент,

У природі без мене жодного кроку.

І з киснем я в момент

3. У повітрі він головний газ,

Оточує всюди нас.

Згасає життя рослин

Без нього, без добрив.

У наших клітинах живе

4. Вирушили школярі якось у похід

(До завдання хімічного це підхід).

Вночі багаття розвели при місяці,

Пісеньки співали про яскравий вогонь.

Відкиньте убік свої сантименти:

Які горіли у вогні елементи?

(Вуглець, водень)

Так, правильно, це основні хімічні елементи, що входять до складу білка.

Про ці чотири елементи можна сказати словами Шіллера «Чотири елементи, зливаючись разом, дають життя і будують світ».

Білки – це природні полімери, що складаються із залишків α – амінокислот, з'єднаних між собою пептидними зв'язками.

До складу білків входить 20 різних амінокислот, звідси випливає величезне різноманіття білків при їх різних комбінаціях. В людини налічується до 100 000 білків.

Історична довідка.

Перша гіпотеза про будову молекули білка була запропонована в 70-х роках. ХІХ ст. Це була уреідна теорія будови білка.

У 1903р. німецьким ученим було висловлено пептидна теорія, що дала ключ до таємниці будови білка. Фішер припустив, що білки є полімерами амінокислот, з'єднаних пептидним зв'язком.

Ідея у тому, що білки – це полімерні освіти, висловлювалася ще 70 – 88 гг. ХІХ ст. російським ученим. Ця теорія отримала підтвердження у сучасних роботах.

Вже перше ознайомлення з білками дає деяке уявлення про надзвичайно складну будову молекул. Отримують білки реакцією поліконденсації амінокислот:

https://pandia.ru/text/80/390/images/image007_47.gif" width="16" height="18">H - N - CH2 - C + H - N - CH2 - C →

https://pandia.ru/text/80/390/images/image012_41.gif" height="20 ">

NH2 - CH - C - N - CH - C - N - CH - C - ... + nH2O →

⸗ O ⸗ O ⸗ O

→ NH2 – CH – C + NH2 – CH – C + NH2 – CH – C + …

OH OH OH OH

4. Вчитель демонструє досвід: горіння вовняної нитки; відчувається запах паленого пір'я – так можна відрізнити шерсть від тканин інших видів.

V. Узагальнення та систематизація знань.

1. Складіть опорний конспект за білками.

основа життя ← Білки → поліпептиди

(C, H, O, N) ↓ ↓ ↓ \ структури білка

хімічні кольорові функції

кі св-ва реакції білка

2. Напишіть рівняння реакції утворення дипептиду з гліцину та валіну.

VI. Підбиття підсумку уроку, домашнє завдання.

Вивчити §38 с. 178 - 184. Виконати тестові завдання с. 183.

№1. Білки: пептидний зв'язок, їхнє виявлення.

Білки – макромолекули лінійних поліамідів, утворених а-амінокислотами внаслідок реакції поліконденсації у біологічних об'єктах.

Білки – це високомолекулярні сполуки, побудовані з амінокислот. У виробництво білків бере участь 20 амінокислот. Вони зв'язуються між собою у довгі ланцюги, які утворюють основу білкової молекули великої молекулярної маси.

Функції білків в організмі

Поєднання своєрідних хімічних та фізичних властивостей білків забезпечує саме цьому класу органічних сполук центральну роль явищах життя.

Білки мають такі біологічні властивості, або здійснюють такі основні функції живих організмів:

1. Каталітична функція білків. Усі біологічні каталізатори – ферменти є білками. Нині охарактеризовано тисячі ферментів, чимало їх виділено у кристалічній формі. Майже всі ферменти - потужні каталізатори, що підвищують швидкість реакцій, принаймні, в мільйон разів. Ця функція білків є унікальною, не властивою іншим полімерним молекулам.

2. Поживна (резервна функція білків). Це, перш за все білки, призначені для харчування зародка, що розвивається: казеїн молока, овальбумін яєць, запасні білки насіння рослин. Ряд інших білків, безсумнівно, використовують у організмі як джерело амінокислот, які, своєю чергою, є попередниками біологічно активних речовин, регулюючих процес обміну речовин.

3. Транспортна функція білків. Транспорт багатьох невеликих молекул та іонів здійснюється специфічними білками. Наприклад, дихальна функція крові, саме перенесення кисню, виконується молекулами гемоглобіну - білка еритроцитів. У транспорті ліпідів беруть участь альбумін сироватки крові. Ряд інших сироваткових білків утворює комплекси з жирами, міддю, залізом, тироксином, вітаміном А та іншими сполуками, забезпечуючи їх доставку до відповідних органів.

4. Захисна функція білків. Основну функцію захисту виконує імунологічна система, яка забезпечує синтез специфічних захисних білків – антитіл – у відповідь на надходження в організм бактерій, токсинів або вірусів (антигенів). Антитіла пов'язують антигени, взаємодіючи з ними, і тим самим нейтралізують їхню біологічну дію і зберігають нормальний стан організму. Згортання білка плазми крові – фібриногену – та утворення згустку крові, що оберігає від втрати крові при пораненнях – ще один приклад захисної функції білків.

5. Коротка функція білків. В акті м'язового скорочення та розслаблення бере участь безліч білків. Головну роль цих процесах грають актин і міозин - специфічні білки м'язової тканини. Скорочувальна функція властива також і білкам субклітинних структур, що забезпечує найтонші процеси життєдіяльності клітин,

6. Структурна функція білків. Білки з такою функцією посідають перше місце серед інших білків тіла людини. Широко поширені такі структурні білки, як колаген у сполучній тканині; кератин у волоссі, нігтях, шкірі; еластин - в судинних стінках та ін.

7. Гормональна (регуляторна) функція білків. Обмін речовин в організмі регулюється різноманітними механізмами. У цій регуляції важливе місце займають гормони, що виробляються залозами внутрішньої секреції. Ряд гормонів представлений білками, або поліпептидами, наприклад гормони гіпофіза, підшлункової залози та ін.

Пептидна зв'язок

Формально утворення білкової макромолекули можна як реакцію поліконденсації α-амінокислот.

З хімічної точки зору білки - це високомолекулярні азотовмісні органічні сполуки (поліаміди), молекули яких побудовані із залишків амінокислот. Мономерами білків служать α-амінокислоти, загальною ознакою яких є наявність карбоксильної групи -СООН та аміногрупи -NH 2 у другого вуглецевого атома (α-вуглецевий атом):

Виходячи з результатів вивчення продуктів гідролізу білків та висунутих А.Я. Данилевським ідей про роль пептидних зв'язків -CO-NH- у побудові білкової молекули, німецький вчений Е. Фішер запропонував на початку XX століття пептидну теорію будови білків. Відповідно до цієї теорії, білки являють собою лінійні полімери α-амінокислот, пов'язаних пептидною зв'язком - поліпептиди:

У кожному пептиді один кінцевий амінокислотний залишок має вільну -аміногрупу (N-кінець), а інший - вільну -карбоксильну групу (С-кінець). Структуру пептидів прийнято зображати, починаючи з N-кінцевої амінокислоти. У цьому амінокислотні залишки позначаються символами. Наприклад: Ala-Tyr-Leu-Ser-Tyr- - Cys. Цим записом позначений пептид, в якому N-кінцевою α-амінокислотою є ­ ється аланін, а С-кінцевий - цистеїн. При читанні такого запису закінчення назв всіх кислот, крім останніх, змінюються на - "іл": аланіл-тирозил-лейцил-серил-тирозил-цистеїн. Довжина пептидного ланцюга в пептидах та білках, що зустрічаються в організмі, коливається від двох до сотень та тисяч амінокислотних залишків.

№2. Класифікація найпростіших білків.

До простим (Протеїнам) відносять білки, що дають при гідролізі тільки амінокислоти.

Протеїноїди ____прості білки тваринного походження, нерозчинні введення, розчини солей, розведені кислоти і луги. Виконують головним чином опорні функції (наприклад, Колаген, кератин

протаміни – позитивно заряджені ядерні білки з молекулярною масою 10-12 kDa. Приблизно на 80% складаються з лужних амінокислот, що дає можливість взаємодіяти з нуклеїновими кислотами за допомогою іонних зв'язків. Беруть участь у регуляції генної активності. Добре розчиняються у воді;

гістони - Ядерні білки, що відіграють важливу роль у регуляції генної активності. Вони знайдені у всіх еукаріотичних клітинах, і розділені на 5 класів, що розрізняються по молекулярній масі та амінокислотному. Молекулярна маса гістонів знаходиться в інтервалі від 11 до 22 kDa, а відмінності в амінокислотному складі стосуються лізину та аргініну, вміст яких варіює від 11 до 29% та від 2 до 14% відповідно;

проламіни – не розчиняються у воді, але розчинні у 70% спирті, особливості хім. будови – багато проліну, глутамінової кислоти немає лізину ,

глутеліни - Розчинні в лужних розчинах ,

глобуліни – білки, які не розчиняються у воді та напівнасиченому розчині сірчанокислого амонію, але розчиняються у водних розчинах солей, лугів та кислот. Молекулярна маса – 90-100 кДа;

альбуміни - білки тварин і рослинних тканин, розчинний у воді та сольових розчинах. Молекулярна маса дорівнює 69 kDa;

склеропротеїни – білки опорних тканин тварин

Як приклади простих білків можуть служити фіброїн шовку, яєчний сироватковий альбумін, пепсин та ін.

№3. Способи виділення та осадження (очищення) білків.

№4. Білки як поліелектроліти. Ізоелектрична точка білка.

Білки є амфотерними поліелектролітами, тобто. виявляють як кислотні, і основні властивості. Це обумовлено наявністю в молекулах білків амінокислотних радикалів, здатних до іонізації, а також вільних α-аміно- та α-карбоксильних груп на кінцях пептидних ланцюгів. Кислотні властивості білку надають кислі амінокислоти (аспарагінова, глутамінова), а лужні властивості – основні амінокислоти (лізин, аргінін, гістидин).

Заряд білкової молекули залежить від іонізації кислих та основних груп амінокислотних радикалів. Залежно від співвідношення негативних і позитивних груп молекула білка загалом набуває сумарний позитивний чи негативний заряд. При підкисленні розчину білка ступінь іонізації аніонних груп знижується, а катіонних підвищується; при підлужуванні - навпаки. При певному значенні рН число позитивно та негативно заряджених груп стає однаковим, виникає ізоелектричний стан білка (сумарний заряд дорівнює 0). Значення рН, при якому білок знаходиться в ізоелектричному стані, називають ізоелектричною точкою і позначають pI, аналогічно амінокислот. Для більшості білків pI лежить у межах 5,5-7,0, що свідчить про деяку перевагу в кислих білках амінокислот. Однак є і лужні білки, наприклад, сальмін - основний білок із молок сьомги (pl=12). Крім того, є білки, у яких pI має дуже низьке значення, наприклад пепсин - фермент шлункового соку (pl=l). В ізоелектричній точці білки дуже нестійкі і легко випадають в осад, володіючи найменшою розчинністю.

Якщо білок не знаходиться в ізоелектричному стані, то в електричному полі його молекули переміщатимуться до катода або анода, залежно від знаку сумарного заряду та зі швидкістю, пропорційною його величині; у цьому полягає сутність методу електрофорезу. Цим способом можна розділяти білки з різним значенням pI.

Білки хоч і мають властивості буфера, але ємність їх при фізіологічних значеннях рН обмежена. Виняток становлять білки, що містять багато гістидину, оскільки тільки радикал гістидину має буферні властивості в інтервалі рН 6-8. Таких білків дуже мало. Наприклад, гемоглобін, що містить майже 8% гістидину, є потужним внутрішньоклітинним буфером в еритроцитах, підтримуючи рН крові на постійному рівні.

№5. Фізико-хімічні властивості білків.

Білки мають різні хімічні, фізичні та біологічні властивості, які визначаються амінокислотним складом та просторовою організацією кожного білка. Хімічні реакції білків дуже різноманітні, вони обумовлені наявністю NH 2 -, СООН-груп та радикалів різної природи. Це реакції нітрування, ацилювання, алкілування, етерифікації, окислення-відновлення та інші. Білки мають кислотно-основні, буферні, колоїдні та осмотичні властивості.

Кислотно-основні властивості білків

Хімічні властивості. При слабкому нагріванні водяних розчинів білків відбувається денатурація. У цьому утворюється осад.

При нагріванні білків із кислотами відбувається гідроліз, при цьому утворюється суміш амінокислот.

Фізико-хімічні властивості білків

Білки мають високу молекулярну вагу.

Заряд білкової молекули. Усі білки мають хоч одну вільну -NH та - СООН групи.

Білкові розчини- колоїдні розчини з різними властивостями. Білки бувають кислими та основними. Кислі білки містять багато глу та асп, у яких є додаткові карбоксильні та менше аміногруп. У лужних білках багато ліз та арг. Кожна молекула білка у водному розчині оточена гідратною оболонкою, так як у білків за рахунок амінокислот є багато гідрофільних угруповань (-СООН, -ОН, -NH 2 -SH). У водяних розчинах білкова молекула має заряд. Заряд білка у воді може змінюватись в залежності від РН.

Осадження білків.Білки мають гідратну оболонку, заряд, що перешкоджає склеюванню. Для осадження необхідно зняти гідратну оболонку та заряд.

1.Гідратація. Процес гідратації означає зв'язування білками води, при цьому вони виявляють гідрофільні властивості: набухають, їхня маса та обсяг збільшується. Набухання білка супроводжується його частковим розчиненням. Гідрофільність окремих білків залежить від їхньої будови. Наявні у складі та розташовані на поверхні білкової макромолекули гідрофільні амідні (-CO-NH-, пептидна зв'язок), амінні (NH2) і карбоксильні (COOH) групи притягують до себе молекули води, строго орієнтуючи їх на поверхню молекули. Оточуючи білкові глобули, гідратна (водна) оболонка перешкоджає стійкості розчинів білка. У ізоелектричній точці білки мають найменшу здатність зв'язувати воду, відбувається руйнування гідратної оболонки навколо білкових молекул, тому вони з'єднуються, утворюючи великі агрегати. Агрегація білкових молекул відбувається і при їх зневодненні за допомогою деяких органічних розчинників, наприклад, етилового спирту. Це призводить до випадання білків в осад. При зміні pH середовища макромолекула білка стає зарядженою, та його гідратаційна здатність змінюється.

Реакції осадження поділяють на два види.

Висолення білків: (NH 4)SO 4 - знімається тільки гідратна оболонка, білок зберігає всі види своєї структури, всі зв'язки, зберігає нативні властивості. Такі білки можна знову розчинити і використовувати.

Осадження зі втратою нативних властивостей білка – процес необоротний. З білка знімається гідратна оболонка та заряд, порушуються різні властивості у білку. Наприклад, солі міді, ртуті, миш'яку, заліза, концентровані неорганічні кислоти - HNO 3 , H 2 SO 4 , HCl, органічні кислоти, алкалоїди - таніни, йодиста ртуть. Додавання органічних розчинників знижує ступінь гідратації та призводить до осадження білка. Як такі розчинники використовують ацетон. Осідають білки також за допомогою солей, наприклад, сульфату амонію. Принцип цього методу заснований на тому, що при підвищенні концентрації солі в розчині відбувається стиснення іонних атмосфер, що утворюються протиіонами білка, що сприяє зближенню їх до критичної відстані, на якій міжмолекулярні сили ван-дер-ваальсового тяжіння переважують кулонівські сили відштовхування. Це призводить до злипання білкових частинок та їх випадання в осад.

При кип'ятінні молекули білків починають хаотично рухатися, стикаються, знімається заряд, зменшується гідратна оболонка.

Для виявлення білків у розчині застосовуються:

кольорові реакції;

реакції осадження.

Методи виділення та очищення білків.

гомогенізація- Клітини розтираються до однорідної маси;

екстракція білків водними чи водно-сольовими розчинами;

1. висолення;

   електрофорез;

   хроматографія:адсорбція, розщеплення;

   ультрацентрифугування.

Структурна організація білків.

Первинна структура- визначається послідовністю амінокислот у пептидному ланцюжку, стабілізується ковалентними пептидними зв'язками (інсулін, пепсин, хімотрипсин).

Вторинна структура- Просторова структура білка. Це або спіраль, або складчастість. Створюються водневі зв'язки.

Третинна структура- глобулярні та фібрилярні білки. Стабілізують водневі зв'язки, електростатичні сили (СОО-, NН3+), гідрофобні сили, сульфідні містки, що визначаються первинною структурою. Глобулярні білки – всі ферменти, гемоглобін, міоглобін. Фібрилярні білки – колаген, міозин, актин.

Четвертична структура- Є тільки деякі білки. Такі білки побудовані з кількох пептидів. Кожен пептид має свою первинну, вторинну, третинну структуру, що називаються протомірами. Декілька протомерів з'єднуються разом в одну молекулу. Один протомір не функціонує як білок, лише у поєднанні з іншими протомірами.

Приклад:гемоглобін = -глобула + -глобула - переносить Про 2 в сукупності, а не окремо.

Білок може ренатурувати.Для цього необхідний дуже короткий вплив агентів.

6) Методи виявлення білків.

Білки – високомолекулярні біологічні полімери, структурними (мономірними) ланками яких є -амінокислоти. Амінокислоти в білках з'єднані один з одним пептидним зв'язком, утворення якої відбувається за рахунок карбоксильної групи, що стоїть у -вуглецевого атома однієї амінокислоти та -амінної групи іншої амінокислоти з виділенням молекули водиМономірні ланки білків називають залишками амінокислот.

Пептиди, поліпептиди та білки відрізняються не тільки кількістю, складом, але й послідовністю амінокислотних залишків, фізико-хімічними властивостями та функціями, що виконуються в організмі. Молекулярна маса білків варіює від 6 тис. до 1 млн і більше. Хімічні та фізичні властивості білків обумовлені хімічною природою та фізико-хімічними властивостями радикалів, що входять до них залишків амінокислот. Способи виявлення та кількісного визначення білків у біологічних об'єктах та продуктах харчування, а також виділення їх з тканин та біологічних рідин засновані на фізичних та хімічних властивостях цих сполук.

Білки при взаємодії з деякими хімічними речовинами дають пофарбовані з'єднання. Утворення цих сполук відбувається за участю амінокислот радикалів, їх специфічних груп або пептидних зв'язків. Кольорові реакції дозволяють встановити наявність білка у біологічному об'єктіабо розчині та довести присутність певних амінокислот у білковій молекулі. На основі кольорових реакцій розроблено деякі методи кількісного визначення білків та амінокислот.

Універсальними вважають біуретову та нінгідринову реакції, тому що їх дають усі білки. Ксантопротеїнова реакція, реакція Фолята ін. є специфічними, оскільки вони зумовлені радикальними групами певних амінокислот у молекулі білка.

Кольорові реакції дозволяють встановити наявність білка в досліджуваному матеріалі та наявність певних амінокислот у його молекулах.

Біуретова реакція. Реакція обумовлена ​​наявністю в білках, пептидах, поліпептидах. пептидних зв'язків, які у лужному середовищі утворюють з іонами міді (II)комплексні сполуки, пофарбовані в фіолетовий (з червоним або синім відтінком) колір. Забарвлення обумовлене наявністю в молекулі не менше двох груп -CO-NH-, Пов'язаних безпосередньо між собою або за участю атома вуглецю або азоту.

Іони міді (II) з'єднуються двома іонними зв'язками із групами =С─О ˉ і чотирма координаційними зв'язками з атомами азоту (=N―).

Ітенсивність фарбування залежить від кількості білка у розчині. Це дозволяє використовувати цю реакцію для кількісного визначення білка. Колір забарвлених розчинів залежить від довжини поліпептидного ланцюга.Білки дають синьо-фіолетове забарвлення; продукти їх гідролізу (полі- та олігопептиди) – червоне або рожеве забарвлення. Біуретову реакцію дають не тільки білки, пептиди та поліпептиди, але й біурет (NH 2 -CO-NH-CO-NH 2) , оксамід (NH 2 -CO-CO-NH 2), гістидин.

Комплексне з'єднання міді (II) з пептидними групами, що утворюється в лужному середовищі, має таку будову:

Нінгідринова реакція. У цій реакції розчини білка, поліпептидів, пептидів та вільних α-амінокислот при нагріванні з нінгідрином дають синє, синьо-фіолетове або рожево-фіолетове фарбування. Забарвлення у цій реакції розвивається за рахунок α-аміногрупи.

Дуже легко реагують з нінгідрин -амінокислоти. Поряд з ними синьо-фіолетовий Руемана утворюють також білки, пептиди, первинні аміни, аміак та деякі інші сполуки. Вторинні аміни, наприклад пролін та оксипролін, дають жовте забарвлення.

Нінгідринову реакцію широко використовують для виявлення та кількісного визначення амінокислот.

Ксантопротеїнова реакція.Ця реакція вказує на наявність у білках залишків ароматичних амінокислот – тирозину, фенілаланіну, триптофану. Заснована на нітруванні бензольного кільця радикалів цих амінокислот з утворенням нітросполук, забарвлених у жовтий колір (грецьке «Ксантос» – жовтий). На прикладі тирозину цю реакцію можна описати у вигляді наступних рівнянь.

У лужному середовищі нітропохідні амінокислот утворюють солі хіноїдної структури, пофарбовані в оранжевий колір. Ксантопротеїнову реакцію дають бензол та його гомологи, фенол та інші ароматичні сполуки.

Реакції на амінокислоти, що містять тіолову групу у відновленому або окисленому стані (цистеїн, цистин).

Реакція фолю. При кип'ятінні з лугом від цистеїну легко відщеплюється сірка у вигляді сірководню, який у лужному середовищі утворює сульфід натрію:

У зв'язку з цим реакції визначення тіолсодержащих амінокислот в розчині поділяють на два етапи:

Перехід сірки з органічного стану до неорганічного

Виявлення сірки у розчині

Для виявлення сульфіду натрію використовують ацетат свинцю, який при взаємодії з гідроксидом натрію перетворюється на його плюмбіт:

Pb(CH 3 COO) 2 + 2NaOH Pb(ONa) 2 + 2CH 3 COOH

В результаті взаємодії іонів сірки та свинцю утворюється сульфід свинцю чорного або бурого кольору:

Na 2 S + Pb(ONa) 2 + 2 H 2 O PbS (чорний осад) + 4NaOH

Для визначення сірковмісних амінокислот до досліджуваного розчину додають рівний об'єм гідроксиду натрію і кілька крапель ацетату розчину свинцю. При інтенсивному кип'ятінні протягом 3-5 хвилин рідина забарвлюється в чорний колір.

Наявність цистину може бути визначено за допомогою цієї реакції, оскільки цистин легко відновлюється цистеїн.

Реакція Міллона:

Це реакція на амінокислоту тирозин.

Вільні фенольні гідроксили молекул тирозину при взаємодії з солями дають сполуки ртутної солі нітропохідного тирозину, пофарбованої в рожево-червоний колір:

Реакція Паулі на гістидин та тирозин. . Реакція Паулі дозволяє виявити у білку амінокислоти гістидин та тирозин, які утворюють з діазобензолсульфоновою кислотою комплексні сполуки вишнево-червоного кольору. Діазобензолсульфонова кислота утворюється в реакції діазотування при взаємодії сульфанілової кислоти з нітритом натрію в кислому середовищі:

До досліджуваного розчину додають рівний обсяг кислого розчину сульфанілової кислоти (приготованого з використанням соляної кислоти) і подвійний об'єм розчину нітриту натрію, ретельно перемішують і одразу додають соду (карбонат натрію). Після перемішування суміш забарвлюється у вишнево-червоний колір за наявності гістидину або тирозину в досліджуваному розчині.

Реакція Адамкевича-Гопкінса-Коля (Шульца – Распайля) на триптофан (реакція на індолову групу). Триптофан реагує у кислому середовищі з альдегідами, утворюючи забарвлені продукти конденсації. Реакція протікає за рахунок взаємодії індольного кільця триптофану з альдегідом. Відомо, що з гліоксилової кислоти у присутності сірчаної кислоти утворюється формальдегід:

Р
аствори, що містять триптофан, у присутності гліоксилової та сірчаної кислот дають червоно-фіолетове фарбування.

Гліоксилова кислота завжди присутня в невеликій кількості в крижаній оцтовій кислоті. Тому реакцію можна проводити, використовуючи оцтову кислоту. При цьому до досліджуваного розчину додають рівний обсяг крижаної (концентрованої) оцтової кислоти та обережно нагрівають до розчинення осаду. Через 5-10 хвилин на межі розділу двох шарів спостерігають утворення червоно-фіолетового кільця. Якщо перемішати шари, вміст посуду рівномірно забарвиться у фіолетовий колір.

До

онденсація триптофану з формальдегідом:

Продукт конденсації окислюється до біс-2-триптофанілкарбінолу, який у присутності мінеральних кислот утворює солі, пофарбовані в синьо-фіолетовий колір:

7) Класифікація білків. Методи дослідження амінокислотного складу.

Суворої номенклатури та класифікації білків досі не існує. Назви білків дають за випадковими ознаками, найчастіше беручи до уваги джерело виділення білка або враховуючи розчинність його в тих чи інших розчинниках, форму молекули та ін.

Класифікація білків проводиться за складом, формою частинок, розчинністю, амінокислотним складом, походженням і т.д.

1. За складомбілки ділять на великі групи: прості і складні білки.

До простих (протеїнів) відносять білки, що дають при гідролізі тільки амінокислоти (протеїноїди, протаміни, гістони, проламіни, глутеліни, глобуліни, альбуміни). Як приклади простих білків можуть служити фіброїн шовку, яєчний сироватковий альбумін, пепсин та ін.

До складних (до протеїдів) відносять білки, складені з простого білка та додаткової (простетичної) групи небілкової природи. Групу складних білків ділять на кілька підгруп залежно від характеру небілкового компонента:

Металопротеїди, що містять у своєму складі метали (Fe, Си, Mg та ін), пов'язані безпосередньо з поліпептидним ланцюгом;

Фосфопротеїди - містять залишки фосфорної кислоти, які складноефірними зв'язками приєднані до молекули білка за місцем гідроксильних груп серину, треоніну;

Глікопротеїди – їх простетичними групами є вуглеводи;

Хромопротеїди складаються з простого білка і пов'язаного з ним забарвленого небілкового з'єднання, всі хромопротеїди біологічно дуже активні; як простетичні групи в них можуть бути похідні порфірину, ізоалоксазину і каротину;

Ліпопротеїди – простетична група ліпіди – тригліцериди (жири) та фосфатиди;

Нуклеопротеїди - білки, що складаються з простого білка та з'єднаної з ним нуклеїнової кислоти. Ці білки відіграють колосальну роль у життєдіяльності організму та будуть розглянуті нижче. Вони входять до складу будь-якої клітини, деякі нуклеопротеїди існують у природі у вигляді особливих частинок, що мають патогенну активність (віруси).

2. За формою частинок- білки ділять на фібрилярні (ниткоподібні) та глобулярні (сферичні) (див. стор 30).

3. За розчинністю та особливостями амінокислотного складувиділяють такі групи простих білків:

Протеїноїди - білки опорних тканин (кісток, хрящів, зв'язок, сухожилля, волосся, нігтів, шкіри тощо). Це в основному фібрилярні білки з великою молекулярною масою (> 150000 Так), нерозчинні у звичайних розчинниках: воді, сольових та водно-спиртових сумішах. Вони розчиняються лише у специфічних розчинниках;

Протаміни (найпростіші білки) - білки, розчинні у воді і містять 80-90% аргініну та обмежений набір (6-8) інших амінокислот, представлені в молока різних риб. Внаслідок високого вмісту аргініну мають основні властивості, їхня молекулярна маса порівняно мала і приблизно дорівнює 4000-12000 Так. Вони є білковим компонентом у складі нуклеопротеїдів;

Гістони - добре розчинні у воді та розведених розчинах кислот (0,1Н), відрізняються високим вмістом амінокислот: аргініну, лізину та гістидину (не менше 30%) і тому мають основні властивості. Ці білки у значних кількостях містяться в ядрах клітин у складі нуклеопротеїдів та відіграють важливу роль у регуляції обміну нуклеїнових кислот. Молекулярна маса гістонів невелика і дорівнює 11000-24000 Так;

Глобуліни - білки, нерозчинні у воді та сольових розчинах з концентрацією солі більше 7%. Глобуліни повністю осаджуються при 50% насичення розчину сульфатом амонію. Ці білки відрізняються високим вмістом гліцину (3,5%), їхня молекулярна маса > 100000 Так. Глобуліни - слабокислі або нейтральні білки (р1 = 6-7,3);

Альбуміни - білки, добре розчинні у воді та міцних сольових розчинах, причому концентрація солі (NH 4 ) 2 S0 4 не повинна перевищувати 50% від насичення. При більш високій концентрації альбуміни висолюються. У порівнянні з глобулінами ці білки містять гліцину втричі менше і мають молекулярну масу, що дорівнює 40000-70000 Так. Альбуміни мають надлишковий негативний заряд та кислі властивості (pl=4,7) через великий вміст глутамінової кислоти;

Проламіни - група рослинних білків, що міститься в клейковині злакових рослин. Вони розчиняються лише в 60-80%-ному водному розчині етилового спирту. Проламіни мають характерний амінокислотний склад: у них багато (20-50%) глутамінової кислоти та проліну (10-15%), у зв'язку з чим вони і отримали свою назву. Їхня молекулярна маса більше 100000 Так;

Глютеліни - рослинні білки нерозчинні у воді, розчинах солей та етанолі, але розчинні у розведених (0,1Н) розчинах лугів та кислот. За амінокислотним складом і молекулярною масою подібні до проламінів, але аргініну містять більше, а проліну менше.

Способи дослідження амінокислотного складу

Під впливом ферментів травних соків білки розщеплюються на амінокислоти. Було зроблено два важливі висновки: 1) до складу білків входять амінокислоти; 2) методами гідролізу може бути вивчений хімічний, зокрема амнокислотний склад білків.

Для вивчення амінокислотного складу білків користуються поєднанням кислотного (НСl), лужного [В(ОН) 2 ] і, рідше, ферментативного гідролізу або одним з них. Встановлено, що при гідролізі чистого білка, що не містить домішок, звільняються 20 різних α-амінокислот. Всі інші відкриті у тканинах тварин, рослин та мікроорганізмів амінокислоти (більше 300) існують у природі у вільному стані або у вигляді коротких пептидів або комплексів з іншими органічними речовинами.

Перший етап у визначенні первинної структури білків полягає у якісній та кількісній оцінці амінокислотного складу даного індивідуального білка. Необхідно пам'ятати, що для дослідження потрібно мати певну кількість чистого білка без домішок інших білків або пептидів.

Кислотний гідроліз білка

Для визначення амінокислотного складу необхідно провести руйнування всіх пептидних зв'язків у білку. Аналізований білок гідролізують у 6 мол/л НС1 при температурі близько 110 °С протягом 24 год. Крім того, глутамін та аспарагін гідролізуються до глутамінової та аспарагінової кислот (тобто. розривається амідний зв'язок у радикалі і від них відщеплюється аміногрупа).

Поділ амінокислот за допомогою іонообмінної хроматографії

Суміш амінокислот, отриманих кислотним гідролізом білків, поділяють у колонці з катіонообмінною смолою. Така синтетична смола містить міцно пов'язані з нею негативно заряджені групи (наприклад, залишки сульфонової кислоти -SO 3 -), до яких приєднані іони Na ​​+ (рис. 1-4).

У катіонообмінник вносять суміш амінокислот у кислому середовищі (рН 3,0), де амінокислоти переважно представляють катіони, тобто. несуть позитивний заряд. Позитивно заряджені амінокислоти приєднуються до негативно заряджених частинок смоли. Чим більший сумарний заряд амінокислоти, тим міцніше її зв'язок зі смолою. Так, амінокислоти лізин, аргінін та гістидин найбільш міцно зв'язуються з катіонообмінником, а аспарагінова та глутамінова кислоти – найбільш слабо.

Вивільнення амінокислот з колонки здійснюють вимиванням (елююванням) їх буферним розчином з іонною силою, що збільшується (тобто зі збільшенням концентрації NaCl) і рН. При збільшенні рН амінокислоти втрачають протон, в результаті зменшується їх позитивний заряд, а отже міцність зв'язку з негативно зарядженими частинками смоли.

Кожна амінокислота виходить із колонки при певному значенні рН та іонної сили. Збираючи з нижнього кінця колонки розчин (елюат) у вигляді невеликих порцій, можна отримати фракції, що містять окремі амінокислоти.

(Докладніше «гідроліз» див питання №10)

8) Хімічні зв'язки у структурі білка.

9) Поняття про ієрархію та структурну організацію білків. (Див. питання №12)

10) Гідроліз білка. Хімізм реакції (ступінчастість, каталізатори, реагенти, умови протікання реакції) – повний опис гідролізу.

11) Хімічні перетворення білків.

Денатурація та ренатурація

При нагріванні розчинів білків до 60-80% або при дії реагентів, що руйнують нековалентні зв'язки в білках, відбувається руйнування третинної (четвертинної) та вторинної структури білкової молекули, вона набуває більшою чи меншою мірою форми безладного випадкового клубка. Цей процес називають денатурацією. В якості денатуруючих реагентів можуть бути кислоти, луги, спирти, феноли, сечовина, гуанідинхлорид та ін. внутрішньомолекулярні водневі зв'язки у білку внаслідок чого вторинна та третинна структури змінюються. При денатурації падає розчинність білка, він "згортається" (наприклад, при варінні курячого яйця), втрачається біологічна активність білка. На цьому засновано, наприклад, застосування водного розчину карболової кислоти (фенолу) як антисептик. У певних умовах при повільному охолодженні денатурованого розчину білка відбувається ренатурація - відновлення вихідної (нативної) конформації. Це підтверджує те що, що характер укладання пептидної ланцюга визначається первинної структурою.

Процес денатурації окремої білкової молекули, що призводить до розпаду її "жорсткої" тривимірної структури, іноді називають плавленням молекули. Практично будь-яка помітна зміна зовнішніх умов, наприклад, нагрівання або суттєва зміна pH призводить до послідовного порушення четвертинної, третинної та вторинної структур білка. Зазвичай денатурація викликається підвищенням температури, дією сильних кислот та лугів, солей важких металів, деяких розчинників (спирт), радіації та ін.

Денатурація часто призводить до того, що в колоїдному розчині білкових молекул відбувається процес агрегації частинок білка більші. Візуально це виглядає, наприклад, як утворення «білка» під час смаження яєць.

Ренатурація - процес, зворотний денатурації, у якому білки повертають свою природну структуру. Слід зазначити, що не всі білки здатні ренатурувати; у більшості білків денатурація необоротна. Якщо при денатурації білка фізико-хімічні зміни пов'язані з переходом поліпептидного ланцюга з щільно упакованого (упорядкованого) стану в безладне, то при ренатурації проявляється здатність білків до самоорганізації, шлях якої зумовлений послідовністю амінокислот в поліпептидному ланцюгу, тобто її первинною структурою, де . У живих клітинах дана інформація, ймовірно, є вирішальною для перетворення невпорядкованого поліпептидного ланцюга під час або після біосинтезу на рибосомі в структуру нативної молекули білка. При нагріванні дволанцюгових молекул ДНК до температури близько 100°C водневі зв'язки між основами розриваються і комплементарні ланцюги розходяться - ДНК денатурує. Однак при повільному охолодженні комплементарні ланцюги можуть з'єднуватися знову в регулярну подвійну спіраль. Ця здатність ДНК до ренатурації використовується отримання штучних гібридних молекул ДНК.

Природні білкові тіла наділені певною, строго заданою просторовою конфігурацією і мають низку характерних фізико-хімічних та біологічних властивостей при фізіологічних значеннях температури та рН середовища. Під впливом різних фізичних та хімічних факторів білки піддаються зсіданню і випадають в осад, втрачаючи нативні властивості. Таким чином, під денатурацією слід розуміти порушення загального плану унікальної структури нативної молекули білка, переважно її третинної структури, що призводить до втрати властивостей (розчинність, електрофоретична рухливість, біологічна активність і т.д.). Більшість білків денатурують при нагріванні їх розчинів вище 50-60°С.

Зовнішні прояви денатурації зводяться до втрати розчинності, особливо в изоэлектрической точці, підвищення в'язкості білкових розчинів, збільшення кількості вільних функціональних SH-груп і зміни характеру розсіювання рентгенівських променів. Найбільш характерною ознакою денатурації є різке зниження або повна втрата білком його біологічної активності (каталітична, антигенна або гормональна). При денатурації білка, викликаної сечовиною 8М або іншим агентом, руйнуються в основному нековалентні зв'язки (зокрема, гідрофобні взаємодії та водневі зв'язки). Дисульфідні зв'язки в присутності відновлюючого агента меркаптоетанолу розриваються, в той час як пептидні зв'язки самого кістяка поліпептидного ланцюга не торкаються. У умовах розгортаються глобули нативних білкових молекул і утворюються випадкові і безладні структури (рис.)

Денатурація білкової молекули (схема).

а - вихідний стан; б - оборотне порушення молекулярної структури, що починається; в - незворотне розгортання поліпептидного ланцюга.

Денатурація та ренатурація рибонуклеази (за Анфінсеном).

а - розгортання (сечовина + меркаптоетанол); б – повторне згортання.

1. Гідроліз білків: H+

[− NH2─CH─ CO─NH─CH─CO − ]n +2nH2O → n NH2 − CH − COOH + n NH2 ─ CH ─ COOH

│ │ ‌‌│ │

Амінокислота 1 амінокислота 2

2. Осадження білків:

а) оборотне

Білок у розчині ↔ осад білка. Відбувається під впливом розчинів солей Na+, K+

б) незворотне (денатурація)

При денатурації під впливом зовнішніх чинників (температура; механічне вплив – тиск, розтирання, струшування, ультразвук; дії хімічних агентів – кислот, лугів та інших.) відбувається зміна вторинної, третинної і четвертинної структур білкової макромолекули, тобто її нативної просторової структури. Первинна структура, отже, і хімічний склад білка не змінюються.

При денатурації змінюються фізичні властивості білків: знижується розчинність, втрачається біологічна активність. У той же час збільшується активність деяких хімічних груп, полегшується вплив на протеїлітичні білки ферментів, а, отже, він легше гідролізується.

Наприклад, альбумін - яєчний білок - при температурі 60-70 ° осаджується з розчину (згортається), втрачаючи здатність розчинятися у воді.

Схема процесу денатурації білка (руйнування третинної та вторинної структур білкових молекул)

3. Горіння білків

Білки горять із заснуванням азоту, вуглекислого газу, води, і навіть деяких інших речовин. Горіння супроводжується характерним запахом паленого пір'я

4. Кольорові (якісні) реакції на білки:

а) ксантопротеїнова реакція (на залишки амінокислот, що містять бензольні кільця):

Білок + HNO3 (конц.) → жовте фарбування

б) біуретова реакція (на пептидні зв'язки):

Білок + CuSO4 (насич) + NaOH (конц) → яскраво-фіолетове фарбування

в) цистеїнова реакція (на залишки амінокислот, що містять сірку):

Білок + NaOH + Pb(CH3COO)2 → Чорне фарбування

Білки є основою всього живого Землі і виконують в організмах різноманітні функції.

Висолення білків

Висолення називається процес виділення білків з водних розчинів нейтральними розчинами концентрованих солей лужних і лужноземельних металів. При додаванні великих концентрацій солей до розчину білка відбувається дегідратація білкових частинок та зняття заряду, при цьому випадають білки в осад. Ступінь випадання білків осад залежить від іонної сили розчину осадителя, розміру частинок білкової молекули, величини її заряду, гідрофільності. Різні білки осідають при різних концентраціях солей. Тому в опадах, отриманих шляхом поступового підвищення концентрації солей, окремі білки знаходяться у різних фракціях. Висолення білків є оборотним процесом, і після видалення солі білок знову набуває природних властивостей. Тому висолення користуються в клінічній практиці при поділі білків сироватки крові, а також при ізольуванні, очищенні різних білків.

Аніони і катіони, що додаються, руйнують гідратну білкову оболонку білків, що є одним з факторів стійкості білкових розчинів. Найчастіше застосовуються розчини сульфатів Na та амонію. Багато білків відрізняються за розміром гідратної оболонки та величиною заряду. Для кожного білка є своя зона висолення. Після видалення агента висолює білок зберігає свою біологічну активність і фізико-хімічні властивості. У клінічній практиці застосовується метод висолювання для поділу глобулінів (при додаванні 50% розчину сульфату амонію (NH4)2SO4 випадає осад) та альбумінів (при додаванні 100% розчину сульфату амонію (NH4)2SO4 випадає осад).

На величину висолювання впливають:

1) природа та концентрація солі;

2) рН-середовища;

3) температура.

Головну роль у своїй грають валентності іонів.

12) Особливості організації первинної, вторинної, третинної структури білка.

В даний час експериментально доведено існування чотирьох рівнів структурної організації білкової молекули: первинної, вторинної, третинної та четвертинної структури.

Амінокислотний склад та просторова організація кожного білка визначають його фізико-хімічні властивості. Білки мають кислотно-основні, буферні, колоїдні та осмотичні властивості.

Білки як амфотерні макромолекули

Білки є амфотерними поліелектролітами, тобто. поєднують у собі, подібно до амінокислот, кислотні та основні властивості. Однак природа груп, що надають амфотерних властивостей білкам, далеко не та ж, що в амінокислот. Кислотно-основні властивості амінокислот зумовлені насамперед наявністю α-аміно- та α-карбоксильної груп (кислотно-основна пара). У молекулах білків ці групи беруть участь у освіті пептидних зв'язків, а амфотерність білкам надають кислотно-основні групи бічних радикалів амінокислот, що входять до білок. Зрозуміло, у кожній молекулі нативного білка (поліпептидного ланцюга) є як мінімум по одній кінцевій α-аміно- та α-карбоксильній групі (якщо у білка тільки третинна структура). У білка з четвертинною структурою число кінцевих груп -NН 2 і -СООН дорівнює числу субодиниць, або протомерів. Однак така незначна кількість цих груп не може пояснити амфотерність макромолекул білка. Оскільки більшість полярних груп знаходиться на поверхні глобулярних білків, то саме вони визначають кислотно-основні властивості та заряд білкової молекули. Кислотні властивості білку надають кислі амінокислоти (аспарагінова, глутамінова та амінолимонна), а лужні властивості – основні амінокислоти (лізин, аргінін, гістидин). Чим більше кислих амінокислот міститься в білку, тим яскравіше виражені його кислотні властивості і чим більше входить до складу білка основних амінокислот, тим сильніше виявляються його основні властивості. Слабка дисоціація SН-групи цистеїну та фенольної групи тирозину (їх можна розглядати як слабкі кислоти) майже не впливає на амфотерність білків.

Буферні властивості. Білки хоч і мають властивості буфера, але ємність їх при фізіологічних значеннях рН обмежена. Виняток становлять білки, що містять багато гістидину, оскільки тільки бічна група гістидину має буферні властивості в інтервалі значень рН, близьких до фізіологічних. Таких білків дуже мало. Гемоглобін майже єдиний білок, що містить до 8% гістидину, є потужним внутрішньоклітинним буфером в еритроцитах, підтримуючи рН крові на постійному рівні.

Заряд білкової молекули залежить від вмісту в ній кислих та основних амінокислот, а точніше, від іонізації кислих та основних груп бокового радикалу цих амінокислот. Дисоціація СООН-груп кислих амінокислот викликає появу негативного заряду на поверхні білка, а бічні радикали лужних амінокислот несуть позитивний заряд (за рахунок приєднання Н+ до основних груп). У нативній молекулі білка заряди розподіляються асиметрично залежно від укладання поліпептидного ланцюга у просторі. Якщо в білку кислі амінокислоти переважають над основними, то в цілому молекула білка електронегативна, тобто є поліаніоном, і навпаки, якщо переважають основні амінокислоти, то вона заряджена позитивно, тобто поводиться як полікатіон.

Сумарний заряд білкової молекули, природно, залежить від рН середовища: у кислому середовищі він позитивний, у лужній негативний. То значення рН, у якому білок має сумарний нульовий заряд, називається изоэлектрической точкою даного білка. У цій точці білок не має рухливості в електричному полі. Ізоелектрична точка кожного білка визначається співвідношенням кислих і основних груп бічних радикалів амінокислот: чим вище співвідношення кислі/основні амінокислоти в білку, тим нижча його ізоелектрична точка. У кислих білків рН 1< 7, у нейтральных рН 1 около 7, а у основных рН 1 >7. При значеннях рН середовища нижче його ізоелектричної точки білок нестиме позитивний заряд, а вище - негативний заряд. Усереднена ізоелектрична точка всіх білків цитоплазми лежить у межах 5,5. Отже, при фізіологічному значенні рН (близько 70 - 74) клітинні білки мають загальний негативний заряд. Надлишок негативних зарядів білків усередині клітини врівноважується, як говорилося, неорганічними катіонами.

Знання ізоелектричної точки дуже важливе для розуміння стабільності білків у розчинах, так як в ізоелектричному стані білки найменш стійкі. Незаряджені частинки білка можуть злипатися один з одним і випадати в осад.

Колоїдні та осмотичні властивості білків

Поведінка білків у розчинах має деякі особливості. Звичайні колоїдні розчини стійкі лише у присутності стабілізатора, який перешкоджає осадженню колоїдів, розташовуючись межі розділу "розчинена речовина - розчинник".

Водні розчини білків є стійкими та рівноважними, вони згодом не випадають в осад (не коагулюють) та не вимагають присутності стабілізаторів. Білкові розчини гомогенні та, по суті, їх можна віднести до справжніх розчинів. Однак висока молекулярна маса білків надає їх розчинам багато властивостей колоїдних систем:

• характерні оптичні властивості (опалесценція розчинів та здатність їх розсіювати промені видимого світла) [показати] .

  Оптичні властивості білків. Розчини білків, особливо концентровані, мають характерну опалесценцію. При бічному освітленні розчину білка промені світла в ньому стають видимими і утворюють конус, що світиться, або смугу - ефект Тіндаля (у сильно розведених розчинах білка не видно опалесценція і майже відсутній конус Тіндаля, що світиться). Пояснюється цей світлорозсіюючий ефект дифракцією променів світла частинками білка в розчині. Вважається, що у протоплазмі клітини білок знаходиться у вигляді колоїдного розчину – золю. Здатність білків та інших біологічних молекул (нуклеїнових кислот, полісахаридів тощо) розсіювати світло використовується при мікроскопічному вивченні клітинних структур: у темному полі мікроскопа колоїдні частинки видно як світлі вкраплення в цитоплазмі.

  Світлорозсіювальну здатність білків та інших високомолекулярних речовин використовують для їх кількісного визначення методом нефелометрії, порівнюючи інтенсивність світлорозсіювання завислими частинками досліджуваного та стандартного золю.

• мала швидкість дифузії [показати] .

  Мала швидкість дифузії. Дифузією називається мимовільне переміщення молекул розчинених речовин внаслідок градієнта концентрацій (від зон з високою концентрацією до зон з низькою концентрацією). Білки мають обмежену швидкість дифузії в порівнянні зі звичайними молекулами та іонами, які переміщуються в сотні та тисячі разів швидше, ніж білки. Швидкість дифузії білків більше залежить від форми молекул, ніж від молекулярної маси. Глобулярні білки у водних розчинах рухливіші за фібрилярні білки.

  Дифузія білків має значення для нормального функціонування клітини. Синтез білків у будь-якій ділянці клітини (там, де є рибосоми) міг би привести за відсутності дифузії до накопичення білків у місці їх утворення. Внутрішньоклітинний розподіл білків відбувається шляхом дифузії. Оскільки швидкість дифузії білків невисока, вона обмежує швидкість процесів, що залежать від функції білка, що дифузує, у відповідній ділянці клітини.

• нездатність проникати через напівпроникні мембрани [показати] .

  Осмотичні властивості білків. Білки через високу молекулярну масу не можуть дифундувати через напівпроникну мембрану, тоді як низькомолекулярні речовини легко проходять через такі мембрани. Цю властивість білків використовують у практиці для очищення їх розчинів від низькомолекулярних домішок. Такий процес називається діалізом.

  Нездатність білків дифундувати через напівпроникні мембрани викликає явище осмосу, тобто переміщення молекул води через напівпроникну мембрану розчин білка. Якщо розчин білка відокремити від води целофановою мембраною, то, прагнучи досягнення рівноваги, молекули води дифундують розчин білка. Однак переміщення води в простір, де знаходиться білок, підвищує в ньому гідростатичний тиск (тиск води), який перешкоджає подальшій дифузії молекул води до білка.

  Той тиск, чи сила, яку слід докласти, щоб зупинити осмотичний струм води, називається осмотичним тиском. Осмотичний тиск у дуже розведених розчинах білка пропорційно молярній концентрації білка та абсолютній температурі.

  Біологічні мембрани також непроникні для білка, тому осмотичний тиск, створюваний білком, залежить від концентрації його всередині та поза клітиною. Осмотичний тиск, обумовлений білком, називають також онкотичним тиском.

• висока в'язкість розчинів [показати] .

  Висока в'язкість розчинів білка. Висока в'язкість характерна не тільки для розчинів білка, але взагалі для високомолекулярних розчинів сполук. Зі збільшенням концентрації білка в'язкість розчину підвищується, оскільки підвищуються сили зчеплення між молекулами білка. В'язкість залежить від форми молекул. Розчини білків фібрилярних завжди більш в'язкі, ніж розчини глобулярних білків. На в'язкість розчинів сильно впливають температура та присутність електролітів. З підвищенням температури в'язкість розчинів білка знижується. Добавки деяких солей, наприклад кальцію, підвищують в'язкість, сприяючи зчепленню молекул за допомогою кальцієвих містків. Іноді в'язкість білкового розчину збільшується настільки, що він втрачає плинність і перетворюється на гелеподібний стан.

• здатність до утворення гелів [показати] .

  Здатність білків до утворення гелів. Взаємодія між макромолекулами білка у розчині може призвести до утворення структурних сіток, усередині яких знаходяться захоплені молекули води. Такі структуровані системи називаються гелями чи холодцями. Вважається, що білок протоплазми клітини може переходити до гелеподібного стану. Характерний приклад - тіло медузи є хіба що живим холодцем, вміст води у якому до 90%.

  Гелеутворення легше протікає у розчинах фібрилярних білків; їхня паличкоподібна форма сприяє кращому контакту кінців макромолекул. Це добре відомо із побутової практики. Харчові колодці готують із продуктів (кістки, хрящі, м'ясо), що містять у великій кількості білки фібрилярні.

  У процесі життєдіяльності організму гелеподібний стан білкових структур має важливе фізіологічне значення. Колагенові білки кісток, сухожиль, хрящів, шкіри і т. д. мають високу міцність, пружність і еластичність, тому що знаходяться в гелеподібному стані. Відкладення мінеральних солей при старінні знижує їхню пружність і еластичність. У гелеподібному або студнеподібному вигляді знаходиться в клітинах м'язових актоміозин, що виконує скорочувальну функцію.

  У живій клітці відбуваються процеси, що нагадують перехід золь – гель. Протоплазма клітини є золеподібною в'язкою рідиною, в якій виявляються острівці гелеподібних структур.

Гідратація білків та фактори, що впливають на їх розчинність

Білки – гідрофільні речовини. Якщо розчиняти сухий білок у воді, то спочатку він, як будь-яка високомолекулярна гідрофільна сполука, набухає, а потім молекули білка починають поступово переходити в розчин. При набуханні молекули води проникають у білок та зв'язуються з його полярними групами. Щільна упаковка поліпептидних ланцюгів розпушується. Набряклий білок можна вважати хіба що зворотним розчином, т. е. розчином молекул води у високомолекулярному речовині - білку. Подальше поглинання води призводить до відриву молекул білка від загальної маси та розчинення. Але набухання не завжди веде до розчинення; деякі білки, наприклад колаген, так і залишаються в набряклому вигляді, поглинувши велику кількість води.

Розчинення пов'язані з гідратацією білків, т. е. зв'язуванням молекул води з білками. Гідратна вода так міцно пов'язана з макромолекулою білка, що відокремити її вдається з великими труднощами. Це говорить не про просту адсорбцію, а про електростатичне зв'язування молекул води з полярними групами бічних радикалів кислих амінокислот, що несуть негативний заряд, і основних амінокислот, що несуть позитивний заряд.

Однак частина гідратної води зв'язується пептидними групами, які утворюють із молекулами води водневі зв'язки. Наприклад, поліпептиди з неполярними бічними групами теж набухають, тобто зв'язують воду. Так, велика кількість води зв'язує колаген, хоча цей білок містить переважно неполярні амінокислоти. Вода, зв'язуючись із пептидними групами, розсуває витягнуті поліпептидні ланцюги. Однак міжланцюгові зв'язки (містки) не дають молекулам білка відриватися один від одного і переходити в розчин. При нагріванні сировини, що містить колаген, міжланцюгові містки в колагенових волокнах розриваються і звільнені поліпептидні ланцюги переходять у розчин. Ця фракція частково гідролізованого розчинного колагену називається желатиною. Желатина за хімічним складом близька до колагену, легко набухає та розчиняється у воді, утворюючи в'язкі рідини. Характерною властивістю желатин є здатність до гелеутворення. Водні розчини желатини широко використовуються в лікувальній практиці як плазмозамінний і кровоспинний засіб, а здатність до гелеутворення - при виготовленні капсул у фармацевтичній практиці.

Чинники, що впливають розчинність білків. Розчинність різних білків коливається у межах. Вона визначається їх амінокислотним складом (полярні амінокислоти надають більшої розчинності, ніж неполярні), особливостями організації (глобулярні білки, як правило, краще розчинні, ніж фібрилярні) та властивостями розчинника. Наприклад, рослинні білки - проламіни - розчиняються в 60-80%-ному спирті, альбуміни - у воді та у слабких розчинах солей, а колаген та кератини нерозчинні у більшості розчинників.

Стабільність розчинів білків надають заряд білкової молекули та гідратна оболонка. Кожна макромолекула індивідуального білка має сумарний заряд одного знака, що перешкоджає їх склеюванню в розчині та випадання осаду. Все, що сприяє збереженню заряду та гідратної оболонки, полегшує розчинність білка та його стійкість у розчині. Між зарядом білка (чи числом полярних амінокислот у ньому) і гідратацією існує тісний зв'язок: що більше полярних амінокислот в білку, то більше зв'язується води (з розрахунку 1 р білка). Гідратна оболонка білка іноді досягає великих розмірів, і вода гідратна може становити до 1/5 його маси.

Щоправда, деякі білки гідратуються сильніше, а розчиняються гірше. Наприклад, колаген зв'язує води більше, ніж багато добре розчинних глобулярних білків, але не розчиняється. Його розчинності заважають структурні особливості – поперечні зв'язки між поліпептидними ланцюгами. Іноді різноіменно заряджені групи білка утворюють багато іонних (сольових) зв'язків усередині молекули білка або між молекулами білків, що заважає утворенню зв'язків між молекулами води та зарядженими групами білків. Спостерігається парадоксальне явище: у білку багато аніонних чи катіонних груп, а розчинність їх у воді низька. Міжмолекулярні сольові містки викликають склеювання молекул білка та його випадання осад.

Які чинники середовища впливають на розчинність білків та його стабільність у розчинах?

• Вплив нейтральних солей [показати] .

  Нейтральні солі у невеликих концентраціях підвищують розчинність навіть тих білків, які нерозчинні у чистій воді (наприклад, евглобуліни). Це тим, що іони солей, взаємодіючи з протилежно зарядженими групами молекул білків, руйнують сольові містки між молекулами білків. Підвищення концентрації солей (збільшення іонної сили розчину) виявляє зворотну дію (див. нижче - висолення).

• Вплив рН середовища [показати] .

  рН середовища впливає заряд білка, отже, з його розчинність. Найменш стійкий білок в ізоелектричному стані, тобто коли його сумарний заряд дорівнює нулю. Зняття заряду дозволяє молекулам білка легко зближуватися, склеюватись і випадати в осад. Значить, розчинність і стійкість білка будуть мінімальні при рН, що відповідає ізоелектричній точці білка.

• Вплив температури [показати] .

  Суворої залежності між температурою і характером розчинності білків немає. Одні білки (глобуліни, пепсин, фосфорилаза м'язів) у водних або сольових розчинах з підвищенням температури розчиняються краще; інші (альдолаза м'язів, гемоглобін тощо) гірше.

• Вплив різнозарядженого білка [показати] .

  Якщо розчин білка, що є поліаніоном (кислий білок), додати білок, що є полікатіоном (основний білок), то вони утворюють агрегати. При цьому стійкість унаслідок нейтралізації зарядів губиться і білки випадають в осад. Іноді цю особливість використовують виділення потрібного білка із суміші білків.

Висолення

Розчини нейтральних солей широко використовуються не тільки для підвищення розчинності білка, наприклад, при виділенні його з біологічного матеріалу, але і для вибіркового осадження різних білків, тобто їх фракціонування. Процес осадження білків нейтральними сольовими розчинами називається висальвання. Характерною особливістю білків, отриманих висолення, є збереження ними нативних біологічних властивостей після видалення солі.

Механізм висолювання полягає в тому, що аніони і катіони сольового розчину, що додаються, знімають гідратну оболонку білків, що є одним з факторів його стійкості. Можливо, одночасно відбувається нейтралізація зарядів білка іонами солі, що також сприяє осадженню білків.

Здатність до висолення найбільше виражена у аніонів солей. За силою дії, що висолює, аніони і катіони розташовуються в наступні ряди:

• SO 4 2-> С 6 Н 5 Про 7 3-> СН 3 СОО -> Сl -> NO 3 -> Вr -> I -> CNS -
• Li + >Na + > К + > Pb + > Сs +

Ці ряди називаються ліотропними.

Сильним висолюючим ефектом у цьому ряду мають сульфати. На практиці для висолювання білків найчастіше застосовують сульфат натрію та амонію. Крім солей білки беруть в облогу органічними водовіднімаючими засобами (етанол, ацетон, метанол та ін.). Фактично це те ж висалівання.

Висалювання широко використовують для поділу та очищення білків, оскільки багато білків розрізняються за розміром гідратної оболонки та величиною зарядів. Для кожного з них є своя зона висолювання, тобто концентрація солі, що дозволяє дегідратувати та осадити білок. Після видалення агента висолює білок зберігає всі свої природні властивості і функції.

Денатурація (денативація) та ренатурація (ренативація)

При дії різних речовин, що порушують вищі рівні організації білкової молекули (вторинну, третинну, четвертинну) із збереженням первинної структури, білок втрачає свої нативні фізико-хімічні та, головне, біологічні властивості. Це називається денатурацією (денативацією). Воно характерне лише для молекул, що мають складну просторову організацію. Синтетичні та природні пептиди не здатні до денатурації.

При денатурації розриваються зв'язки, що стабілізують четвертинну, третинну і навіть вторинну структуру. Поліпептидний ланцюг розгортається і знаходиться в розчині або в розгорнутому вигляді, або у вигляді безладного клубка. При цьому губиться гідратна оболонка і білок випадає в осад. Однак обложений денатурований білок відрізняється від того ж білка, обложеного шляхом висолювання, тому що в першому випадку він втрачає нативні властивості, а в другому зберігає. Це вказує на те, що механізм дії речовин, що викликають денатурацію та висолення, різний. При висоленні зберігається нативна структура білка, а при денатурації руйнується.

Денатуруючі фактори поділяються на

• фізичні [показати] .

  До фізичних факторів відносяться: температура, тиск, механічна дія, ультразвукове та іонізуюче випромінювання.

  Теплова денатурація білків є найбільш вивченим процесом. Вона вважалася однією з характерних ознак білків. Давно відомо, що при нагріванні білок згортається (коагулює) та випадає в осад. Більшість білків термолабільні, проте відомі білки дуже стійкі до нагрівання. Наприклад, трипсин, хімотрипсин, лізоцим, деякі білки біологічних мембран. Особливою стійкістю до температури відрізняються білки бактерій, що живуть у гарячих джерелах. Очевидно, термостабільні білки мають тепловий рух поліпептидних ланцюгів, викликаний нагріванням, недостатньо для розриву внутрішніх зв'язків молекул білка. В ізоелектричній точці білки легше піддаються тепловій денатурації. Цей прийом використовується у практичній роботі. Деякі білки, навпаки, денатурують за низької температури.

• хімічні [показати] .

  До хімічних факторів, що викликають денатурацію, належать: кислоти та луги, органічні розчинники (спирт, ацетон), детергенти (миючі засоби), деякі аміди (сечовина, солі гуанідину тощо), алкалоїди, важкі метали (солі ртуті, міді) , барію, цинку, кадмію і т. д.). Механізм денатуруючої дії хімічних речовин залежить від їхньої фізико-хімічних властивостей.

  Кислоти та луги широко використовуються як осадники білків. Багато білків денатуруються при крайніх значеннях рН - нижче 2 або вище 10-11. Але деякі білки стійкі до дії кислот та лугів. Наприклад, гістони і протаміни не денатуруються навіть при рН 2 або рН 10. Міцні розчини етанолу, ацетон теж денатурують вплив на білки, хоча для деяких білків ці органічні розчинники використовуються як висолюють агенти.

  Тяжкі метали, алкалоїди здавна застосовуються як осадники; вони утворюють міцні зв'язки з полярними групами білків і цим розривають систему водневих і іонних зв'язків.

  Особливо слід зупинитись на сечовині та солях гуанідину, які у великих коцентраціях (для сечовини 8 моль/л, для гуанідину гідрохлориду 2 моль/л) конкурують пептидними групами за утворення водневих зв'язків. В результаті відбувається дисоціація на субодиниці у білків з четвертинною структурою, а потім розгортання поліпептидних ланцюгів. Ця властивість сечовини настільки яскрава, що її широко використовують для доказу наявності четвертинної структури білка та значення його структурної організації у здійсненні фізіологічної функції.

Властивості денатурованих білків . Найбільш типовими для денатурованих білків є такі ознаки.

• Збільшення числа реактивних чи функціональних груп проти нативної молекулою білка (функціональними групами називаються групи бічних радикалів амінокислот: СООН, NН 2 , SН, ОН). Частина цих груп зазвичай перебуває усередині молекули білка і виявляється спеціальними реагентами. Розгортання поліпептидного ланцюга при денатурації дозволяє виявити ці додаткові або приховані групи.
• Зменшення розчинності та осадження білка (пов'язане із втратою гідратної оболонки, розгортанням молекули білка з "оголенням" гідрофобних радикалів та нейтралізацією зарядів полярних груп).
• Зміна конфігурації молекули білка.
• Втрата біологічної активності, спричинена порушенням нативної структурної організації молекули.
• Більш легке розщеплення протеолитическими ферментами проти нативним білком перехід компактної нативної структури в розгорнуту пухку форму полегшує доступ ферментів до пептидних зв'язків білка, що вони руйнують.

Остання якість денатурованого білка широко відома. Термічна або інша обробка продуктів, що містять білки (головним чином м'ясні), сприяє кращому їх перетравленню за допомогою протеолітичних ферментів шлунково-кишкового тракту. У шлунку людини і тварин виробляється природний агент, що денатурує, - соляна кислота, яка, денатуруючи білки, допомагає їх розщепленню ферментами. Однак наявність соляної кислоти та протеолітичних ферментів не дозволяє застосовувати білкові лікарські препарати через рот, бо вони денатуруються і відразу розщеплюються, втрачаючи біологічну активність.

Зауважимо також, що денатуруючі речовини, що облягають білки, застосовуються в біохімічній практиці з іншими цілями, ніж висолюючі. Висолювання як прийом застосовується виділення якогось білка чи групи білків, а денатурація звільнення від білка суміші будь-яких речовин. Видаляючи білок можна отримати безбілковий розчин або усунути дію цього білка.

Довго вважалося, що денатурація необоротна. Однак у деяких випадках видалення денатуруючого агента (такі досліди були зроблені під час використання сечовини) відновлює біологічну активність білка. Процес відновлення фізико-хімічних та біологічних властивостей денатурованого білка називається ренатурацією чи ренативацією. Якщо денатурований білок (після видалення речовин, що денатурують) знову самоорганізується у вихідну структуру, то відновлюється і його біологічна активність.

Сторінка 4

всього сторінок: 7

Форма білкової молекули. Дослідження нативної конформації білкових молекул показали, що ці частинки здебільшого мають більш менш асиметричну форму. Залежно від ступеня асиметрії, тобто співвідношення між довгою (b) і короткою (а) осями білкової молекули розрізняють глобулярні (кулясті) і фібрилярні (ниткоподібні) білки.

Глобулярними є білкові молекули, у яких згортання поліпептидних ланцюжків спричинило утворення сферичної структури. Серед них зустрічаються суворо кулясті, еліпсоподібні та паличкоподібні. Вони різняться за рівнем асиметрії. Наприклад, яєчний альбумін має b/а = 3, гліадин пшениці – 11, а зеїн кукурудзи – 20. Багато білків у живій природі є глобулярними.

Фібрилярні білки утворюють довгі високоасиметричні нитки. Багато хто з них виконує структурну або механічну функцію. Такі колаген (b/а - 200), кератини, фіброїн.

Білкам кожної із груп притаманні свої характерні властивості. Багато глобулярних білків розчиняються у воді і розведених сольових розчинах. Розчинним фібрилярним білкам властиві дуже в'язкі розчини. Глобулярні білки, як правило, мають хорошу біологічну цінність - засвоюються в процесі травлення, тоді як багато фібрилярних білків - немає.

Між глобулярними та фібрилярними білками відсутня чітка межа. Ряд білків займає проміжне положення та поєднує в собі ознаки як глобулярних, так і фібрилярних. До таких білків відносяться, наприклад, міозин м'язів (b/а = 75) та фібриноген крові (b/а = 18). Міозин має паличкоподібну форму, подібну до форми фібрилярних білків, проте, подібно до глобулярних білків, він розчинний у сольових розчинах. Розчини міозину та фібриногену в'язкі. Ці білки засвоюються у процесі травлення. У той самий час актин - глобулярний білок м'язів - не засвоюється.

Денатурація білка. Нативна конформація білкових молекул не є жорсткою, вона досить лабільна (лат. "Labilis" - ковзний) і при низці впливів може серйозно порушуватися. Порушення нативної конформації білка, що супроводжується зміною його нативних властивостей без розриву пептидних зв'язків, називається денатурацією (лат. Denaturare - позбавляти природних властивостей) білка.

Денатурація білків може бути викликана різними причинами, що призводять до порушення слабких взаємодій, а також до розриву дисульфідних зв'язків, що стабілізують їх нативну структуру.

Нагрівання більшості білків до температури вище 50°С, а також ультрафіолетове та інші види високоенергетичного опромінення посилюють коливання атомів поліпептидного ланцюга, що призводить до порушення різних зв'язків. Денатурацію білка здатне викликати навіть механічне струшування.

Денатурація білків також відбувається внаслідок хімічної дії. Сильні кислоти або луги впливають на іонізацію кислотних та основних груп, викликаючи порушення іонних та деяких водневих зв'язків у молекулах білків. Сечовина (H 2 N-CO-NH 2 ) і органічні розчинники - спирти, феноли та ін. радикалами амінокислот). Меркаптоетанол руйнує в білках дисульфідні зв'язки. Іони важких металів порушують слабкі взаємодії.

При денатурації відбувається зміна властивостей білка і насамперед зменшення його розчинності. Наприклад, при кип'ятінні білки коагулюють і випадають з розчинів осад у вигляді згустків (як при варінні курячого яйця). Осадження білків із розчинів відбувається також під впливом білкових осадників, як яких застосовують трихлороцтову кислоту, реактив Барнштейна (суміш гідроксиду натрію з сульфатом міді), розчин танніну та ін.

При денатурації зменшується водопоглинальна здатність білка, тобто його здатність до набухання; можуть з'являтися нові хімічні групи, наприклад: при впливі заходів каптоетанолу - SH-групи. Внаслідок денатурації білок втрачає свою біологічну активність.

Хоча первинна структура білка при денатурації не порушується, зміни є необоротними. Однак, наприклад, при поступовому видаленні сечовини методом діалізу з розчину денатурованого білка відбувається його ренатурація: нативна структура білка відновлюється, а разом з нею тією чи іншою мірою - і його нативні властивості. Така денатурація називається оборотною.

Необоротна денатурація білків відбувається у процесі старіння організмів. Тому, наприклад, насіння рослин, навіть за оптимальних умов зберігання, поступово втрачає свою схожість.

Денатурація білків має місце при випіканні хліба, сушінні макаронів, овочів, в ході приготування їжі і т. д. В результаті підвищується біологічна цінність цих білків, так як у процесі травлення легше засвоюються денатуровані (частково зруйновані) білки.

Ізоелектрична точка білка. У білках містяться різні основні та кислотні групи, які мають здатність до іонізації. У сильнокислому середовищі активно протонуються основні угруповання (аміногрупи та інших.), і молекули білка набувають сумарний позитивний заряд, а сильнощелочной середовищі - легко дисоціюють карбоксильні групи, і молекули білка набувають сумарний негативний заряд.

Джерелами позитивного заряду в білках виступають бічні радикали залишків лізину, аргініну та гістидину, а-аміногрупа залишку N-кінцевої амінокислоти. Джерела негативного заряду - бічні радикали залишків аспарагінової та глутамінової кислот, а-карбоксильна група залишку С-кінцевої амінокислоти.

При певному значенні рН середовища спостерігається рівність позитивних і негативних зарядів лежить на поверхні білкової молекули, т. е. її сумарний електричний заряд виявляється рівним нулю. Таке значення рН розчину, у якому молекула білка електронейтральна, називають изоэлектрической точкою білка (pi).

Ізоелектричні точки є характерними константами білків. Вони визначаються їх амінокислотним складом і структурою: кількістю та розташуванням залишків кислих та основних амінокислот у поліпептидних ланцюгах. Ізоелектричні точки білків, у яких переважають залишки кислих амінокислот, розташовуються в ділянці рН<7, а белков, в которых преобладают остатки основных аминокислот - в области рН>7. Ізоелектричні точки більшості білків перебувають у слабокислому середовищі.

У ізоелектричному стані розчини білків мають мінімальну в'язкість. Це з зміною форми білкової молекули. У изоэлектрической точці різноіменно заряджені групи притягуються друг до друга, і білки закручуються клубки. При зміщенні рН від ізоелектричної точки однойменно заряджені групи відштовхуються, молекули білка розгортаються. У розгорнутому стані білкові молекули надають розчинам вищу в'язкість, ніж згорнуті клубки.

В ізоелектричній точці білки мають мінімальну розчинність і можуть легко випадати в осад.

Однак осадження білків в ізоелектричній точці все ж таки не відбувається. Цьому перешкоджають структуровані молекули води, що утримують на поверхні білкових глобул значну частину амінокислотних гідрофобних радикалів.

Облогити білки можна за допомогою органічних розчинників (спирту, ацетону), що порушують систему гідрофобних контактів у молекулах білка, а також високих концентрацій солей (методом висолювання), що зменшують гідратацію білкових глобул. В останньому випадку частина води йде на розчинення солі та перестає брати участь у розчиненні білка. Такий розчин за нестачею розчинника стає пересиченим, що спричиняє випадання частини його в осад. Білкові молекули починають злипатися і, утворюючи дедалі більші частинки, поступово осідати з розчину.

Оптичні властивості білка. Розчини білків мають оптичну активність, тобто здатність обертати площину поляризації світла. Ця властивість білків обумовлена ​​наявністю в їх молекулах елементів асиметрії - асиметричних атомів вуглецю та правозакрученої аспіралі.

При денатурації білка відбувається зміна його оптичних властивостей, що з руйнацією а-спирали. Оптичні властивості повністю денатурованих білків залежать тільки від наявності в них асиметричних атомів вуглецю.

За різницею у прояві білком оптичних властивостей до та після денатурації можна визначити ступінь його спіралізації.

Якісні реакції на білки. Для білків характерні кольорові реакції, зумовлені наявністю у яких тих чи інших хімічних угруповань. Ці реакції часто використовуються виявлення білків.

При додаванні до білкового розчину сульфату міді та лугу з'являється бузкове фарбування, пов'язане з утворенням комплексів іонів міді з пептидними групами білка. Оскільки цю реакцію дає біурет (H 2 N-CO-NH-CO-NH 2), вона отримала назву біуретової. Її часто використовують для кількісного визначення білка, поряд з методом І. К'єльдаля, так як інтенсивність забарвлення, що виникає, пропорційна концентрації білка в розчині.

При нагріванні розчинів білків з концентрованою азотною кислотою з'являється жовте фарбування, зумовлене утворенням ароматичних нітропохідних амінокислот. Цю реакцію називають ксантопротеїновий(грец. "ксантос" - жовтий).

Багато білкових розчинів при нагріванні вступають у реакцію з азотнокислим розчином ртуті, яка утворює з фенолами та їх похідними комплексні сполуки малинового кольору. Це якісна реакція Міллона на тирозин.

В результаті нагрівання більшості білкових розчинів з оцтовокислим свинцем у лужному середовищі випадає чорний осад сульфіду свинцю. Дана реакція використовується для виявлення сірковмісних амінокислот і називається реакцією Фолю.