Međutim, izvedena je i plinska verzija TLC-a. Kao sitnozrnati koriste se sitnozrnati, Al 2 O 3 i dr. Oni se prekrivaju staklom, folijom ili pločama; za fiksiranje sloja se koristi, ili drugi. Prom-Stu proizvodi gotove ploče s već fiksiranim slojem. Eluenti su obično smjese org. otopine, vodene otopine, to-t, kompleksotvorne itd. in-in. Ovisno o izboru kromatografskog sustavi (sastav mobilne i stacionarne faze) u razdvajanje u-u glavni procesi mogu igrati ulogu. U praksi ih se često provodi istovremeno. mehanizmi odvajanja.

Ovisno o položaju ploče i smjeru protoka eluenta, razlikuju se uzlazna, silazna i horizontalna TLC. Prema tehnici rada razlikuje se frontalna analiza (kada analizirana smjesa služi kao mobilna faza) i uobičajeno korištena varijanta eluiranja. Također se koriste "cirkularni" (kada se analizirana otopina i otapalo uzastopno uvode u središte ploče) i "anti-cirkularni" TLC (kada se analizirana otopina nanosi po obodu, a eluent se kreće od periferije prema središtu). ploče), TLC pod (kada se p -otapalo pod prolazi kroz sloj prekriven čvrsto prešanim), kao i TLC u uvjetima gradijenta t-ry, sastava itd. U tzv. dvodimenzionalna TLC kromatografija. proces se odvija sekvencijalno u dva međusobno okomita smjera uz razgradnju. eluensa, što povećava učinkovitost odvajanja. U istu svrhu koristi se višestruko eluiranje u jednom smjeru.

U varijanti eluiranja, na sloj se nanesu kapi (1-5 μl) analizirane otopine i rub ploče se uroni u eluent koji se nalazi na dnu hermetički zatvorene staklene komore. Eluent se kreće duž sloja pod djelovanjem kapilarnih i gravitacijskih sila; analizirana smjesa se kreće u istom smjeru. Kao rezultat ponovljenog ponavljanja iu skladu s koef. raspodjele u odabranoj su odvojene i raspoređene na tanjuru u zasebne zone.

Nakon završenog procesa ploča se vadi iz komore, a osušene i odvojene zone nalaze se u vlastitoj. bojanjem ili nakon prskanja otopinama koje stvaraju obojene ili fluorescentne mrljesa komponentama smjese koje treba odvojiti. Radioaktivne tvari detektiraju se autoradiografski (izlaganjem ploči postavljenoj na ploču). Također primijenjeno. i aktivne metode detekcije. Dobivena slika raspodjele kromatografskih. zone tzv kromatogram (vidi sliku).

Kromatogram dobiven odvajanjem smjese od tri komponente metodom tankog sloja.

Položaj kromatografa Zone na kromatogramu karakterizirane su vrijednošću R f - omjerom puta l i koji središte zone i-te komponente prijeđe od startne linije do puta l koji prijeđe eluent: R f = l i /l; R f 1. Vrijednost R f ovisi o koeficijentu. distribucija () i na omjer volumena pokretne i stacionarne faze.

Na separaciju u TLC utječe niz čimbenika - sastav i svojstva eluenta, priroda, te, t-ra, dimenzije i debljina sloja, dimenzije komore. Stoga je za dobivanje ponovljivih rezultata potrebno pažljivo standardizirati eksperimentalne uvjete. Sukladnost s ovim zahtjevom omogućuje vam postavljanje R f s relativnim. standardna devijacija 0,03. Pod standardnim uvjetima, R f je konstantan za dati in-va i koristi se za potonji.

Broj komponenata u kromatografiji. zona se određuje izravno na sloju površinom zone (obično njegov promjer varira od 3 do 10 mm) ili intenzitetom njegove boje (). Također koristite automatski instrumenti za skeniranje koji mjere apsorpciju, prijenos ili refleksiju svjetlosti ili kromatografski. zonama. Odvojene zone mogu se ostrugati s ploče zajedno sa slojem, komponenta se može ekstrahirati u otapalo i analizirati odgovarajućom metodom (fluorescencija, atomska apsorpcija, atomska fluorescencija, radiometrijska analiza itd.). Pogreška kvantitativnog određivanja obično je 5-10%; granice detekcije in-in u zonama -10 -3 -10 -2 μg (za obojene derivate) i 10 -10 -10 -9 μg (upotrebom).

Prednosti TLC: jednostavnost, isplativost, dostupnost opreme, brzina (vrijeme odvajanja 10-100 min), visoka produktivnost i učinkovitost odvajanja, jasnoća rezultata odvajanja, lakoća kromatografske detekcije. zonama.

TLC se koristi za odvajanje i analizu org. i neorg. u-u: gotovo svi inorg.

Kromatografija u moderna kemija

Jedna od važnih zadaća suvremene kemije je pouzdana i točna analiza organska tvar, često slične strukture i svojstava. Bez toga je nemoguće provoditi kemijska, biokemijska i medicinska istraživanja, na čemu se uglavnom temelji ekološke metode analiza okoliš, forenzičko ispitivanje, kao i kemijska, naftna, plinska, prehrambena, medicinska industrija i mnogi drugi sektori nacionalnog gospodarstva.

Jedna od najosjetljivijih metoda je kromatografska analiza, koju je prvi predložio ruski znanstvenik M.S. Tsvet početkom 20. stoljeća. i do kraja stoljeća pretvorio se u moćan alat bez kojeg više ne mogu ni sintetičari ni kemičari koji rade na drugim područjima.

Odvajanje boja provedeno je u koloni prikazanoj na sl. 1. Mješavina tvari A, B i C - prirodni pigmenti, izvorno smješteni u zoni e,- odvaja se dodavanjem odgovarajućeg otapala D (eluens) u zasebne zone.

Kao i uvijek, sve je počelo, čini se, od najjednostavnije stvari koju bi svaki školarac mogao učiniti. Prijašnjih su godina školarci, pa tako i autor ovog članka, pisali tintom. A ako je upijač pao na mrlju od tinte, tada se moglo primijetiti da je otopina tinte na njoj podijeljena na nekoliko "frontova". Kromatografija se temelji na raspodjeli jedne od nekoliko tvari između dvije, kako se kaže, faze (npr. čvrsta i plina, između dvije tekućine itd.), a jedna od faza se stalno kreće, odnosno pokretna je.

To znači da takva faza, na primjer, plin ili tekućina, stalno napreduje, razbijajući ravnotežu. Štoviše, što je ova ili ona tvar bolje sorbirana (apsorbirana) ili otopljena u stacionarnoj fazi, to je sporija brzina njenog kretanja, i, obrnuto, što je spoj manje sorbiran, tj. ima manji afinitet za stacionarnu fazu, to je veći brzina kretanja. Kao rezultat toga, kao što je prikazano na Sl. 2, ako u početku imamo mješavinu spojeva, onda se postupno svi, gurani mobilnom fazom, kreću do "finiša" različitim brzinama i na kraju se odvajaju.

Riža. 2. Osnovni princip kromatografskog odvajanja: NF je sloj stacionarne faze koji prekriva unutarnju površinu kapilarne cijevi T, kroz koju teče mobilna faza (MP). Komponenta A 1 izdvojene smjese ima visok afinitet za mobilnu fazu, a komponenta A 2 - za stacionarnu fazu. A "1 i A" 2 su položaji zona istih komponenata nakon vremenskog razdoblja tijekom kojeg je došlo do kromatografskog odvajanja u smjeru označenom strelicom

U praksi se uzorak smjese tvari ubrizgava npr. štrcaljkom u sloj stacionarne faze, a zatim se različiti spojevi koji čine smjesu zajedno s mobilnom fazom (eluentom) kreću duž sloj, vođen ovom fazom. Brzina gibanja ovisi o količini međudjelovanja (afiniteta) komponenti u stacionarnoj i mobilnoj fazi, a kao rezultat toga dolazi do razdvajanja komponenti.

Nakon odvajanja, sve komponente moraju biti identificirane i kvantificirane. Ovo je opća shema kromatografije.

Treba napomenuti da ova moderna metoda omogućuje određivanje sadržaja desetaka i stotina različitih spojeva u smjesi unutar nekoliko minuta, čak iu zanemarivim količinama u “tragovima” od ~10–8 %.

Razmotrimo detaljnije kromatografsku metodu analize. Kromatografski sustavi mogu se podijeliti prema sljedećim načelima:

– agregatno stanje mobilne i stacionarne faze;
– geometrijske karakteristike sustava;
– mehanizam interakcije između izdvojene tvari i faza.

Kao mobilna faza koristi se plin ili tekućina. Krutine ili tekućine koriste se kao stacionarne, odnosno nepokretne, faze.

Prema rasporedu faza kromatografske sustave dijelimo u dvije skupine: planarne i kolonske.

Potonji se, pak, dijele na:

- pakirano, ispunjeno granuliranim krutim materijalom (male kuglice), bilo da je medij za razdvajanje ili služi kao nosač stacionarne tekuće faze;
- kapilara, čije su unutarnje stijenke prekrivene filmom nepokretne tekućine ili slojem čvrstog adsorbensa (apsorbera).

Interakcija između tvari koju treba odvojiti i faza kromatografskog sustava može se odvijati ili na površini faze ili u volumenu. U prvom slučaju naziva se kromatografija adsorpcija, u drugom distribucija.

Mehanizmi razdvajanja molekula u kromatografskim sustavima najčešće se svode na sljedeće:

– stacionarna faza fizički apsorbira (sorbira) tvari koje se odvajaju;
- stacionarna faza kemijski stupa u interakciju s odvojenim tvarima;
- stacionarna faza otapa tvari koje treba izdvojiti iz otopine u otapalu koje se ne miješa;
- stacionarna faza ima poroznu strukturu, što otežava difuziju molekula tvari koje se u ovoj fazi odvajaju.

Kromatografija, koja je započela s uređajima vlastite izrade kao što je traka papira umočena u otapalo, sada je predstavljena najsloženijim instrumentalnim sustavima koji se temelje na suvremenim najpreciznijim, odnosno preciznim, principima i opremljeni su računalnim softverom. Dovoljno je reći da jedna od najboljih računalnih tvrtki, Hewlett-Packard, istovremeno proizvodi moderne kromatografe.

Shema procesa kromatografije je u biti vrlo jednostavna i prikazana je na sl. 3. Nadalje, približno u ovom slijedu, razmotrit će se princip rada kromatografa.

Glavne vrste kromatografije

Glavne vrste kromatografije uključuju adsorpcijsku, ionsku izmjenu, tekućinsku, papirnu, tankoslojnu, gel filtraciju i afinitetnu kromatografiju.

Adsorpcijska kromatografija. U ovom slučaju, odvajanje tvari provodi se zbog selektivne (selektivne) adsorpcije tvari na stacionarnoj fazi. Takva selektivna adsorpcija posljedica je afiniteta jednog ili drugog spoja prema čvrstom adsorbensu (stacionarnoj fazi), a to je pak određeno polarnim interakcijama njihovih molekula. Stoga se kromatografija ove vrste često koristi u analizi spojeva čija su svojstva određena brojem i vrstom polarnih skupina. Adsorpcijska kromatografija uključuje ionsko-izmjenjivačku, tekućinsku, papirnatu, tankoslojnu i plinsko-adsorpcijsku kromatografiju. Plinska adsorpcijska kromatografija je detaljnije opisana u odjeljku Analiza eluenta.

Kromatografija ionske izmjene. koristi se kao stacionarna faza. ionsko izmjenjivačke smole(sl. 4) iu stupcima iu tankom sloju na ploči ili papiru. Odvajanje se obično provodi u vodenom mediju, pa se ova metoda koristi uglavnom u anorganskoj kemiji, iako se koriste i miješana otapala. Pokretačka sila odvajanja u ovom slučaju je različit afinitet izdvojenih iona otopine prema centrima ionske izmjene suprotnog polariteta u stacionarnoj fazi.

tekućinska kromatografija. U ovom slučaju, stacionarna faza je tekućina. Najčešći slučaj je adsorpcijska verzija tekućinske kromatografije na stupcu. Primjer odvajanja prirodnih pigmenata prikazan je na sl. 5.

Riža. 5. Kromatografsko odvajanje prirodnih pigmenata (flavoni i izoflavoni)

Papirna kromatografija. Kao stacionarna faza koriste se trake ili listovi papira (slika 6). Razdvajanje se odvija prema adsorpcijskom mehanizmu, a ponekad se odvija u dva okomita smjera.

Tankoslojna kromatografija je svaki sustav u kojem je stacionarna faza tanki sloj, posebno sloj glinice (debljine 2 mm) u obliku paste nanesene na staklenu ploču. Primjer takvog sustava i rezultati odvajanja prikazani su na sl. 7.

Gel filtracija, ili molekularno sito, kromatografija. Načelo razdvajanja u takvim sustavima je nešto drugačije nego u prethodnim slučajevima. Stacionarna faza su materijali, obično gelovi, sa strogo kontroliranom poroznošću, zbog čega neke komponente smjese, u skladu s veličinom i oblikom molekula, mogu prodrijeti između čestica gela, dok druge ne mogu. Najčešće se ova vrsta kromatografije koristi za odvajanje makromolekulskih spojeva. Jedna od primjena ove metode je određivanje molekulskih masa tvari koje se odvajaju, što je često potrebno za kemijska istraživanja (slika 8).

afinitetna kromatografija. Ova vrsta kromatografije temelji se na interakciji između tvari, s jedne strane, sposobne reagirati s izoliranim spojem, as druge strane, povezane s krutim nosačem stacionarne faze. Takva tvar ima afinitet prema izoliranom spoju i naziva se afinitetni ligand.

Najčešće se ova metoda koristi u biokemijskoj analizi. Na primjer, kada biološki antigenski objekti koji sadrže proteine ​​prolaze kroz celulozu aktiviranu cijanogenim bromidom, oni se specifično zadržavaju, kao što je prikazano u shemi 1.

Prema drugoj metodi, da bi se proteini vezali na hidroksilnu skupinu celuloze, potonja se prvo tretira s 2-amino-4,6-dikloro- Sim-triazin, a zatim produkt njihove interakcije reagira s amino skupinom proteina prema shemi 2:

Naravno, broj kromatografskih metoda nije ograničen na gore navedene. Kromatografija se često kombinira s drugim fizikalno-kemijskim metodama, poput masene spektrometrije, ali ovaj članak ima za cilj upoznati čitatelja samo s općim principima kromatografije. Stoga ćemo dalje razmotriti obradu rezultata kromatografije.

Metode razvijanja kromatograma

Razvoj je proces prijenosa odvojenih tvari mobilnom fazom. Razvijanje se može izvesti na tri glavna načina: frontalnom analizom, pomakom i elucijom. Elucija je najraširenija.

Frontalna analiza. Ovo je najjednostavniji slučaj, jer ovdje uzorak služi kao mobilna faza. Kontinuirano se dodaje u sustav, tako da su potrebne velike količine uzoraka. Rezultati su prikazani na sl. 9.

Formiranje nekoliko zona je zbog različitih afiniteta različitih komponenti za stacionarnu fazu. Rezna oštrica se naziva prednja strana, otuda i naziv. U prvoj zoni nalazi se samo najmanje zadržana tvar A, koja se najbrže kreće. Druga zona sadrži tvari A i B. Treća zona je smjesa tvari A, B i C. U frontalnoj analizi samo se komponenta A dobiva u tekućem obliku.

analiza pomaka. U tom slučaju mobilna faza ima veći afinitet prema stacionarnoj fazi od tvari koju treba odvojiti. Mali uzorak se uvodi u stacionarnu fazu. Ali zbog visokog afiniteta mobilna faza istiskuje i gura sve komponente. Istiskuje najjače sorbiranu komponentu C, koja zauzvrat istiskuje tvar B, koja istiskuje najmanje sorbiranu komponentu A. Za razliku od frontalne analize, ovom se metodom mogu dobiti sve glavne komponente u pojedinačnom (tekućem) obliku .

analiza eluenta. Mobilna faza za pomicanje otopljene tvari prolazi kroz kromatografski sustav. Do razdvajanja dolazi zbog različitog afiniteta komponenata smjese prema stacionarnoj fazi, a posljedično i zbog različite brzine njihovog kretanja. Uzorak malog volumena uvodi se u kromatografski sustav. Kao rezultat toga, postupno će se formirati zone s komponentama odvojene sekcije odvojen čistim eluensom. Zbog visoke učinkovitosti separacije, metoda je postala najraširenija i uvelike je zamijenila druge opcije separacije. Stoga ćemo dalje razmotriti teoriju i hardverski dizajn ove metode.

Malo teorije. Često je prikladno razmatrati kromatografske procese kao niz ekstrakcijskih procesa; u ovom slučaju, tvari s vrlo sličnim svojstvima mogu se odvojiti, budući da se stotine, pa čak i tisuće ciklusa ekstrakcije odvijaju brzo i istovremeno tijekom kromatografskih procesa.

Za procjenu učinkovitosti kromatografskih procesa, na temelju teorijskog koncepta destilacije (analogno s odvajanjem ulja u destilacijskim kolonama, gdje teorijska ploča odgovara dijelu destilacijske kolone u kojem su para i tekućina u ravnoteži), uvodi se koncept "visina ekvivalentna teoretskoj ploči"(VETT). Kromatografska kolona se stoga smatra skupom hipotetskih slojeva (ploča). HETP se obično podrazumijeva kao takva debljina sloja koja je potrebna da smjesa koja dolazi iz prethodnog sloja dođe u ravnotežu s prosječnom koncentracijom tvari u mobilnoj fazi ovog sloja. Može se opisati sljedećom formulom:

HETT = L/N,

gdje L- duljina stupca, N je broj teoretskih ploča.

HETP je sumarna karakteristika odvajanja tvari. Međutim, odvajanje komponenti smjese je važno, ali ne i dovoljno. Potrebno je identificirati svaku komponentu i odrediti njenu količinu u uzorku. Obično se to radi obradom kromatograma - ovisnosti intenziteta signala, proporcionalnog koncentraciji tvari, o vremenu odvajanja. Neki primjeri kromatograma prikazani su na sl. 10, 11.

Naziva se vrijeme od trenutka ubrizgavanja uzorka u kolonu do trenutka registriranja maksimalnog vrha vrijeme zadržavanja (tR). U optimalnim uvjetima ne ovisi o količini ubrizganog uzorka i, uzimajući u obzir geometrijske parametre kolone, određena je strukturom pojedinog spoja, tj. kvalitativna je karakteristika komponenata. Kvantitativni sadržaj komponente karakterizira veličina pika, točnije njegova površina. Računati područje vrha obično se radi automatski s integratorskim instrumentom koji bilježi i vrijeme zadržavanja i područje vrha. Moderna oprema omogućuje vam da odmah dobijete računalni ispis koji pokazuje sadržaj svih komponenti smjese koje treba odvojiti.

Rad kromatografa. Instalacijski dijagram najjednostavnijeg plinskog kromatografa prikazan je na sl. 12. Sastoji se od plinskog cilindra u kojem se nalazi pokretna inertna faza (plin nosač), najčešće helij, dušik, argon i dr. Pomoću reduktora koji snižava tlak plina na potrebnu razinu, plin nosilac ulazi u kolonu, koja se cijev ispunjena sorbentom ili drugim kromatografskim materijalom koji ima ulogu stacionarne faze.

Riža. 12. Shema rada plinskog kromatografa:
1 - balon visokotlačni s plinom nosačem; 2 – stabilizator protoka; 3 i 3" - manometri; 4 - kromatografska kolona; 5 - uređaj za ubrizgavanje uzorka; 6 - termostat; 7 - detektor; 8 - zapisivač; 9 - mjerač protoka

Kromatografska kolona je "srce" kromatografa, jer se u njoj smjese odvajaju. Stupovi su najčešće izrađeni od stakla; postoje čelične, teflonske, a također i kapilarne kolone. Uređaj za ubrizgavanje uzorka postavlja se blizu ulaza plina u kolonu. Najčešće se uzorak ubrizgava štrcaljkom, probijajući gumenu membranu. Analizirana smjesa se odvaja u koloni i ulazi u detektor - uređaj koji pretvara rezultate odvajanja u oblik pogodan za registraciju.

Jedan od najčešće korištenih detektora je katarometar, čiji se princip temelji na mjerenju toplinskog kapaciteta različitih tijela.

Na sl. 13 prikazuje dijagram katarometra. Metalna spirala (otporna nit) smještena je u cilindričnu šupljinu koja se zagrijava uslijed prolaska istosmjerne električne struje kroz nju. Kada plin nosilac teče kroz njega konstantnom brzinom, temperatura zavojnice ostaje konstantna. Međutim, ako se sastav plina mijenja s pojavom eluirane tvari, tada se mijenja temperatura zavojnice, što uređaj bilježi.

Drugi uobičajeni detektor je plamenoionizacijski detektor, čija je shema prikazana na sl. 14. Mnogo je osjetljiviji od katarometra, ali zahtijeva dovod ne samo plina nosača, već i vodika. Plin nositelj koji napušta stupac, koji sadrži eluent, miješa se s vodikom i prolazi u mlaznicu plamenika detektora. Plamen ionizira molekule eluenta, zbog čega se električni otpor između elektroda smanjuje, a struja raste.

U tekućinskoj kromatografiji koriste se spektrofotometrijski detektori (u vidljivom, UV i IR području), kao i refraktometrijski detektori temeljeni na mjerenju indeksa loma otopina.

Oni su unutra u općim crtama osnove kromatografske analize. Naravno, članak sadrži samo generalni principi kromatografijom, a često su jednostavno označeni. Zapravo, "kuhinja" ove metode je prilično velika i složena. glavni cilj ovaj članak, prema riječima autora, kako bi skrenuo pozornost mladih čitatelja na ovu moćnu metodu.

Oni koji žele saznati više o ovom području mogu koristiti literaturu ispod.

Književnost

Zhukhovitsky A.A., Turkeltaub N.M. Plinska kromatografija. M.: Gostoptehizdat, 1962, 240 str.;
Sakodinski K.I., Kiselev A.V., Iogansen A.V. i tako dalje. Fizikalno-kemijska primjena plinska kromatografija. M.: Kemija, 1973,
254 str.;
Kromatografija na tekućoj koloni. U 3 sveska, ur. Z. Deyla, K. Maceka, J. Janaka. Moskva: Mir, 1972;
Berezkin V.G., Alishoev V.R., Nemirovskaya I.B.. Plinska kromatografija u kemiji polimera. M.: Nauka, 1972, 287 str.;
Morozov A.A. Kromatografija u anorganskoj analizi. M.: Više. škola, 1972., 233 str.;
Berezkin V.G., Bočkov A.S.. Kvantitativna tankoslojna kromatografija. M.: Nauka, 1980., 183 str.;
Laboratorijski vodič za kromatografske i srodne metode. U 2 sveska, ur. O. Mikesh. Moskva: Mir, 1982, svezak 1–2, 783 str.;
Kromatografska analiza okoliša. ur. R. Lijes. M.: Mir, 1979, 606 str.;
Kirchner Yu. Tankoslojna kromatografija. U 2 sveska M.: Mir, 1981, svezak 1, 615 str., svezak 2, 523 str.;
Ekstrakcijska kromatografija. ur. T.Brown, G.Gersini. M.: Mir, 1978, 627 str.

V.V. Safonov,
profesor moskovskog
državni tekstil
akademija. A. N. Kosygina

MZRF

FESMU

Zavod za opću, fizikalnu i koloidnu kemiju

sažetak

Tankoslojna kromatografija. Primjena u farmaciji

Izvršio: student grupe 201-F

Danilov D.I.

Provjerio: Nemov V.A.

Habarovsk, 2005

PLAN:

Uvod

Fizikalne i kemijske osnove TLC

Razdjelna kromatografija na papiru

Osnove tankoslojne kromatografije

• sorbenti
• otapala
• priprema ploče
• tehnika primjene ispitne otopine

Kromatografija

Ploče za sušenje.

Identifikacija odvojenih tvari

Primjena TLC metode u farmaciji

• Kvantitativno određivanje triterpenskih saponina pomoću HPTLC pomoću skenirajuće denzitometrije
• Proučavanje lipidnog i flavonoidnog sastava uzoraka nekih vrsta roda Chin (Lathyrus.)

Zaključak

Književnost

Uvod

Tankoslojna kromatografija (TLC, TLC) jedna je od najčešće korištenih metoda kromatografske analize, ali najmanje popularizirana.
Unatoč značajnim nedostacima koji su postojali donedavno, naširoko se koristi za kvalitativna analiza smjese, uglavnom zbog jeftinosti i brzine dobivanja rezultata. Tankoslojna kromatografija (TLC) izvorno je razvijena za odvajanje lipida. Iako je papirna kromatografija brža od kromatografije na stupcu, nedostatak joj je što se papir može izraditi samo od materijala na bazi celuloze, što ga čini neprikladnim za odvajanje nepolarnih tvari. Tankoslojna kromatografija zadržava sve prednosti papirne kromatografije, ali dopušta korištenje bilo kojeg materijala koji se može fino samljeti i tada se dobije homogeni sloj. To može biti anorganske tvari, kao što je silikagel, glinica, dijatomejska zemlja i magnezijev silikat, kao i organske tvari, posebno celuloza, poliamidi i polietilenski prah.

Fizikalne i kemijske osnove tankoslojne kromatografije.

Osnova tankoslojne kromatografije je adsorpcijska metoda, iako je prisutna i razdjelna kromatografija.
Adsorpcijska metoda temelji se na razlici u stupnju sorpcije-desorpcije odvojenih komponenti na stacionarnoj fazi. Adsorpcija se odvija zahvaljujući van der Waalsovim silama, što je osnova fizikalne adsorpcije, polimolekularne (stvaranje više slojeva adsorbata na površini adsorbenta) i kemisorpcije (kemijska interakcija adsorbensa i adsorbata).
Za učinkovite procese sorpcije-desorpcije potrebno je veliki trg, koji nameće određene zahtjeve za adsorbens. Na velika površina razdvajanje faza je brzo uspostavljanje ravnoteže između faza komponenti smjese i učinkovito razdvajanje.
Druga vrsta tankoslojne kromatografije koja se koristi u tankoslojnoj kromatografiji je razdjelna tekućinska kromatografija.
U razdjelnoj kromatografiji obje su faze – pokretna i stacionarna – tekućine koje se međusobno ne miješaju. Razdvajanje tvari temelji se na razlici u njihovim koeficijentima raspodjele između tih faza.
Po prvi put se metoda tankoslojne kromatografije deklarirala kao "Papirna tankoslojna kromatografija", koja se temeljila na distribucijskom načinu razdvajanja komponenti.

Razdjelna kromatografija na papiru.

Budući da kromatografski papir koji se koristi u ovoj metodi (specijalne vrste filter papira) sadrži vodu (20-22%) u porama, kao druga faza koriste se organska otapala.
Primjena kromatografije na papiru ima niz značajnih nedostataka: proces separacije ovisi o sastavu i svojstvima papira, promjena sadržaja vode u porama papira s promjenama uvjeta skladištenja, vrlo niska brzina kromatografije ( do nekoliko dana) i niska ponovljivost rezultata. Ovi nedostaci ozbiljno utječu na širenje papirne kromatografije kao kromatografske metode.
Stoga se pojava kromatografije u tankom sloju sorbensa, tj. tankoslojne kromatografije, može smatrati prirodnom.

Osnove tankoslojne kromatografije.

U TLC metodi, kromatografija tvari odvija se u tankom sloju sorbensa nanesenog na čvrstu ravnu podlogu. Odvajanje se u ovoj metodi uglavnom odvija na bazi sorpcije-desorpcije.
Korištenje različitih sorbenata omogućilo je značajno proširenje i poboljšanje ove metode.
Na početku pojavljivanja metode, ploče su morale biti izrađene samostalno. Ali danas se uglavnom koriste prefabricirane pločice, koje imaju prilično širok raspon kako u veličini i nosačima, tako iu podlogama.
Moderna kromatografska ploča je baza izrađena od stakla, aluminija ili polimera (na primjer, politereftalata). Zbog činjenice da je staklena baza sve manje popularna (često se lomi, nemoguće je podijeliti ploču na nekoliko dijelova bez oštećenja sloja sorbenta, teška u težini), najčešće se koriste ploče na bazi aluminijske folije ili polimera.
Za fiksiranje sorbenta koriste se gips, škrob, silikasol i dr. koji drže zrnca sorbenta na podlozi. Debljina sloja može biti različita (100 ili više mikrona), ali najvažniji kriterij je da sloj mora biti ujednačene debljine bilo gdje na kromatografskoj ploči.

Sorbenti

Najčešći sorbens je silikagel.
Silikagel je hidratizirana silicijeva kiselina koja nastaje djelovanjem mineralnih kiselina na natrijev silikat i sušenjem dobivenog sola. Nakon mljevenja sola koristi se frakcija određene veličine zrna (označena na ploči, obično 5-20 mikrona).
Silikagel je polarni sorbent, u kojem -OH skupine služe kao aktivni centri. Lako upija vodu na površini i stvara vodikove veze.
Glinica. Glinica je slabo bazični adsorbent i uglavnom se koristi za odvajanje slabo bazičnih i neutralnih spojeva. Nedostatak ploča na aluminijevom oksidu je obavezna aktivacija površine prije uporabe u sušionici kada visoka temperatura(100-150 0 C) i mali adsorpcijski kapacitet sloja u usporedbi sa silika gelom.
Dijatomejska zemlja je adsorbent koji se dobiva iz prirodnih minerala: dijatomejske zemlje. Sorbent ima hidrofilna svojstva, ali niži adsorpcijski kapacitet sloja u usporedbi sa silika gelom.
Magnezijev silikat je manje polaran od silika gela i obično se koristi kada polarniji adsorbenti ne daju učinkovito odvajanje.
Celuloza - tankoslojne ploče obložene celulozom vrlo su učinkovite u odvajanju složenih organskih molekula. Adsorbent su uglavnom celulozne kuglice promjera do 50 mikrona, fiksirane na nosač škrobom. Ali kao iu papirnoj kromatografiji, porast fronte otapala je vrlo spor.
U ionsko-izmjenjivačkim kromatografskim pločama kao adsorbens koriste se ionsko-izmjenjivačke smole koje sadrže kvaterne amonijeve ili aktivne sulfo skupine uključene u ionsku izmjenu. Tankoslojna kromatografija s ovom vrstom ploča provodi se s mobilnim fazama koje sadrže jake kiseline ili lužine. Ove ploče su učinkovite za odvajanje makromolekularnih i amfoternih spojeva.

Navedeni sorbenti su najčešći, ali osim njih, postoje mnoge tvari koje se koriste kao sorbenti. To su talk, kalcijev sulfat, škrob itd.
Istodobno, čak i već spomenuti sorbenti mogu se modificirati kako bi im se dala nova sorpcijska svojstva (impregnacija sorbensa reagensima, npr. AgNO 3 , stvaranje ploča s reverznom fazom). Upravo ta raznolikost mogućih faza uz minimalne troškove omogućuje korištenje TLC-a za kromatografiju ogromnog broja tvari.

Otapala

U tankoslojnoj kromatografiji kao mobilna faza koriste se ili čiste tvari (etil acetat, benzen itd.) ili smjese tvari (sustavi) u određenom omjeru.
Odabir mobilne faze (sustava) provodi se prema sljedećim pravilima:

· Odaberite sustav u kojem komponente koje se odvajaju imaju nisku topljivost (ako je topljivost tvari velika, tada će se tvari kretati naprijed, ako je topljivost niska, ostat će na početku). S razdjelnom kromatografijom ili kada se koriste obrnute faze, topljivost tvari mora biti veća u mobilnoj fazi nego u stacionarnoj fazi.

· Sastav sustava mora biti konstantan i lako ponovljiv.

· Otapalo ili komponente sustava ne smiju biti otrovne ili nedostatne.

· Sustav mora potpuno odvojiti tvari slične strukture, a razlike u Rf moraju biti najmanje 0,05.

· Sustav ne smije uzrokovati kemijske promjene u komponentama koje treba odvojiti.

U odabranom sustavu analiti moraju imati razna značenja Rf i raspoređen po cijeloj duljini kromatograma. Poželjno je da Rf vrijednosti leže u rasponu od 0,05-0,85.

· Pri odabiru sustava mora se uzeti u obzir i priroda tvari koje se odvajaju. Dakle, kod kromatografiranja tvari bazičnih svojstava sustav ne bi trebao imati kisela svojstva i obrnuto.

Priprema ploče

Kad se koriste kupljene ploče, potrebno ih je prethodno pripremiti za kromatografiju. To je zbog činjenice da tijekom skladištenja pločasti adsorbenti apsorbiraju ne samo vlagu, već i druge tvari sadržane u zraku. Kada se tijekom kromatografije koriste nepripremljene ploče, pojavljuje se fronta "prljavštine", koja može ometati određivanje tvari s velikim Rf vrijednostima, a neke tvari, poput vode, mogu promijeniti sastav mobilne faze, čime se mijenjaju rezultirajuće Rf vrijednosti. .
Preliminarna priprema ploča sastoji se od dispergiranja ploča čistim otapalom na cijelu visinu ploče (metanol, benzen, dietil eter), nakon čega slijedi sušenje ploče u pećnici na temperaturi od 110-120 0C 0,5-1 sat. Na ovaj način može se pripremiti nekoliko ploča odjednom, a čuvane na suhom, zatvorenom mjestu zadržavaju svoja svojstva nekoliko mjeseci.

Tehnika primjene ispitnih otopina.

Kako se pokazalo, primjena ispitivane tvari nije tako komplicirana operacija, ali u isto vrijeme uvelike utječe na rezultate kromatografije.
Često se ispituju ili tekući analiti ili otopine krutih tvari, bez prethodne pripreme uzorka.
Stoga je uvijek potrebno zapamtiti niz točaka koje ozbiljno utječu na rezultate odvajanja.
Najvažnija je koncentracija primijenjenih tvari. U TLC-u je uobičajeno primjenjivati ​​koncentracije otopina od oko 1%. No, s druge strane, osjetljivost metode omogućuje određivanje tvari s mnogo nižim koncentracijama.
Ako je ukupna koncentracija komponenata u ispitivanoj tvari nepoznata ili je koncentracija poznata, ali ta vrsta tvari još nije kromatografirana, potrebno je utvrditi koja je količina ispitivane otopine dovoljna za kvalitetnu kromatografiju. Postoji nekoliko metoda za utvrđivanje toga.
Najprije je potrebno nanijeti nekoliko točaka kromatografskih otopina jednake veličine, ali s različitim količinama (npr. 1, 2, 5 µl) i nakon kromatografije proučiti oblik i veličinu odvojenih točaka.
Dakle, uz pravilno odabranu koncentraciju, oblik izdvojenih tvari je isti kao oblik nanesen na startnu liniju. Ako su odvojene točke veće od točke na početku, tada je primijenjena koncentracija previsoka. Pojava "repića", nepravilnog oblika izdvojenih mrlja na ploči, također može ukazivati ​​na visoku koncentraciju, ali može biti uzrokovana nepravilno odabranim kromatografskim sustavom ili kemijskom interakcijom izdvojenih komponenti.
Odabirom količine taložene tvari i sustava otapala moguće je na jednoj ploči postići potpuno odvajanje do deset komponenti u ispitivanim tvarima. Prikladno je nanositi uzorke na poseban stol s šablonama i grijanjem. Uočavanje se provodi na "startnoj liniji" 1-2 cm od donjeg ruba ploče. To je neophodno tako da kada se ploča spusti u sustav, uzorci se ne otope u njoj, a sva taložena tvar se podvrgne kromatografiji.
Primjena otopina provodi se mikrošpricom ili graduiranim kapilarama. Veličina nanesene točke ne smije biti veća od 4 mm. To je zbog činjenice da s većom veličinom mjesta dolazi do promjene oblika pod djelovanjem fizičkih sila, a granice razdvojenih komponenti mogu se preklapati.
Primjena ispitivanih tvari na pločice ne smije biti popraćena destrukcijom sorbensa (što ima prilično snažan učinak na kvalitetu separacije), pa kap treba nanijeti dodirivanjem igle ili kapilare na sloj sorbensa, a ne pritiskom. Na veličinu nastale točke ne utječe samo količina nanesene otopine, već i polaritet otapala i njegova točka vrenja. Dakle, pri primjeni iste tvari u različitim otapalima, dobivena mrlja u kojoj je kao otapalo korišten metanol bit će veća od mrlje iz otopine kloroforma. s druge strane, kada se supstrat zagrije, isparavanje otapala će biti intenzivnije, a veličina mrlje će se također smanjiti.
Naravno, lakše je koristiti sušilo za kosu kada se nanosi na suhe mrlje, ali samo ako postoji potpuno povjerenje da se nanesene tvari neće oksidirati pod djelovanjem vrućeg zraka.
Razmak između nanesenih mjesta trebao bi biti oko 2 cm.
Ponekad se tijekom kromatografije na pločama uočava rubni učinak, zbog čega se mrlje ne nalaze na istoj liniji, već izgledaju poput potkove ili dijagonalno. Kako bi se uklonio ovaj učinak, svakoj točki može se "oskrbiti" vlastiti trag, odvajajući naneseni uzorak od ostalih uklanjanjem linije sorbenta. To je najbolje učiniti ispod ravnala oštrim predmetom (kao što je skalpel), ali pazite da ne uklonite previše sorbenta.
Nakon nanošenja ispitivanih tvari na ploču potrebno je postići potpuno uklanjanje otapala, budući da i mala količina otapala u ispitivanoj tvari može utjecati na odvajanje, pa čak i promijeniti sastav kromatografskog sustava.
Uklanjanje otapala obično se provodi prirodnim sušenjem ploča u trajanju od 5-10 minuta, bilo zagrijavanjem sušilom za kosu ili u pećnici.

Kromatografija

Tankoslojna kromatografija ima nekoliko metoda, uglavnom vezanih uz vrstu kretanja otapala.

Tankoslojna kromatografija prema gore

Tankoslojna kromatografija prema dolje

Horizontalna tankoslojna kromatografija

· Radijalna tankoslojna kromatografija.

Uzvodna tankoslojna kromatografija

Ova vrsta kromatografije je najčešća i temelji se na činjenici da se prednji dio kromatografskog sustava podiže duž ploče pod djelovanjem kapilarnih sila, tj. prednji dio kromatografskog sustava pomiče se odozdo prema gore. Za ovu metodu koristi se najjednostavnija oprema, budući da se kao kromatografska komora može koristiti svaki spremnik s ravnim dnom i čvrsto prianjajućim poklopcem, u koji se može slobodno staviti kromatografska ploča.
Metoda uzlazne tankoslojne kromatografije ima niz nedostataka. Na primjer, brzina uspona fronte duž ploče događa se neravnomjerno, tj. u donjem dijelu je najviši, a s podizanjem fronte smanjuje se. To je zbog činjenice da je u gornjem dijelu komore zasićenost parama otapala manja, stoga otapalo intenzivnije isparava s kromatografske ploče, stoga se smanjuje njegova koncentracija i usporava brzina kretanja. Da bi se uklonio ovaj nedostatak, duž stijenki kromatografske komore pričvršćene su trake filter papira, duž kojih uzlazni kromatografski sustav zasićuje komoru parom po cijelom volumenu.
Neke kromatografske komore imaju podjelu na dvije ladice na dnu. Ovo poboljšanje omogućuje ne samo smanjenje potrošnje kromatografskog sustava (potreban je manji volumen za postizanje potrebne visine kromatografskog sustava), već i korištenje dodatne kivete za otapalo, što povećava tlak zasićene pare u komori.
Potreba za praćenjem fronte otapala također se može smatrati nedostatkom, budući da linija fronte otapala može "pobjeći" do gornjeg ruba. U tom slučaju više nije moguće odrediti stvarnu vrijednost Rf.

Tankoslojna kromatografija prema dolje

Ova kromatografska metoda temelji se na činjenici da se prednji dio kromatografskog sustava spušta preko ploče uglavnom pod djelovanjem sile teže, tj. fronta mobilne faze kreće se odozgo prema dolje.
Za ovu metodu na gornji dio kromatografske komore pričvršćena je kiveta s kromatografskim sustavom iz koje pomoću fitilja u kromatografsku ploču ulazi otapalo koje teče prema dolje i uzorak se kromatografira.
Nedostaci ove metode uključuju složenost opreme. Ova metoda se uglavnom koristi u papirnoj kromatografiji.

Horizontalna tankoslojna kromatografija

Ova metoda je najsloženija u dizajnu hardvera, ali najprikladnija. Dakle, u kromatografskoj komori ploča se postavlja vodoravno i sustav se fitiljem dovodi do jednog ruba ploče. Fronta otapala kreće se u suprotnom smjeru.
Postoji još jedan trik za maksimalno pojednostavljenje kamere. Da biste to učinili, kromatografska ploča na bazi aluminija lagano se savije i stavi u komoru. U ovom slučaju, sustav će djelovati s dvije strane u isto vrijeme. U tu svrhu prikladne su samo ploče s aluminijskom podlogom, budući da su plastične i staklene baze "nesavitljive", tj. ne zadržava svoj oblik.
Prednosti ove metode uključuju činjenicu da se u vodoravnoj ćeliji zasićenje sustava parom događa mnogo brže, frontalna brzina je konstantna. A kod kromatografiranja s obje strane prednja strana ne "bježi"

Radijalna tankoslojna kromatografija.

Radijalna tankoslojna kromatografija sastoji se u tome da se ispitivana tvar nanosi na središte ploče i tamo se dovodi sustav koji se kreće od središta prema rubu ploče.

Ploče za sušenje.

Nakon postupka odvajanja ispitivanih tvari, ploče se suše. Ovo je također važan proces, jer ako na ploči ima čak i tragova otapala, moguće je dobiti netočne rezultate kromatografije.
Ako je kromatografski sustav uključivao samo komponente niskog vrelišta, tada je dovoljno prirodno sušenje od 3-5 minuta. Ako sustav uključuje tekućine visokog vrelišta (alkoholi, voda, organske kiseline itd.), ploče treba sušiti najmanje 10 minuta ili ploču treba staviti u pećnicu.

Identifikacija odvojenih tvari.

Osušena ploča je kromatogram proučavanih tvari. Ako su tvari obojene, tada identifikacija počinje određivanjem boje izdvojenih tvari.
Ali u većini slučajeva, odvojene tvari su bezbojne i jednostavna vizualna usporedba nije moguća.
Za tankoslojnu kromatografiju postoji nekoliko vrsta kvalitativne analize (identifikacije) odvojenih tvari:

· Vizualne metode i određivanje Rf odvojenih tvari.

Reakcije boja.

· Usporedba sa svjedocima.

· Fizičke i kemijske metode identifikacije.

Razmotrimo detaljnije svaku vrstu kvalitativne analize u tankoslojnoj kromatografiji.

Fizikalne metode

Vizualne metode se uglavnom koriste za lociranje mrlja odvojenih tvari na kromatografskoj ploči. Da bi se to postiglo, ploča se promatra u vidljivom svjetlu i pomoću ultraljubičastog svjetla (uglavnom svjetla valne duljine od 366 i 254 nm)
Ovo je prva faza identifikacije, koja određuje kvalitetu odabranih uvjeta i rezultata kromatografije.
Dakle, nakon utvrđivanja kvalitete kromatografije (odsutnost "repova" tvari koje se odvajaju ili preklapanja njihovih točaka, pravilan oblik i veličina, odsutnost spajanja kromatografskih tragova itd.) i proglašavanje odvajanja prikladnim za daljnje istraživanje, odredite Rf identificiranih točaka.

Rf vrijednost.

Jedan od glavnih pokazatelja u TLC je Rf. Ovaj je parametar analogan retencijskom vremenu i ovisi o svojstvima tvari koje se odvajaju, sastavu mobilne faze i sorbensa, te o fizikalnim parametrima.
Određivanje Rf vrijednosti provodi se kao omjer udaljenosti koju prijeđe tvar i udaljenosti koju prijeđe fronta otapala

Vrijednost Rf je bezdimenzionalna vrijednost i ima vrijednost od 0 do 1. Međutim, u literaturi se često nalaze pokazatelji kao što su hRf, Rf × 100, koji su isti Rf, ali pomnoženi sa 100, kako ne bi operirali s decimalne vrijednosti.
Na vrijednost Rf ne utječe udaljenost koju prijeđe fronta otapala, međutim, mnoge metode opisuju prolazak fronte na udaljenosti od 10 cm. Ovo se koristi samo za olakšavanje izračuna Rf.
U praksi se na početku određuje udaljenost koju prijeđe fronta otapala: od početne crte (a ne od ruba ploče) do mjesta gdje je bila fronta na kraju kromatografije. Zatim se odredi udaljenost od startne linije do mjesta izdvojene tvari. Ovdje utječe veličina mjesta! Uostalom, ako mrlja ima okrugli oblik i male veličine, tada rezultirajući Rf ima jasnu vrijednost. A ako rezultirajuća točka ima veliku veličinu ili nepravilan oblik, tada pri određivanju Rf takve točke pogreška može doseći 0,1!
U slučaju razdjelne kromatografije, koeficijent raspodjele tvari i njezin Rf povezani su odnosom:

gdje Sp i S n- površine presjeka pokretne i stacionarne faze.
Kao što vidimo, koeficijent raspodjele, pri konstantnom omjeru Sp/Sn je veličina proporcionalno ovisna o Rf i može se odrediti preko njega.

reakcije boja.

Reakcije boja u tankoslojnoj kromatografiji koriste se izuzetno široko. Oni služe ne samo za određivanje položaja odvojenih komponenti (obrada sumpornom kiselinom, jodnim parama), već i za određivanje klase tvari i identifikacije (u prisutnosti pojedinačnih reakcija).
Ovdje nećemo razmatrati ovu ogromnu raznolikost boja kvalitativne reakcije, samo ćemo reći da ako se sve kvalitativne reakcije podudaraju i dobivene Rf vrijednosti tvari u tri raznih sustava s literaturnim podacima tvar je identificirana. Iako je po meni potrebna dodatna potvrda istraživanjem drugom fizikalno-kemijskom metodom.

Usporedba svjedoka.

Pri provođenju studija tvari s očekivanim sastavom koristi se metoda kromatografije svjedok- poznata tvar. Ova se metoda koristi kada je teško izdržati kromatografske uvjete, nema literaturnih podataka o Rf za određeni sustav ili adsorbent, korištenje metode gradijenta itd. A kada provodite reakcije boja, možete usporediti ne samo boje, već i nijanse proučavanih tvari i svjedoka, što je također važno.
S druge strane, ova metoda zahtijeva dodatne troškove za svjedoke.

Metode kvantitativne analize

Kvantitativna analiza u tankoslojnoj kromatografiji ima nekoliko vrsta, karakterizirajući svaku fazu razvoja metode. Iako se neke metode mogu primijeniti samo kao polukvantitativne, one se još uvijek koriste u praksi.

metoda vizualne usporedbe. Kao što je gore spomenuto, intenzitet boje mrlje i njezina veličina ovise o količini kromatografirane tvari. Stoga se vizualna kvantifikacija temelji na nekoliko tehnika.
Metoda razrjeđivanja. Ova se metoda sastoji u tome da se za svaku tvar odredi granična koncentracija pri kojoj se tvar ne može odrediti kromatografskom metodom. Kod kromatografiranja ispitivane tvari, razrjeđivanje se provodi sve dok se ne prestane pojavljivati ​​na ploči.
Sadržaj tvari C, određen ovom metodom, nalazi se formulom:

gdje n-razrjeđivanje, a- koncentracija tvari pri kojoj se ne pojavljuje tijekom kromatografije.
Metoda određivanja površine mrlje. Ako se primjenjuju isti volumeni ispitivanih tvari i svjedoka, tada su površine mrlja dobivene kromatografijom proporcionalne logaritmu koncentracije tvari. S=a ul c+b

gdje su a i b empirijski koeficijenti određeni eksperimentalno.
Ako mrlja odvojene tvari ima oštre granice, tada se površina mrlje može odrediti gravimetrijskom metodom (izrezati točku i izvagati), izmjeriti planimetrom. Ova metoda daje pogrešku do 10-15%.
Međutim, ima niz značajnih nedostataka. Prvi i najznačajniji je da je na ovaj način moguće odrediti koncentraciju obojenih tvari ili onih koje imaju fluorescenciju u UV području (254, 366 nm). Taj se nedostatak može otkloniti dodavanjem različitih fosfora sorbentu, što povećava pogrešku određivanja.
Može se koristiti i obrada ploča razvijajućim tvarima (reagensima) (npr. filtar papirom impregniranim razvijajućim reagensom, zatim kontaktom s kromatografskom pločom i daljnjim određivanjem površine razvijene tvari na njoj), ali pogreška određivanja je također velika.
Potreba za pouzdanijim rezultatom kvantifikacije dovela je do uporabe instrumentalnih metoda.
Metoda eluiranja. Ova metoda sastoji se u činjenici da se odvojena tvar ispere s sorbensa otapalom, a njezina koncentracija se određuje drugim metodama - fotometrijskim, polarografskim itd. Ovo je prilično točna metoda, ali samo pod uvjetom kvantitativne izolacije izdvojene tvari. Zbog velikog intenziteta rada, metoda se koristi prilično rijetko i neprihvatljiva je za veliki broj uzoraka koji se proučavaju.
Fotografska metoda Definicija se sastoji u fotografiranju ploča s izdvojenom tvari i daljnjem određivanju stupnja zacrnjenja, pomoću dezintometara.
radiografska metoda sličan fotometrijskom, samo s tom razlikom što se utvrđuje zacrnjenje ploče, uzrokovano zračenjem izdvojene tvari. Ova se metoda koristi samo za određivanje tvari s označenim atomima.
Fotodezintometrijska metoda može se koristiti bez izolacije tvari s ploče i temelji se na određivanju ne samo površine mrlje, već i njezinog intenziteta.
Ovo je najtočnija metoda za određivanje koncentracije tvari, jer omogućuje, korištenjem kalibracijskih grafikona, provedbu prilično točnih kvantitativnih određivanja svih odvojenih tvari (do 2-10%) izravno na ploči u kratkom vremenskom razdoblju. .
Nije iznenađujuće da se razvojem tankoslojne kromatografije povećava uporaba dezintometara, povećava se osjetljivost, a time i točnost određivanja koncentracije separiranih tvari i približava se točnosti tekućinske kromatografije visoke djelotvornosti.

Riža. 1. Tipična komora za razvijanje tankoslojne kromatografske ploče

1. poklopac
2. staklena komora
3. TLC ploča
4. sorbent
5. mjesto uzorkovanja
6. otapalo

Tipični TLC kromatogram metil estera masnih kiselina.

Na kromatogramu SLAVA= fatty acids methyl esters = metilni esteri masnih kiselina. početak= točka primjene smjesa koje se odvajaju.

Kromatogram je napravljen na Sorbfil ploči. Sustav je benzen. Manifestacija - pougljenje nakon prskanja sumpornom kiselinom.

Točka 1 - metilni esteri masnih kiselina. Točka 2 - produkti metilacije ukupnih lipida.

Strijela prikazan je smjer gibanja fronte (sustava) otapala. Fronta otapala tijekom kromatografije pomaknula se do gornjeg ruba ploče.

Primjena TLC metode u farmaciji

Velika važnost kromatografskih metoda za farmaciju posljedica je činjenice da je u proizvodnji lijekova u mnogim slučajevima potrebna prethodna izolacija prirodnih ili sintetskih proizvoda u čistom obliku. Analiza se također često temelji na razdvajanju smjesa na komponente. Razmotrimo dva primjera primjene TLC metode, dokazujući njezinu važnost u analizi i proizvodnji ljekovitih tvari.

Kvantitativno određivanje triterpenskih saponina pomoću HPTLC pomoću skenirajuće denzitometrije

Triterpenski saponini (glikozidi) aktivni su sastojci mnogih lijekova.

Većina trenutno korištenih metoda za kvantitativno određivanje triterpenskih saponina temelji se na kiseloj hidrolizi potonjih s daljnjim određivanjem aglikona, najčešće titrimetrijskim, rjeđe spektralnim metodama analize.

Slične metode koje se temelje na uništavanju molekula saponina imaju brojne nedostatke. Oni su dugi i ne omogućuju kvantitativnu procjenu omjera pojedinih saponina u ukupnim pripravcima koji sadrže saponine.

U većini slučajeva autori se u pravilu ograničavaju na kvalitativnu procjenu pomoću TLC metode, najpristupačnije i najjednostavnije kromatografske metode analize. Korištenje TLC-a za određivanje kvantitativnog sadržaja komponenti ograničeno je nedostatkom skenirajućih denzitometara.

U ovom radu prikazani su rezultati kvantitativnog TLC određivanja nekih triterpenskih saponina, derivata oleanolne kiseline, u farmaceutskim pripravcima i ekstraktima biljnog materijala.

Kao objekti istraživanja odabrani su triterpenski saponini mandžurijske aralije (aralozidi). čije je kvalitativno određivanje u različitim objektima obrađeno u radu, kao i triterpenski saponini šećerne repe - tvari s unaprijed utvrđenim farmakološkim djelovanjem. Oba su derivati ​​oleanolne kiseline s malom (ne više od četiri) količinom ostataka šećera, što upućuje na njihovo slično ponašanje u tankom sloju sorbenta.

Kao standarde koristili smo zbroj aralozida izoliranih iz Saparal tableta i zbroj saponina šećerne repe izoliranih iz svježe ubranog rizoma. Za nanošenje na ploču pripremljene su vodeno-alkoholne (80% etanolne) otopine saponina sa sadržajem potonjih 0,4-2,0 mg/ml. Kromatografija je provedena pomoću ploča za TLC "Silufol" (Češka) 15 x 15 cm, "Armsorb" za HPTLC (Armenija) 6 x 10 cm i "Sorbfil" (Rusija) 10 x 10 cm. Visina prednjeg uspona, dovoljna za potpuno odvajanje, bila je 10,6 odnosno 6 cm. Uzorci su naneseni mikroštrcaljkom MSH-10 (Rusija) na ploču zagrijanu na 40°C. Optimalni volumen nanesenog uzorka bio je 3-5 μL. Nanošenje je obavljeno u nekoliko faza kako bi promjer startne točke bio veći od nije prelazio 2 mm.

Kromatografija je provedena na temperaturi od 20 - 25 °C. Na kraju eluiranja, ploče su osušene na zraku i tretirane detekcijskim reagensom pomoću laboratorijskog staklenog raspršivača. Zone su skenirane pomoću denzitometra za skeniranje Shimadzu CS-9000" (Japan). Uspoređena je kvaliteta zona dobivenih kromatografijom u tri najčešće preporučena sustava eluiranja: I. kloroform - metanol - voda (30:17:3) : II. n-butanol - etanol - amonijak (7:2:5) III. n-butanol - voda - octena kiselina (4:5:1), gornji sloj IV. benzen - etil acetat (1:1) (za šećerni saponini repa).

Kao reagensi za detekciju korištena je 25%-tna alkoholna otopina fosforvolframove kiseline (grmizne mrlje saponina na bijeloj pozadini). najčešće se koristi za kvantitativna TLC određivanja takvih spojeva i 10% alkoholna otopina fosfomolibdinske kiseline, koja se preporučuje za razvoj triterpenoidnih zona (saponinske zone su tamnoplave na žutoj pozadini). Obrada ploča parama amonijaka u potonjem slučaju omogućuje obezbojavanje pozadine i povećanje kontrasta mrlja.

Kao rezultat provedenih istraživanja odabrani su optimalni uvjeti za kromatografski proces denzitometrijskog određivanja. Najbolje od tri vrste ploča prepoznao je "Armsorb" za HPTLC. visoka efikasnost Proces je olakšan tankim (II0 μm) i homogenim frakcijskim sastavom (5-10 μm) slojem silikagela, koji omogućuje dobro odvajanje i minimalno zamućenje zona čak i kada se fronta otapala podigne za 6 cm. Sorbfil ploče su gotovo jednako dobar kao oni u sposobnosti odvajanja, ali je vrijeme eluiranja na njima gotovo dvostruko duže. Ploče "Silufol" pri dovoljno visokoj stopi eluiranja omogućuju vam odvajanje komponenti s većim kromatografskim putem, što dovodi do određenog zamućenja zona, ali njihova je upotreba također moguća.

Ispiranje se može izvesti dovoljno kvalitetno u bilo kojem od prva tri sustava eluiranja. I daje dobitak u vremenu, IV omogućuje bolje odvajanje saponina šećerne repe od prva tri.

Oba reagensa za detekciju daju prilično stabilno bojenje zona kada se skeniranje provodi unutar 1 - 2 sata od trenutka razvijanja. Nakon tog razdoblja zone saponina na pločama tretiranim fosfovolframovom kiselinom mijenjaju boju iz malinaste u ljubičastu, što može dovesti do iskrivljenja rezultata kvantitativne analize tijekom skeniranja. U ovom je slučaju poželjnije liječenje fosfomolibdenskom kiselinom. Pohranjene na mjestu zaštićenom od svjetlosti, ploče sa zonama razvijenim ovim reagensom dale su potpuno ponovljive rezultate nakon nekoliko mjeseci od trenutka razvijanja.

Granica detekcije saponina bila je 5 μg u uzorku kod razvijanja s fosfovolframovom kiselinom i 0,5 μg u uzorku kod razvijanja s fosfomolibdinskom kiselinom. Obrada parama amonijaka omogućila je smanjenje granice detekcije saponina u potonjem slučaju na 0,2 μg po uzorku.

Kvantitativno određivanje saponina pomoću TLC-a pomoću skenirajuće denzitometrije provedeno je na Armsorb pločama (brzina kromatografije u ovom slučaju bila je 2 puta veća) ili "Sorbfil", u sustavu ispiranja II i III (kao sadržava manje toksične komponente). Zone su detektirane 10% otopinom fosfomolibdinske kiseline. Volumen nanesenog uzorka nije veći od 5 μl, visina prednje strane eluenta je 6 cm, vrijeme eluiranja je 30 - 60 minuta. Valna duljina skeniranja λ = 675 nm. Nakon obrade ploča, saponini aralije i šećerne repe pojavljuju se u obliku tri zone različitog intenziteta.

Opći prikaz denzitograma dobivenih tijekom skeniranja prikazan je na sl. jedan.

Usporedba kromatograma saponina izoliranih iz tableta "Saparal" (Sl. 1, a) i "Aralia tinkture" (Sl. 1,6) omogućuje nam da uočimo različiti omjer 44

aralozide A, B i C, koji su dio ovih oblika doziranja. Slična varijabilnost u omjeru pojedinih saponina u sirovinama, ovisno o uvjetima uzgoja biljke, primijećena je ranije. Omjer saponina u gotovim oblici doziranja lako procijeniti pomoću dobivenih denzitograma. Budući da na kromatogramu postoje 3 zone koje odgovaraju saponinima, odnosno tri vrha na denzitogramu, površine svih vrhova sumirane su prilikom konstruiranja kalibracijske ovisnosti. Pogreška je u ovom slučaju bila manja nego u izračunima temeljenim na parametrima vrha jedne od komponenti, uzimajući u obzir varijabilnost njihovog omjera (slika 2).

Riža. I. Denzitogrami dobiveni skeniranjem TLC ploča: a- Aralia saponini izolirani iz Saparal tableta; 6 - saponini tinkture aralije; u- saponini šećerne repe. Ukupan sadržaj saponina u uzorku je 5 μg. A, B, C- vrhovi saponina; 0 - startna linija; f- Prednja linija.

Riža. Slika 2. Kalibracijska ovisnost zbroja površina peakon saponina na kromatogramu o njihovom sadržaju u uzorku. / - saponini aralije; 2 - saponini šećerne repe. Na apscisnoj osi - sadržaj saponina u uzorku (mcg), na ordinatnoj osi - zbroj površina vrhova (cm 2).

Kalibracijska ovisnost zbroja površina vrhova na denzitogramu o sadržaju tvari u uzorku dobivena je kromatografijom niza standardnih otopina s poznatim sadržajem saponina. Početna otopina je pripravljena otapanjem u 80% etanolu točne težine saponina, osušenih do konstantne težine. Niz radnih otopina pripremljen je sekvencijalnim razrjeđivanjem početnog 80% etanola. Sadržaj saponina u njima bio je 0,04 - 2,0 mg/ml (0,2 - 10 µg u uzorku s volumenom uzorka od 5 µl). Ovaj raspon koncentracije može se smatrati optimalnim za skeniranje. Minimalni sadržaj saponina određen ovom metodom je 0,2 µg/uzorak. Relativna standardna devijacija u ovom slučaju ne prelazi 0,03.

Rezultirajuće kalibracijske ovisnosti su nelinearne, što je u potpunosti u skladu s Kubelka-Munkovom teorijom, koja uzima u obzir apsorpciju i raspršenje svjetlosti od strane sorbenta. U uskom rasponu niskih koncentracija, ovisnosti se mogu smatrati linearnim (0,2 - 2,0 µg/uzorak). Nelinearni dio krivulja može se linearizirati pretvaranjem količine tvari u uzorku i površine vrha u recipročne vrijednosti i poprima oblik prikazan na slici. 3.

Riža. 3. Ovisnost recipročne vrijednosti zbroja površina vrhova saponina na kromatogramu (1/S 10 -1) o njihovoj recipročnoj vrijednosti sadržaja u uzorku (1/m - 10 -1). 1 - saponini aralije; 2 - saponini šećerne repe.

Pomoću dobivene kalibracijske ovisnosti određen je sadržaj saponina u tinkturi aralije. 5 ml tinkture razrijeđeno je sa 70% etanolom u odmjernoj tikvici od 25 ml. 5 μl dobivene otopine naneseno je na početnu liniju Armsorb plastansa, a na susjednu točku 5 μl standardne otopine aralozida koncentracije 1 mg/ml (5 μg u uzorku). obrađen kako je gore opisano.

Razlika između dobivenih rezultata i rezultata određivanja prema PS 42-1647-93 (5,3 mg/ml) bila je 6-7% u smjeru precijenjenosti, što se može objasniti gubitkom saponina tijekom višestupanjskog priprema uzorka prema PS (tablica).

Gore opisana metoda korištena je za određivanje saponina u tabletama "Saparal" iu biljnim sirovinama (korijeni mandžurijske aralije i rizomi šećerne repe) uz preliminarnu iscrpnu ekstrakciju saponina iz tableta iz sirovina - 80% vrućeg etanola. Odstupanja od rezultata određivanja prema FS 42-1755 - 81 za tablete (0,040 g) su u istim granicama kao i za tinkturu (tablica).

Tako je prikazana mogućnost ekspresnog kvantitativnog određivanja nekih triterpenskih saponina, derivata oleanolne kiseline u lijekovima i biljnom materijalu HPTLC-om uz naknadnu kvantitativnu procjenu dobivenih zona skenirajućom denzitometrijom.

Rezultati determinacije dosta dobro koreliraju s rezultatima determinacije PS-om. Tehnika omogućuje kombiniranje utvrđivanja autentičnosti preparata pomoću TLC (pomoću FS) s naknadnim skeniranjem zona komponenata na pločama i njihovom kvantitativnom procjenom. Kromatogrami dobiveni skeniranjem također omogućuju određivanje omjera pojedinih saponina u analiziranim objektima.

Rezultati kvantitativnog određivanja araloza uCTofik-od aralije (I) i tablete "Saparal" (2) metodom TGC pomoću skeniranja dsnsptoietrnn /" = 0,95, i - 5,/=2,78,/=4

PROUČAVANJE LIPIDNOG I FLAVONOIDNOG SASTAVA UZORAKA NEKIH VRSTA RODA CHINA ( Lathyrus .)

Od mnogih predstavnika obitelji mahunarki, poput lucerne, lupine, djeteline, grahorice, izolirani su flavonoidi širokog spektra djelovanja: protuupalno, zacjeljivanje rana, jačanje krvnih žila itd. Iz crvene djeteline izolirani su izoflavoni: biohanin A - 0,8% i formononetin - 0,78%, koji imaju estrogensko djelovanje.

Proučavali smo sastav flavonoida u određenim vrstama ranga roda: ch.sjetva (I), schlugovaya (II), ch.

S obzirom na moguću primjenu lipidnog kompleksa u aditivi za hranu i lijekova, također smo proučavali kompletan frakcijski sastav lipida u travi i sjemenkama brade.

Materijali i metode

Izolacija lipidne frakcije iz suhih sirovina provedena je prema metodi Bligha i Dyera.

Uzorku (0,2 g) suhog biljnog materijala dodano je 1,6 ml destilirane vode i ostavljeno jedan dan na hladnom. Zatim je dodano 6 ml smjese kloroform - metanol (1:2) i ostavljeno 3 dana, nakon čega je centrifugirano na 8 tisuća okretaja u minuti - 15 minuta. 2 ml vode i 2 ml kloroforma dodano je bistrom supernatantu. Dobiveni 2-fazni sustav je odvojen u lijevku za odjeljivanje. Kloroformski sloj je ispran dva puta s metanolom i uparen do suhog na rotacijskom uparivaču. Ostatak je osušen u vakuumskom eksikatoru, zatim razrijeđen kloroformom do koncentracije od 10 mg/ml, a otopina je pohranjena u stabiliziranom kloroformu na +4°C.

Kvalitativna analiza lipidne frakcije provedena je pomoću TLC na Kizelgel 60 (254) pločama u sljedećim sustavima otapala:

A. Za neutralne lipide: 1) Heksan - benzen (9:1); 2) Heksan - eter - octena kiselina (90:10:1).

B. Za polarne lipide (fosfolipide): 1) kloroform - aceton - metanol - octena kiselina - voda (6:8:2:2:1), kiselo; 2) kloroform - meta-

nol - 26% amonijak (65:25:5), bazični; 3) kloroform - metanol - voda (65:25:4), neutralno.

Prilikom određivanja kvalitativnog sastava fosfolipida, njihova identifikacija je provedena pomoću različitih razvijača (jodne pare, ninhidrin, Dragendorffov reagens, sumporna kiselina) i pomoću Rf standardima.

Gore navedeni skup sustava i reagensa omogućio je provedbu iscrpne analize lipidnih frakcija izoliranih iz uzoraka brade.

Za proučavanje sastava flavonoida, uzimajući u obzir faze vegetacije, odabrani su sljedeći uzorci: I (faza cvatnje); IV (faza cvjetanja); III (sochevnik) faza pupanja; II (faza cvjetanja); II (faza plodonošenja); II (faza vegetacije prije cvatnje).

Izolacija flavonoida iz suhih sirovina provedena je metodom koja osigurava njihovu iscrpnu ekstrakciju.

U tu svrhu, 1 g zdrobljene biljke stavljeno je u refluksnu tikvicu, napunjenu s 20 ml 70% etanola i kuhano 20 minuta u vodenoj kupelji. Ekstrakt je ohlađen, filtriran kroz stakleni Schott filter i uparen do suhog na rotacijskom isparivaču. Ostatak je otopljen u etilnom alkoholu do konačne koncentracije od 10 mg/ml. Određivanje ukupnog sadržaja flavonoida provedeno je korištenjem rutina kao standarda. Rezultati ovog istraživanja prikazani su u tablici. 3.

Kvalitativni sastav flavonoida određen je TLC-om na Kieselgel 60(254) pločama tvrtke Merck, u sustavu otapala n-butanol - octena kiselina - voda (6:1:2). Detektor - sumporna kiselina na UV (254 nm) - flavonoidne mrlje lila boja na zelenoj pozadini.

stol 1

Ukupan sadržaj flavonoida u sirovinama (trava) raznih vrsta kina (u%, u odnosu na apsolutno suhu masu)

Riža. Slika 1. TLC sastava flavonoida odabranih vrsta roda Chin. C - količina svjedoka flavonoida: ononin - Rf 0,28; rutina - R 0,48; luteolin-glukozid - Rf 0,58; formononetin - Rf 0,64; kvercetin - Rf0,79: luteolin - Rf 0,82; biokanin A - Rf 0,85; apigenin - Rf 0,92.

Riža. Slika 2. TLC flavonoida livadne trave u različitim fazama vegetacije. IIa - faza cvatnje; IIb - faza plodonošenja: IIc - faza vegetacije prije cvatnje. C - količina svjedoka flavonoida: ononin - Rf f 0,28; rutina - Rf 0,48; luteolin-glukozid - Rf 0,58; formononetin - Rf 0,64; kvercetin - Rf 0,79; luteolin - R ( 0,82; biokanin A - Rf 0,85; apigenin - Rf 0,92.

Proučavanjem flavonoidnog sastava II u različitim fazama vegetacije uočeno je da su u ekstraktu osim rutina i kvercetina prisutni u značajnoj količini ononin i formononetin. Ostali flavonoidi pronađeni su u tragovima.

Tako je pokazano da se u različitim vrstama bradavice, u različitim fazama vegetacije, nalaze i glikozidi i aglikoni - ononin, rutin, luteolin-glukozid i njihovi aglikoni: formononetin, kvercetin i luteolin, a njihov sastav varira ovisno o vrsta biljke, te u jednu biljku (rang livada) ovisno o fazi vegetacije.

tablica 2

Kvantitativni sadržaj glavnih flavonoida u pojedinim predstavnicima roda chiny (u %, u smislu apsolutno suhe težine)

U II su i ononin i formononetin pronađeni u vegetativnom razdoblju. U razdoblju cvatnje i plodonošenja količina ononina primjetno opada, a povećava se količina formononetina.

Kvantitativni sadržaj glavnih flavonoida u ispitivanim uzorcima određen je kvantitativnom TLC pod istim uvjetima. Rezultati ovog istraživanja prikazani su u tablici. 2.

Kako proizlazi iz podataka u tablici. 2, različite vrste Podbradak je bogat izvor bloflavonoida, zbog čega ove biljke pokazuju jednu od vrsta biološke aktivnosti.

Zaključak:

Jedna od važnih zadaća suvremene kemije je pouzdana i točna analiza organskih tvari, često sličnih po strukturi i svojstvima. Bez toga je nemoguće provesti kemijske, biokemijske i medicinsko istraživanje Na tome se velikim dijelom temelje ekološke metode analize okoliša, forenzička ispitivanja, kao i kemijska, naftna, plinska, prehrambena, medicinska industrija i mnogi drugi sektori nacionalnog gospodarstva. Ovdje je dan samo mali dio metoda i tehnika tankoslojne kromatografije. Ali kao što možete vidjeti iz ove male, tankoslojne kromatografije ima značajne i ozbiljne mogućnosti, u kombinaciji s praktičnošću i jednostavnošću.