Tuy nhiên, một phiên bản khí đốt của TLC cũng đã được thực hiện. Hạt mịn, Al 2 O 3, và những loại khác được sử dụng làm hạt mịn, được phủ bằng thủy tinh, giấy bạc hoặc tấm; để sửa lớp được sử dụng, hoặc những lớp khác. Prom-Stu sản xuất các tấm làm sẵn với một lớp đã được cố định. Các chất rửa giải thường là hỗn hợp của org. dung dịch, dung dịch nước, to-t, tạo phức, v.v. in-in. Tùy thuộc vào sự lựa chọn của sắc ký hệ thống (thành phần của pha động và pha tĩnh) trong tách biệt trong chủ yếu các quy trình có thể đóng một vai trò nào đó. Trong thực tế, một số thường được thực hiện đồng thời. các cơ chế phân tách.

Tùy thuộc vào vị trí của tấm và hướng của dòng chất rửa giải, TLC tăng dần, giảm dần và ngang được phân biệt. Theo kỹ thuật làm việc, phân tích trực diện được phân biệt (khi hỗn hợp được phân tích đóng vai trò là pha động) và biến thể rửa giải thường được sử dụng. Cũng được sử dụng là TLC "tròn" (khi dung dịch phân tích và dung môi được đưa tuần tự vào tâm đĩa) và TLC "ngược chiều" (khi dung dịch đã phân tích được áp dụng xung quanh chu vi và dung dịch rửa giải di chuyển từ ngoại vi vào tâm của tấm), TLC dưới (khi p-dung môi dưới được đi qua một lớp được phủ bằng vật liệu ép chặt), cũng như TLC trong các điều kiện của một gradient của t-ry, thành phần, v.v. Trong cái gọi là. sắc ký TLC hai chiều. quá trình được thực hiện tuần tự theo hai hướng vuông góc với nhau có sự phân hủy. chất rửa giải, làm tăng hiệu quả phân tách. Với cùng mục đích, nhiều lần rửa giải theo một hướng được sử dụng.

Trong biến thể rửa giải, các giọt (1-5 μl) dung dịch đã phân tích được nhỏ lên lớp và mép của bản được nhúng vào dung dịch rửa giải, nằm ở đáy của một buồng thủy tinh kín. Chất rửa giải di chuyển dọc theo lớp dưới tác dụng của lực mao dẫn và lực hấp dẫn; hỗn hợp được phân tích chuyển động cùng chiều. Là kết quả của sự lặp lại nhiều lần và phù hợp với hệ số. các phân phối trong phần đã chọn được tách biệt và sắp xếp trên đĩa theo các khu vực riêng biệt.

Sau khi quá trình hoàn thành, đĩa được lấy ra khỏi buồng, các khu vực được làm khô và tách biệt được tìm thấy riêng của chúng. nhuộm màu hoặc sau khi phun chúng với các dung dịch tạo thành các đốm màu hoặc huỳnh quangvới các thành phần của hỗn hợp được tách ra. Các chất phóng xạ được phát hiện tự động (bằng cách tiếp xúc với một tấm chồng lên một tấm). Cũng được áp dụng. và các phương pháp phát hiện tích cực. Hình ảnh kết quả của sự phân bố của sắc ký. khu vực được gọi là sắc ký đồ (xem Hình.).

Sắc ký đồ thu được bằng cách tách hỗn hợp ba thành phần theo phương pháp lớp mỏng.

Vị trí của sắc ký Các vùng trên sắc ký đồ được đặc trưng bởi giá trị của R f - tỷ số của đường đi ngang qua tâm của vùng của thành phần thứ i từ vạch bắt đầu đến đường l đi qua bởi chất rửa giải: R f = l i / l; R f 1. Giá trị của R f phụ thuộc vào hệ số. phân phối () và tỷ lệ thể tích của pha động và pha tĩnh.

Sự phân tách trong TLC bị ảnh hưởng bởi một số yếu tố - thành phần và đặc tính của dung dịch rửa giải, bản chất và t-ra, kích thước và độ dày của lớp, kích thước của khoang. Vì vậy, để có được kết quả tái lập, cần phải chuẩn hóa cẩn thận các điều kiện thí nghiệm. Việc tuân thủ yêu cầu này cho phép bạn thiết lập R f tương đối. độ lệch chuẩn 0,03. Trong điều kiện tiêu chuẩn, R f là hằng số đối với một in-va nhất định và được sử dụng cho điều kiện sau.

Số lượng thành phần trong sắc ký. vùng được xác định trực tiếp trên lớp theo diện tích của \ u200b \ u200 vùng đó (thường đường kính của nó thay đổi từ 3 đến 10 mm) hoặc cường độ màu của nó (). Cũng sử dụng tự động dụng cụ quét để đo sự hấp thụ, truyền hoặc phản xạ ánh sáng, hoặc sắc ký. các khu vực. Các vùng phân tách có thể được cạo ra khỏi tấm cùng với lớp, thành phần có thể được chiết xuất vào dung môi và phân tích bằng phương pháp thích hợp (huỳnh quang, hấp thụ nguyên tử, huỳnh quang nguyên tử, phân tích đo bức xạ, v.v.). Sai số của phép xác định định lượng thường là 5-10%; giới hạn phát hiện trong các vùng -10 -3 -10 -2 μg (đối với các dẫn xuất có màu) và 10 -10 -10 -9 μg (sử dụng).

Ưu điểm của TLC: đơn giản, hiệu quả về chi phí, tính sẵn có của thiết bị, nhanh chóng (thời gian tách 10-100 phút), hiệu suất và hiệu suất tách cao, kết quả tách rõ ràng, dễ phát hiện sắc ký. các khu vực.

TLC được sử dụng để tách và phân tích cả tổ chức và inorg. in-in: gần như tất cả inorg.

Sắc ký trong hóa học hiện đại

Một trong những nhiệm vụ quan trọng của hóa học hiện đại là phân tích chính xác và đáng tin cậy chất hữu cơ, thường giống nhau về cấu trúc và tính chất. Nếu không có điều này, không thể tiến hành nghiên cứu hóa học, sinh hóa và y học, điều này phần lớn dựa trên phương pháp sinh thái phân tích môi trường, giám định pháp y, cũng như các ngành công nghiệp hóa chất, dầu khí, thực phẩm, y tế và nhiều lĩnh vực khác của nền kinh tế quốc dân.

Một trong những phương pháp nhạy cảm nhất là phân tích sắc ký, do nhà khoa học Nga M.S. Tsvet đề xuất lần đầu tiên vào đầu thế kỷ 20. và đến cuối thế kỷ này, nó đã trở thành một công cụ mạnh mẽ mà nếu không có nó, cả nhà tổng hợp và hóa học làm việc trong các lĩnh vực khác đều không thể làm được nữa.

Tách màu được thực hiện trong cột được hiển thị trong hình. 1. Hỗn hợp các chất A, B và C - chất màu tự nhiên, ban đầu nằm ở vùng e,- được phân tách bằng cách thêm dung môi thích hợp D (chất rửa giải) vào các vùng riêng biệt.

Như mọi khi, mọi chuyện dường như bắt đầu, từ điều đơn giản nhất mà bất kỳ cậu học sinh nào cũng có thể làm được. Những năm trước, các em học sinh, trong đó có tác giả của bài báo này, đã viết bằng mực. Và nếu miếng thấm rơi trên vết mực, thì người ta có thể nhận thấy rằng dung dịch mực được chia thành nhiều “mặt trận” trên đó. Sắc ký dựa trên sự phân bố của một trong một số chất giữa hai, như người ta nói, các pha (ví dụ, giữa chất rắn và khí, giữa hai chất lỏng, v.v.), và một trong các pha chuyển động liên tục, tức là nó di động.

Điều này có nghĩa là một pha như vậy, ví dụ, một chất khí hoặc một chất lỏng, liên tục tiến lên, phá vỡ trạng thái cân bằng. Hơn nữa, chất này hoặc chất đó được hấp thụ (hấp thụ) hoặc hòa tan trong pha tĩnh càng tốt thì tốc độ chuyển động của nó càng chậm và ngược lại, hợp chất càng ít bị hấp thụ, tức là có ái lực thấp hơn với pha tĩnh, thì càng lớn tốc độ di chuyển. Kết quả là, như trong Hình. 2, nếu ban đầu chúng ta có một hỗn hợp các hợp chất, sau đó dần dần tất cả chúng, được đẩy bởi pha động, di chuyển đến “kết thúc” với các tốc độ khác nhau và cuối cùng tách ra.

Cơm. 2. Nguyên tắc cơ bản của quá trình tách sắc ký: NF là lớp pha tĩnh bao phủ bề mặt bên trong của ống mao dẫn T, qua đó pha động (MP) chảy qua. Thành phần A 1 của hỗn hợp được tách ra có ái lực cao với pha động và thành phần A 2 - đối với pha tĩnh. A "1 và A" 2 là vị trí của các vùng của các thành phần giống nhau sau một khoảng thời gian mà sự phân tách sắc ký xảy ra theo hướng được chỉ ra bởi mũi tên

Trong thực tế, một mẫu hỗn hợp các chất được tiêm, ví dụ, bằng ống tiêm, vào lớp của pha tĩnh, và sau đó các hợp chất khác nhau tạo nên hỗn hợp, cùng với pha động (chất rửa giải), di chuyển theo. lớp, được thúc đẩy bởi giai đoạn này. Tốc độ di chuyển phụ thuộc vào lượng tương tác (ái lực) của các thành phần trong pha tĩnh và pha động, và kết quả là đạt được sự phân tách các thành phần.

Sau khi tách, tất cả các thành phần phải được xác định và định lượng. Đây là sơ đồ chung của sắc ký.

Cần lưu ý rằng phương pháp hiện đại này cho phép xác định hàm lượng của hàng chục và hàng trăm hợp chất khác nhau trong một hỗn hợp trong vòng vài phút, ngay cả với lượng “vết” không đáng kể, ~ 10–8%.

Chúng ta hãy xem xét chi tiết hơn phương pháp phân tích sắc ký. Hệ thống sắc ký có thể được phân chia theo các nguyên tắc sau:

- trạng thái tập hợp của pha động và pha tĩnh;
- đặc điểm hình học của hệ thống;
- cơ chế tương tác giữa chất được tách ra và các pha.

Một chất khí hoặc chất lỏng được sử dụng làm pha động. Chất rắn hoặc chất lỏng được sử dụng làm pha tĩnh, hoặc pha tĩnh.

Theo sự sắp xếp của các pha, hệ thống sắc ký được chia thành hai nhóm: phẳng và cột.

Sau đó, lần lượt, được chia thành:

- được đóng gói, chứa đầy vật liệu rắn dạng hạt (quả bóng nhỏ), là môi trường phân tách hoặc đóng vai trò là chất mang pha lỏng tĩnh;
- mao quản, các bức tường bên trong được bao phủ bởi một lớp màng chất lỏng bất động hoặc một lớp chất hấp phụ rắn (chất hấp thụ).

Tương tác giữa chất cần tách và các pha của hệ thống sắc ký có thể được thực hiện trên bề mặt của pha hoặc trong thể tích. Trong trường hợp đầu tiên, sắc ký được gọi là sự hấp phụ, trong giây phân bổ.

Các cơ chế phân tách của các phân tử trong hệ thống sắc ký thường được rút gọn như sau:

- pha tĩnh hấp thụ một cách vật lý (sorbs) các chất được tách ra;
- pha tĩnh tương tác hóa học với các chất được tách ra;
- pha tĩnh hòa tan các chất cần tách ra khỏi dung dịch trong dung môi không hòa tan;
- pha tĩnh có cấu trúc xốp, cản trở sự khuếch tán của các phân tử của các chất cần tách ra trong pha này.

Sắc ký, vốn bắt đầu với các thiết bị tự tạo như dải giấy nhúng trong dung môi, giờ đây được thể hiện bằng các hệ thống thiết bị phức tạp nhất dựa trên các nguyên tắc chính xác hoặc chính xác hiện đại và được trang bị phần mềm máy tính. Chỉ cần nói rằng một trong những hãng máy tính tốt nhất, Hewlett-Packard, đồng thời sản xuất máy sắc ký hiện đại.

Về bản chất, sơ đồ của quy trình sắc ký rất đơn giản và được trình bày trong Hình. 3. Ngoài ra, gần như trong trình tự này, nguyên tắc hoạt động của máy sắc ký sẽ được xem xét.

Các loại sắc ký chính

Các loại sắc ký chính bao gồm sắc ký hấp phụ, trao đổi ion, chất lỏng, giấy, lớp mỏng, lọc gel và sắc ký ái lực.

Sắc ký hấp phụ. Trong trường hợp này, sự phân tách các chất được thực hiện do sự hấp phụ có chọn lọc (chọn lọc) các chất trên pha tĩnh. Sự hấp phụ chọn lọc như vậy là do ái lực của một hoặc một hợp chất khác đối với chất hấp phụ rắn (pha tĩnh), và điều này, đến lượt nó, được xác định bởi các tương tác có cực của các phân tử của chúng. Vì vậy, sắc ký kiểu này thường được sử dụng trong phân tích các hợp chất mà tính chất của chúng được xác định bởi số lượng và kiểu nhóm phân cực. Sắc ký hấp phụ bao gồm sắc ký hấp phụ trao đổi ion, lỏng, giấy, lớp mỏng và khí. Phương pháp sắc ký hấp phụ khí được mô tả chi tiết hơn trong phần Phân tích chất rửa giải.

Sắc kí trao đổi ion.được sử dụng như pha tĩnh. nhựa trao đổi ion(Hình 4) cả ở dạng cột và ở dạng một lớp mỏng trên đĩa hoặc giấy. Sự phân tách thường được thực hiện trong môi trường nước, vì vậy phương pháp này được sử dụng chủ yếu trong hóa học vô cơ, mặc dù dung môi hỗn hợp cũng được sử dụng. Động lực của sự phân tách trong trường hợp này là ái lực khác nhau của các ion được phân tách trong dung dịch với các trung tâm trao đổi ion có cực tính trái ngược nhau trong pha tĩnh.

sắc ký lỏng. Trong trường hợp này, pha tĩnh là chất lỏng. Trường hợp phổ biến nhất là phiên bản hấp phụ của sắc ký cột lỏng. Một ví dụ về sự tách biệt của các sắc tố tự nhiên được trình bày trong hình. 5.

Cơm. 5. Sắc ký tách các chất màu tự nhiên (flavon và isoflavone)

Sắc ký giấy. Các dải hoặc tờ giấy được sử dụng làm pha tĩnh (Hình 6). Sự phân tách xảy ra theo cơ chế hấp phụ, và đôi khi nó được thực hiện theo hai hướng vuông góc.

Sắc ký lớp mỏng là một hệ thống bất kỳ trong đó pha tĩnh là một lớp mỏng, cụ thể là một lớp alumin (dày 2 mm) ở dạng hồ lắng đọng trên một tấm thủy tinh. Ví dụ về một hệ thống như vậy và kết quả phân tách được thể hiện trong Hình. 7.

Lọc gel, hoặc rây phân tử, sắc ký. Nguyên tắc phân tách trong các hệ thống như vậy có phần khác so với các trường hợp trước đây. Pha tĩnh là các vật liệu, thường là gel, có độ xốp được kiểm soát chặt chẽ, do đó một số thành phần của hỗn hợp, phù hợp với kích thước và hình dạng của phân tử, có thể thâm nhập vào giữa các hạt gel, trong khi các thành phần khác không thể. Thông thường, loại sắc ký này được sử dụng để tách các hợp chất cao phân tử. Một trong những ứng dụng của phương pháp này là xác định khối lượng phân tử của các chất cần tách ra, thường cần thiết cho các nghiên cứu hóa học (Hình 8).

sắc ký ái lực. Loại sắc ký này dựa trên sự tương tác giữa một chất, một mặt, có khả năng phản ứng với hợp chất cô lập, mặt khác, liên kết với chất mang rắn của pha tĩnh. Một chất như vậy có ái lực với hợp chất cô lập và được gọi là phối tử ái lực.

Thông thường, phương pháp này được sử dụng trong phân tích sinh hóa. Ví dụ, khi các đối tượng kháng nguyên sinh học có chứa protein được đưa qua xenlulo được kích hoạt bằng cyanogen bromide, chúng sẽ được giữ lại một cách cụ thể, như được trình bày trong Sơ đồ 1.

Theo một phương pháp khác, để gắn protein vào nhóm hydroxyl của xenlulo, trước tiên người ta xử lý chất sau bằng 2-amino-4,6-dichloro- Sim-triazine, và sau đó sản phẩm của sự tương tác của chúng phản ứng với nhóm amin của protein theo sơ đồ 2:

Tất nhiên, số lượng phương pháp sắc ký không giới hạn đối với những phương pháp được liệt kê ở trên. Sắc ký thường được kết hợp với các phương pháp hóa lý khác, chẳng hạn như phương pháp khối phổ, nhưng bài viết này chỉ nhằm mục đích giúp người đọc làm quen với các nguyên tắc chung của sắc ký. Vì vậy, chúng tôi sẽ xem xét kỹ hơn việc xử lý kết quả sắc ký.

Phương pháp phát triển sắc ký đồ

Quá trình phát triển là quá trình chuyển các chất được phân tách bởi pha động. Việc phát triển có thể được thực hiện theo ba cách chính: phân tích trực diện, dịch chuyển và rửa giải. Rửa giải được sử dụng rộng rãi nhất.

Phân tích trực diện. Đây là trường hợp đơn giản nhất, vì ở đây mẫu đóng vai trò là pha động. Nó liên tục được thêm vào hệ thống, do đó cần có khối lượng mẫu lớn. Các kết quả được hiển thị trong hình. chín.

Sự hình thành một số vùng là do ái lực khác nhau của các thành phần khác nhau đối với pha tĩnh. Lưỡi cắt được gọi là mặt trước, do đó có tên như vậy. Vùng thứ nhất chỉ chứa chất A ít được giữ lại nhất, chất chuyển động nhanh nhất. Vùng thứ hai chứa chất A và B. Vùng thứ ba là hỗn hợp các chất A, B và C. Trong phép phân tích phía trước, chỉ thu được thành phần A ở thể lỏng.

phân tích chuyển vị. Trong trường hợp này, pha động có ái lực với pha tĩnh lớn hơn chất cần tách. Một mẫu nhỏ được đưa vào pha tĩnh. Nhưng do ái lực cao, pha động sẽ di chuyển và đẩy tất cả các thành phần. Nó thay thế thành phần C bị hấp thụ mạnh nhất, đến lượt nó, nó sẽ thay thế thành phần B, thay thế thành phần A. .

phân tích rửa giải. Pha động để di chuyển chất tan được đưa qua hệ thống sắc ký. Sự phân tách xảy ra do ái lực khác nhau của các thành phần hỗn hợp với pha tĩnh và do đó, do tốc độ chuyển động của chúng khác nhau. Một mẫu thể tích nhỏ được đưa vào hệ thống sắc ký. Kết quả là, các khu vực với các thành phần sẽ dần hình thành các phần riêng biệtđược phân tách bằng dung dịch rửa giải tinh khiết. Do hiệu quả phân tách cao, phương pháp này đã trở nên được sử dụng rộng rãi nhất và đã thay thế phần lớn các phương án phân tách khác. Do đó, chúng tôi sẽ xem xét thêm về lý thuyết và thiết kế phần cứng của phương pháp này.

Một chút lý thuyết. Thường thuận tiện khi coi các quá trình sắc ký là một chuỗi các quá trình chiết; trong trường hợp này, các chất có đặc tính rất giống nhau có thể được tách ra, vì hàng trăm, thậm chí hàng nghìn chu kỳ chiết xảy ra nhanh chóng và đồng thời trong quá trình sắc ký.

Để đánh giá hiệu quả của các quá trình sắc ký, dựa trên khái niệm lý thuyết về chưng cất (bằng cách tương tự với quá trình tách dầu trong cột chưng cất, trong đó đĩa lý thuyết tương ứng với phần của cột chưng cất trong đó hơi và lỏng ở trạng thái cân bằng), khái niệm được giới thiệu "chiều cao tương đương với đĩa lý thuyết"(VETT). Vì vậy, cột sắc ký được coi như một tập hợp các lớp (đĩa) giả định. HETP thường được hiểu là độ dày lớp cần thiết để hỗn hợp đến từ lớp trước cân bằng với nồng độ trung bình của chất trong pha động của lớp này. Nó có thể được mô tả bằng công thức sau:

HETT = L/N,

ở đâu L- chiều dài cột, N là số đĩa lý thuyết.

HETP là một đặc điểm tóm tắt về sự phân li của các chất. Tuy nhiên, việc tách các thành phần của hỗn hợp là quan trọng nhưng chưa đủ. Cần phải xác định từng thành phần và xác định lượng của nó trong mẫu. Điều này thường được thực hiện bằng cách xử lý sắc ký đồ - sự phụ thuộc của cường độ tín hiệu, tỷ lệ với nồng độ của chất, vào thời gian tách. Một số ví dụ về sắc ký đồ được trình bày trong hình. 10, 11.

Thời gian kể từ thời điểm mẫu được bơm vào cột cho đến thời điểm đỉnh cực đại được đăng ký được gọi là thời gian lưu (tR). Trong điều kiện tối ưu, nó không phụ thuộc vào lượng mẫu được bơm vào và, có tính đến các thông số hình học của cột, được xác định bởi cấu trúc của một hợp chất cụ thể, tức là nó là một đặc tính định tính của các thành phần. Hàm lượng định lượng của thành phần được đặc trưng bởi độ lớn của pic, chính xác hơn là diện tích của nó. Đếm khu vực cao điểm thường được thực hiện tự động với một thiết bị tích phân ghi lại cả thời gian lưu và diện tích đỉnh. Trang thiết bị hiện đại cho phép bạn có ngay bản in trên máy tính cho biết hàm lượng của tất cả các thành phần của hỗn hợp cần tách.

Công việc của máy sắc ký. Sơ đồ lắp đặt của máy sắc ký khí đơn giản nhất được trình bày trong hình. 12. Nó bao gồm một chai khí chứa pha trơ di động (khí mang), thường là heli, nitơ, argon, v.v ... Sử dụng một bộ giảm tốc làm giảm áp suất khí đến mức cần thiết, khí mang đi vào cột, đó là một ống chứa đầy chất hấp thụ hoặc vật liệu sắc ký khác đóng vai trò của pha tĩnh.

Cơm. 12. Sơ đồ hoạt động của máy sắc ký khí:
1 - bong bóng áp suất cao với khí mang; 2 - bộ ổn định dòng chảy; 3 và 3 "- áp kế; 4 - cột sắc ký; 5 - thiết bị tiêm mẫu; 6 - bộ điều nhiệt; 7 - detector; 8 - bộ ghi; 9 - lưu lượng kế

Cột sắc ký là "trái tim" của máy sắc ký, vì nó nằm trong nó mà các hỗn hợp được tách ra. Cột thường được làm bằng thủy tinh; có thép, teflon, và cả các cột mao dẫn. Một thiết bị bơm mẫu được lắp đặt gần đường dẫn khí vào cột. Thông thường, một mẫu được tiêm bằng ống tiêm, xuyên qua màng cao su. Hỗn hợp phân tích được tách trong cột và đi vào máy dò - thiết bị chuyển kết quả tách thành dạng thuận tiện cho việc đăng ký.

Một trong những thiết bị dò được sử dụng nhiều nhất là katharometer, nguyên lý hoạt động dựa trên việc đo nhiệt dung của các vật thể khác nhau.

Trên hình. 13 cho thấy một sơ đồ của một katharometer. Một cuộn dây kim loại (sợi điện trở) được đặt trong một hốc hình trụ, nó nóng lên do có dòng điện một chiều chạy qua nó. Khi cho một dòng khí chạy qua nó với tốc độ không đổi thì nhiệt độ của cuộn dây không đổi. Tuy nhiên, nếu thành phần của khí thay đổi cùng với sự xuất hiện của chất rửa giải, thì nhiệt độ của cuộn dây thay đổi, điều này được thiết bị ghi lại.

Một máy dò phổ biến khác là máy dò ion hóa ngọn lửa, sơ đồ của nó được thể hiện trong Hình. 14. Nó nhạy hơn nhiều so với katharometer, nhưng yêu cầu cung cấp không chỉ khí mang mà còn cả hydro. Khí mang rời khỏi cột, chứa chất rửa giải, trộn với hydro và đi vào vòi của đầu đốt detector. Ngọn lửa ion hóa các phân tử chất rửa giải, kết quả là điện trở giữa các điện cực giảm và cường độ dòng điện tăng lên.

Trong sắc ký lỏng, máy dò quang phổ được sử dụng (trong vùng nhìn thấy, UV và IR), cũng như máy dò khúc xạ dựa trên việc đo chiết suất của dung dịch.

Đó là trong trong các điều khoản chung những vấn đề cơ bản về phân tích sắc ký. Tất nhiên, bài viết chỉ chứa nguyên tắc chung sắc ký, và thường chúng được dán nhãn đơn giản. Thực tế, “bếp ăn” của phương pháp này khá rộng và phức tạp. mục tiêu chính Bài báo này, theo tác giả, nhằm thu hút sự chú ý của độc giả trẻ đến phương pháp mạnh mẽ này.

Những ai muốn tìm hiểu thêm về lĩnh vực này có thể sử dụng tài liệu dưới đây.

Văn chương

Zhukhovitsky A.A., Turkeltaub N.M. Sắc ký khí. M.: Gostoptekhizdat, 1962, 240 tr;
Sakodynsky K.I., Kiselev A.V., Iogansen A.V. và vân vân. Ứng dụng hóa lý sắc ký khí. M.: Hóa học, 1973,
254 tr .;
Sắc ký cột lỏng. Trong 3 tập. Ed. Z. Deyla, K. Maceka, J. Janaka. Matxcova: Mir, 1972;
Berezkin V.G., Alishoev V.R., Nemirovskaya I.B.. Sắc ký khí trong hóa học polyme. M.: Nauka, 1972, 287 tr;
Morozov A.A. Sắc ký trong phân tích chất vô cơ. M.: Cao hơn. trường học, 1972, 233 tr .;
Berezkin V.G., Bochkov A.S.. Định lượng sắc ký lớp mỏng. M.: Nauka, 1980, 183 tr;
Hướng dẫn phòng thí nghiệm về sắc ký và các phương pháp liên quan. Trong 2 tập. Ed. O. Mikesh. Matxcova: Mir, 1982, tập 1–2, 783 trang;
Phân tích sắc ký của môi trường. Ed. R. Quan tài. M.: Mir, 1979, 606 tr .;
Kirchner Yu. Sắc ký lớp mỏng. Trong 2 quyển M.: Mir, 1981, quyển 1, 615 trang, quyển 2, 523 trang;
Sắc ký chiết. Ed. T.Brown, G.Gersini. M.: Mir, 1978, 627 tr.

V.V. Safonov,
giáo sư Moscow
nhà nước dệt may
học viện. A.N. Kosygina

MZRF

FESMU

Khoa Đại cương, Vật lý và Hóa học keo

trừu tượng

Sắc ký lớp mỏng. Ứng dụng trong dược phẩm

Hoàn thành bởi: sinh viên nhóm 201-F

Danilov D.I.

Kiểm tra bởi: Nemov V.A.

Khabarovsk, 2005

KẾ HOẠCH:

Giới thiệu

Cơ sở vật lý và hóa học của TLC

Sắc ký phân vùng trên giấy

Cơ bản về sắc ký lớp mỏng

• chất hấp phụ
• dung môi
• chuẩn bị đĩa
• kỹ thuật ứng dụng giải pháp thử nghiệm

Sắc ký

Các tấm làm khô.

Xác định các chất được tách ra

Ứng dụng của phương pháp TLC trong dược phẩm

• Định lượng saponin triterpene bằng HPTLC sử dụng phép đo mật độ quét
• Nghiên cứu thành phần lipid và flavonoid của mẫu một số loài thuộc chi Chin (Lathyrus.)

Sự kết luận

Văn chương

Giới thiệu

Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC, TLC) là một trong những phương pháp phân tích sắc ký được sử dụng nhiều nhất, nhưng lại ít phổ biến nhất.
Bất chấp những thiếu sót đáng kể tồn tại cho đến gần đây, nó vẫn được sử dụng rộng rãi cho phân tích định tính hỗn hợp, chủ yếu là do giá rẻ và tốc độ thu được kết quả. Sắc ký lớp mỏng (TLC) ban đầu được phát triển để tách lipid. Mặc dù sắc ký giấy nhanh hơn sắc ký cột, nhưng nó có nhược điểm là giấy chỉ có thể được làm từ vật liệu gốc xenluloza nên không thích hợp để tách các chất không phân cực. Sắc ký lớp mỏng giữ lại tất cả các ưu điểm của sắc ký giấy, nhưng cho phép sử dụng bất kỳ vật liệu nào có thể được nghiền mịn và sau đó thu được một lớp đồng nhất. Nó có thể chất vô cơ, chẳng hạn như silica gel, alumin, đất tảo cát và magie silicat, cũng như các chất hữu cơ, cụ thể là xenlulo, polyamit và bột polyetylen.

Cơ sở vật lý và hóa học của sắc ký lớp mỏng.

Cơ sở của sắc ký lớp mỏng là phương pháp hấp phụ, mặc dù sắc ký phân vùng cũng được tìm thấy.
Phương pháp hấp phụ dựa trên sự khác biệt về mức độ hấp phụ-giải hấp của các thành phần được phân tách trên pha tĩnh. Sự hấp phụ được thực hiện do lực van der Waals, là cơ sở của sự hấp phụ vật lý, đa phân tử (hình thành một số lớp chất hấp phụ trên bề mặt chất hấp phụ) và sự hấp phụ hóa học (tương tác hóa học của chất hấp phụ và chất bị hấp phụ).
Để các quá trình giải hấp hấp phụ hiệu quả, cần Quảng trường lớn, đặt ra các yêu cầu nhất định đối với chất hấp phụ. Tại bề mặt lớn tách pha là sự thiết lập nhanh chóng trạng thái cân bằng giữa các pha của các thành phần của hỗn hợp và sự phân tách hiệu quả.
Một loại sắc ký lớp mỏng khác được sử dụng trong sắc ký lớp mỏng là sắc ký lỏng phân vùng.
Trong sắc ký phân vùng, cả hai pha - động và tĩnh - đều là chất lỏng không trộn lẫn với nhau. Sự phân tách các chất dựa trên sự khác biệt về hệ số phân bố của chúng giữa các pha này.
Lần đầu tiên phương pháp sắc ký lớp mỏng tự tuyên bố là "Sắc ký lớp mỏng trên giấy", dựa trên phương pháp phân vùng để tách các thành phần.

Sắc ký phân vùng trên giấy.

Do giấy sắc ký được sử dụng trong phương pháp này (loại giấy lọc đặc biệt) có chứa nước (20-22%) trong các lỗ xốp nên dung môi hữu cơ được sử dụng như pha còn lại.
Việc sử dụng sắc ký trên giấy có một số nhược điểm đáng kể: sự phụ thuộc của quá trình phân tách vào thành phần và tính chất của giấy, sự thay đổi hàm lượng nước trong các lỗ xốp của giấy với sự thay đổi điều kiện bảo quản, sắc ký rất thấp. tốc độ (lên đến vài ngày) và khả năng tái tạo kết quả thấp. Những thiếu sót này ảnh hưởng nghiêm trọng đến sự phổ biến của sắc ký giấy với tư cách là một phương pháp sắc ký.
Do đó, sự xuất hiện của sắc ký trong một lớp mỏng của chất hấp thụ, tức là sắc ký lớp mỏng, có thể được coi là tự nhiên.

Cơ bản về sắc ký lớp mỏng.

Trong phương pháp TLC, quá trình sắc ký của các chất xảy ra trong một lớp mỏng của chất hấp thụ lắng đọng trên một nền phẳng rắn. Sự phân tách trong phương pháp này chủ yếu xảy ra trên cơ sở giải hấp phụ.
Việc sử dụng các chất hấp thụ khác nhau làm cho phương pháp này có thể mở rộng và cải tiến đáng kể.
Khi bắt đầu xuất hiện phương pháp này, các tấm phải được chế tạo độc lập. Nhưng ngày nay, các tấm đúc sẵn được sử dụng chủ yếu, có phạm vi khá rộng cả về kích thước, chất mang và chất nền.
Một tấm sắc ký hiện đại là một cơ sở được làm bằng thủy tinh, nhôm hoặc polyme (ví dụ, polyterephthalate). Do thực tế là đế thủy tinh ngày càng ít phổ biến (nó thường bị vỡ, không thể chia tấm thành nhiều phần mà không làm hỏng lớp hấp thụ, trọng lượng nặng), các tấm dựa trên lá nhôm hoặc polyme được sử dụng rộng rãi nhất.
Để cố định chất hấp thụ, thạch cao, tinh bột, silicasol, v.v. được sử dụng để giữ các hạt chất hấp thụ trên bề mặt. Độ dày của lớp có thể khác nhau (100 micron trở lên), nhưng tiêu chí quan trọng nhất là lớp phải có độ dày đồng đều ở bất kỳ vị trí nào trên bản sắc ký.

Chất hấp thụ

Chất hấp thụ phổ biến nhất là silica gel.
Silica gel là một axit silicic ngậm nước được tạo thành do tác dụng của axit khoáng với natri silicat và làm khô sol tạo thành. Sau khi nghiền sol, một phần nhỏ của kích thước hạt nhất định được sử dụng (ghi trên đĩa, thường là 5-20 micron).
Silica gel là một chất hấp thụ phân cực, trong đó các nhóm -OH đóng vai trò là trung tâm hoạt động. Nó dễ dàng hút nước trên bề mặt và hình thành liên kết hydro.
Alumina. Alumina là một chất hấp phụ bazơ yếu và chủ yếu được sử dụng để tách các hợp chất trung tính và bazơ yếu. Nhược điểm của các tấm trên nhôm oxit là bắt buộc phải kích hoạt bề mặt trước khi sử dụng trong tủ sấy khi nhiệt độ cao(100-150 0 C) và khả năng hấp phụ của lớp thấp so với silica gel.
Đất tảo cát là chất hấp phụ thu được từ các khoáng chất tự nhiên: đất tảo cát. Chất hấp thụ có đặc tính ưa nước, nhưng khả năng hấp phụ của lớp thấp hơn so với silica gel.
Magie silicat ít phân cực hơn silica gel và thường được sử dụng khi các chất hấp phụ phân cực nhiều hơn không cho hiệu quả phân tách.
Xenlulo - các tấm phủ xenlulo lớp mỏng rất hiệu quả trong việc phân tách các phân tử hữu cơ phức tạp. Chất hấp phụ chủ yếu là các quả cầu xenluloza có đường kính đến 50 micron, được cố định trên chất mang bằng tinh bột. Nhưng cũng như trong sắc ký giấy, sự nổi lên của mặt trước dung môi rất chậm.
Trong các đĩa sắc ký trao đổi ion, nhựa trao đổi ion có chứa amoni bậc bốn hoặc các nhóm sulfo hoạt động tham gia vào quá trình trao đổi ion được sử dụng như một chất hấp phụ. Sắc ký lớp mỏng với loại bản này được thực hiện với pha động có chứa axit hoặc kiềm mạnh. Các tấm này có tác dụng phân tách các hợp chất cao phân tử và lưỡng tính.

Các chất hấp thụ trên là phổ biến nhất, nhưng ngoài những chất này, có nhiều chất được sử dụng làm chất hấp thụ. Đó là bột talc, canxi sunfat, tinh bột, v.v.
Đồng thời, ngay cả các chất hấp thụ đã được đề cập cũng có thể được sửa đổi để tạo cho chúng các đặc tính hấp phụ mới (ngâm tẩm chất hấp thụ bằng thuốc thử, ví dụ, AgNO 3, tạo ra các đĩa có pha đảo ngược). Chính sự đa dạng của các pha có thể với chi phí tối thiểu đã làm cho nó có thể sử dụng TLC để sắc ký một số lượng lớn các chất.

Dung môi

Trong sắc ký lớp mỏng, các chất tinh khiết (etyl axetat, benzen, v.v.) hoặc hỗn hợp các chất (hệ) theo một tỷ lệ nhất định được sử dụng làm pha động.
Việc lựa chọn pha động (hệ thống) được thực hiện theo các quy tắc sau:

· Chọn một hệ thống trong đó các thành phần cần tách có độ tan thấp (nếu độ tan của chất cao thì các chất sẽ chuyển động theo phía trước, nếu độ tan thấp thì ở đầu vẫn giữ nguyên). Với sắc ký phân vùng hoặc khi sử dụng các pha đảo ngược, độ hòa tan của các chất trong pha động phải cao hơn trong pha tĩnh.

· Thành phần của hệ thống phải không đổi và dễ tái lập.

· Các thành phần dung môi hoặc hệ thống không được độc hoặc thiếu.

· Hệ thống phải tách biệt hoàn toàn các chất có cấu trúc tương tự và sự khác biệt về Rf ít nhất phải bằng 0,05.

· Hệ thống không được gây ra các biến đổi hóa học trong các thành phần được phân tách.

Trong hệ thống đã chọn, chất phân tích phải có ý nghĩa khác nhau Rf và phân bố trên toàn bộ chiều dài của sắc ký đồ. Điều mong muốn là các giá trị Rf nằm trong khoảng 0,05-0,85.

· Khi chọn một hệ thống, bản chất của các chất được tách ra cũng phải được tính đến. Vì vậy khi sắc ký các chất có tính bazơ thì hệ không được có tính axit và ngược lại.

Chuẩn bị đĩa

Khi sử dụng các đĩa đã mua, trước tiên chúng phải được chuẩn bị cho quá trình sắc ký. Điều này là do thực tế là trong quá trình bảo quản, chất hấp phụ dạng tấm không chỉ hấp thụ hơi ẩm mà còn cả các chất khác có trong không khí. Khi sử dụng các đĩa không chuẩn bị trong quá trình sắc ký, mặt trước “bụi bẩn” xuất hiện, có thể cản trở việc xác định các chất có giá trị Rf lớn và một số chất, chẳng hạn như nước, có thể thay đổi thành phần của pha động, do đó thay đổi các giá trị Rf thu được. .
Chuẩn bị sơ bộ đĩa bao gồm phân tán đĩa bằng dung môi tinh khiết đến toàn bộ chiều cao của đĩa (metanol, benzen, dietyl ete), sau đó làm khô đĩa trong tủ sấy ở nhiệt độ 110-120 0C trong 0,5-1 giờ. Bằng cách này, nhiều đĩa có thể được chuẩn bị cùng một lúc và khi được bảo quản ở nơi khô ráo, đậy kín, chúng sẽ giữ được các đặc tính của chúng trong vài tháng.

Kỹ thuật áp dụng các giải pháp thử nghiệm.

Hóa ra, việc áp dụng chất thử không phải là một hoạt động phức tạp như vậy, nhưng đồng thời, nó ảnh hưởng rất nhiều đến kết quả sắc ký.
Thông thường, chất phân tích lỏng hoặc dung dịch chất rắn được kiểm tra mà không cần chuẩn bị trước mẫu nào.
Vì vậy, luôn cần nhớ một số điểm ảnh hưởng nghiêm trọng đến kết quả phân tách.
Quan trọng nhất là nồng độ của các chất được áp dụng. Trong TLC, thông thường áp dụng nồng độ các dung dịch khoảng 1%. Nhưng mặt khác, độ nhạy của phương pháp cho phép bạn xác định các chất có nồng độ thấp hơn nhiều.
Nếu chưa biết tổng nồng độ của các thành phần trong chất thử, hoặc đã biết nồng độ nhưng loại chất này chưa được sắc ký thì phải xác định lượng dung dịch thử là đủ để sắc ký chất lượng cao. Có một số phương pháp để xác định điều này.
Đầu tiên, bạn cần bôi một số vết dung dịch sắc ký, có kích thước bằng nhau, nhưng với lượng khác nhau (ví dụ, 1, 2, 5 µl) và sau khi sắc ký, hãy nghiên cứu hình dạng và kích thước của các vết đã phân tách.
Vì vậy, với một nồng độ được lựa chọn thích hợp, hình dạng của các chất được tách ra giống như hình dạng áp dụng cho vạch xuất phát. Nếu các vết tách ra lớn hơn vết lúc bắt đầu thì có nghĩa là nồng độ được sử dụng quá cao. Sự xuất hiện của các "đuôi", hình dạng bất thường của các vết tách biệt trên đĩa, cũng có thể cho thấy nồng độ cao, nhưng có thể do hệ thống sắc ký được chọn không chính xác hoặc do tương tác hóa học của các thành phần được phân tách.
Bằng cách chọn lượng chất lắng đọng và hệ thống dung môi, có thể đạt được sự phân tách hoàn toàn trên một đĩa chứa tối đa mười thành phần trong các chất được nghiên cứu. Nó là thuận tiện để áp dụng các mẫu trên một bàn đặc biệt với giấy nến và sưởi ấm. Chấm được thực hiện trên "vạch xuất phát" cách mép dưới của đĩa 1 - 2 cm. Điều này là cần thiết để khi hạ đĩa xuống hệ thống, các mẫu không bị hòa tan trong đó, và tất cả các chất lắng đọng được đưa vào sắc ký.
Việc áp dụng các giải pháp được thực hiện bằng ống tiêm nhỏ hoặc các mao quản chia độ. Kích thước của vết bôi không được vượt quá 4 mm. Điều này là do thực tế là với kích thước vết lớn hơn, sự thay đổi hình dạng xảy ra dưới tác động của các lực vật lý và ranh giới của các thành phần tách biệt có thể chồng lên nhau.
Việc áp dụng các chất thử nghiệm vào các đĩa không được kèm theo sự phá hủy chất hấp thụ (có ảnh hưởng khá mạnh đến chất lượng của quá trình phân tách), do đó, giọt chất thử phải được thực hiện bằng cách chạm kim hoặc mao quản vào lớp chất hấp thụ, và không phải bằng cách nhấn. Kích thước của vết tạo thành không chỉ bị ảnh hưởng bởi lượng dung dịch được đưa vào, mà còn bởi độ phân cực của dung môi và điểm sôi của nó. Vì vậy, khi áp dụng cùng một chất trong các dung môi khác nhau, vết thu được trong đó metanol được sử dụng làm dung môi sẽ lớn hơn vết từ dung dịch cloroform. Mặt khác, khi đun nóng chất nền, sự bay hơi của dung môi sẽ mạnh hơn và kích thước vết cũng giảm.
Tất nhiên, việc sử dụng máy sấy tóc sẽ dễ dàng hơn khi thoa lên các vết bẩn khô, nhưng chỉ khi hoàn toàn tin tưởng rằng các chất được thoa sẽ không bị oxy hóa dưới tác dụng của không khí nóng.
Khoảng cách giữa các điểm được áp dụng nên là khoảng 2 cm.
Đôi khi, trong quá trình sắc ký trên đĩa, một hiệu ứng cạnh được quan sát thấy, do đó các vết không nằm trên cùng một đường thẳng, mà trông giống như móng ngựa hoặc theo đường chéo. Để loại bỏ hiệu ứng này, mỗi điểm có thể được "cung cấp" đường rãnh riêng, tách mẫu được áp dụng khỏi các mẫu khác bằng cách loại bỏ đường hấp thụ. Điều này được thực hiện tốt nhất dưới thước có vật sắc nhọn (chẳng hạn như dao mổ) nhưng hãy cẩn thận để không loại bỏ quá nhiều chất hấp thụ.
Sau khi cho các chất thử lên đĩa, cần phải loại bỏ hoàn toàn dung môi, vì ngay cả một lượng nhỏ dung môi trong chất thử cũng có thể ảnh hưởng đến sự phân tách và thậm chí thay đổi thành phần của hệ sắc ký.
Loại bỏ dung môi thường được thực hiện bằng cách làm khô tự nhiên của bản trong 5-10 phút, bằng cách làm nóng bằng máy sấy tóc hoặc trong lò nướng.

Sắc ký

Sắc ký lớp mỏng có một số phương pháp, chủ yếu liên quan đến kiểu chuyển động của dung môi.

Sắc ký lớp mỏng hướng lên

Sắc ký lớp mỏng hướng xuống

Sắc ký lớp mỏng nằm ngang

· Sắc ký lớp mỏng xuyên tâm.

Sắc ký lớp mỏng ngược dòng

Loại sắc ký này là phổ biến nhất và dựa trên thực tế là mặt trước của hệ thống sắc ký tăng dọc theo tấm dưới tác dụng của lực mao quản, tức là. mặt trước của hệ thống sắc ký chuyển từ dưới lên trên. Đối với phương pháp này, thiết bị đơn giản nhất được sử dụng, vì bất kỳ vật chứa nào có đáy phẳng và nắp đậy kín, có thể đặt đĩa sắc ký vào đó một cách tự do, đều có thể được sử dụng như một buồng sắc ký.
Phương pháp sắc ký lớp mỏng tăng dần có một số nhược điểm. Ví dụ, tốc độ tăng của mặt trước dọc theo tấm xảy ra không đồng đều, tức là ở phần dưới, nó là cao nhất, và khi phía trước tăng lên, nó giảm dần. Điều này là do thực tế là ở phần trên của buồng bão hòa với hơi dung môi ít hơn, do đó dung môi từ đĩa sắc ký bay hơi mạnh hơn, do đó nồng độ của nó giảm và tốc độ di chuyển chậm lại. Để loại bỏ khuyết điểm này, các dải giấy lọc được gắn dọc theo thành của buồng sắc ký, cùng với đó, hệ thống sắc ký tăng dần bão hòa buồng bằng hơi trong toàn bộ thể tích.
Một số buồng sắc ký có sự phân chia thành hai khay ở phía dưới. Cải tiến này không chỉ cho phép giảm tiêu thụ hệ thống sắc ký (cần ít thể tích hơn để đạt được chiều cao cần thiết của hệ thống sắc ký), mà còn sử dụng thêm một cuvet cho dung môi, làm tăng áp suất hơi bão hòa trong buồng.
Sự cần thiết phải theo dõi mặt trước của dung môi cũng có thể được coi là một bất lợi, vì mặt trước của dung môi có thể “chạy đi” đến mép trên. Trong trường hợp này, không thể xác định được giá trị thực của Rf nữa.

Sắc ký lớp mỏng hướng xuống

Phương pháp sắc ký này dựa trên thực tế là mặt trước của hệ thống sắc ký đi xuống đĩa chủ yếu dưới tác dụng của trọng lực, tức là mặt trước pha động di chuyển từ trên xuống dưới.
Đối với phương pháp này, một cuvet có hệ thống sắc ký được gắn vào phần trên của buồng sắc ký, từ đó một dung môi đi vào đĩa sắc ký bằng cách sử dụng bấc, chất này chảy xuống và mẫu được sắc ký.
Những nhược điểm của phương pháp này bao gồm sự phức tạp của thiết bị. Phương pháp này được sử dụng chủ yếu trong sắc ký giấy.

Sắc ký lớp mỏng nằm ngang

Phương pháp này phức tạp nhất trong thiết kế phần cứng nhưng tiện lợi nhất. Vì vậy, trong buồng sắc ký, đĩa được đặt nằm ngang và hệ thống được đưa vào một cạnh của đĩa bằng cách sử dụng bấc. Mặt trước của dung môi chuyển động theo hướng ngược lại.
Có một thủ thuật khác để đơn giản hóa máy ảnh hết mức có thể. Để thực hiện việc này, một bản sắc ký làm từ nhôm được uốn cong nhẹ và đặt vào trong buồng. Trong trường hợp này, hệ thống sẽ hành động từ hai phía cùng một lúc. Chỉ các tấm được hỗ trợ bằng nhôm mới phù hợp cho mục đích này, vì các đế bằng nhựa và thủy tinh là "không linh hoạt", tức là không giữ nguyên hình dạng.
Ưu điểm của phương pháp này bao gồm thực tế là trong một ô nằm ngang, quá trình bão hòa hơi của hệ thống xảy ra nhanh hơn nhiều, vận tốc phía trước là không đổi. Và khi sắc ký từ hai phía, mặt trước không bị "chạy mất"

Sắc ký lớp mỏng xuyên tâm.

Sắc ký lớp mỏng xuyên tâm bao gồm thực tế là chất thử được đưa vào tâm của tấm và hệ thống được đưa vào đó, chất này sẽ di chuyển từ tâm ra rìa của tấm.

Các tấm làm khô.

Sau quá trình tách các chất thử, các đĩa được làm khô. Đây cũng là một quá trình quan trọng, vì nếu còn vết dung môi trên bản sắc ký thì có thể cho kết quả sắc ký không chính xác.
Nếu hệ thống sắc ký chỉ bao gồm các thành phần có độ sôi thấp, thì việc làm khô tự nhiên trong 3-5 phút là đủ. Nếu hệ thống bao gồm các chất lỏng có độ sôi cao (rượu, nước, axit hữu cơ, v.v.), đĩa phải được làm khô trong ít nhất 10 phút hoặc đĩa phải được đặt trong tủ sấy.

Nhận dạng các chất tách ra.

Bản khô là bản sắc ký đồ của các chất được nghiên cứu. Nếu các chất có màu, thì việc nhận biết bắt đầu bằng việc xác định màu của các chất được tách ra.
Nhưng trong hầu hết các trường hợp, các chất được tách ra không có màu và không thể so sánh bằng mắt thường.
Đối với sắc ký lớp mỏng, có một số kiểu phân tích định tính (xác định) các chất được tách ra:

· Phương pháp trực quan và xác định Rf của các chất được tách.

Các phản ứng màu.

· So sánh với nhân chứng.

· Các phương pháp xác định vật lý và hóa học.

Chúng ta hãy xem xét chi tiết hơn từng dạng phân tích định tính trong sắc ký lớp mỏng.

Phương pháp vật lý

Phương pháp trực quan chủ yếu được sử dụng để xác định vị trí các vết của các chất được tách ra trên đĩa sắc ký. Để làm được điều này, tấm được xem cả trong ánh sáng nhìn thấy và sử dụng ánh sáng tử ngoại (chủ yếu là ánh sáng có bước sóng 366 và 254 nm)
Đây là giai đoạn nhận dạng đầu tiên, quyết định chất lượng của các điều kiện đã chọn và kết quả của sắc ký.
Như vậy, đã xác định được chất lượng của sắc ký (sự không có "đuôi" của các chất cần tách hoặc sự chồng chéo của các vết của chúng, hình dạng và kích thước chính xác, sự không hợp nhất của các vết sắc ký, v.v.) và cho rằng sự phân tách phù hợp. vì nghiên cứu thêm, xác định Rf của các điểm đã xác định.

Giá trị Rf.

Một trong những chỉ số chính trong TLC là Rf. Thông số này tương tự với thời gian lưu và phụ thuộc cả vào đặc tính của các chất cần tách, thành phần của pha động và chất hấp thụ, và các thông số vật lý.
Việc xác định giá trị Rf được thực hiện bằng tỷ số giữa khoảng cách chất đi qua với khoảng cách đi qua phía trước dung môi

Giá trị Rf là một giá trị không có thứ nguyên và có giá trị từ 0 đến 1. Tuy nhiên, trong tài liệu, các chỉ số như hRf, Rf × 100 thường được tìm thấy, có cùng Rf, nhưng được nhân với 100, để không hoạt động với các giá trị thập phân.
Giá trị của Rf không bị ảnh hưởng bởi khoảng cách di chuyển của mặt trước dung môi, tuy nhiên, nhiều phương pháp mô tả sự đi qua của mặt trước với khoảng cách 10 cm. Điều này chỉ được sử dụng để tạo điều kiện thuận lợi cho việc tính toán Rf.
Trong thực tế, lúc bắt đầu, khoảng cách đi qua của mặt trước dung môi được xác định: từ vạch bắt đầu (và không phải từ mép đĩa) đến nơi có mặt trước ở cuối quá trình sắc ký. Khi đó khoảng cách từ vạch xuất phát đến vị trí của chất được tách ra được xác định. Đây là nơi ảnh hưởng đến kích thước của đốm! Rốt cuộc, nếu vết bẩn có hình tròn và kích thước nhỏ, thì Rf thu được có giá trị rõ ràng. Và nếu điểm kết quả có kích thước lớn hoặc hình dạng bất thường, thì khi xác định Rf của điểm đó, sai số có thể lên tới 0,1!
Trong trường hợp sắc ký phân vùng, hệ số phân bố của một chất và Rf của nó có quan hệ với nhau theo mối quan hệ:

ở đâu Sp và Sn- diện tích mặt cắt của pha động và pha tĩnh.
Như chúng ta có thể thấy, hệ số phân phối, với một tỷ lệ không đổi Sp / Sn là một đại lượng phụ thuộc tỷ lệ vào Rf và có thể được xác định thông qua nó.

các phản ứng màu.

Phản ứng màu trong sắc ký lớp mỏng được sử dụng vô cùng rộng rãi. Chúng không chỉ phục vụ cho việc xác định vị trí của các thành phần được tách ra (xử lý bằng axit sulfuric, hơi iốt), mà còn để xác định cả loại chất và nhận dạng (khi có các phản ứng riêng lẻ).
Chúng tôi sẽ không xem xét ở đây sự đa dạng màu sắc khổng lồ này phản ứng định tính, chúng tôi sẽ chỉ nói rằng nếu tất cả các phản ứng định tính trùng nhau và giá trị Rf thu được của chất trong ba các hệ thống khác nhau với dữ liệu tài liệu, chất được xác định. Mặc dù, theo ý kiến ​​của tôi, việc nghiên cứu bằng một phương pháp hóa lý khác là cần thiết phải được xác nhận thêm.

Nhân chứng so sánh.

Khi tiến hành nghiên cứu các chất có thành phần dự kiến, phương pháp sắc ký được sử dụng với nhân chứng- chất đã biết. Phương pháp này được sử dụng khi các điều kiện sắc ký khó chịu, không có dữ liệu tài liệu về Rf cho một hệ thống hoặc chất hấp phụ nhất định, việc sử dụng phương pháp gradient, v.v. Và khi thực hiện phản ứng màu, bạn không chỉ có thể so sánh màu sắc mà còn cả sắc thái của các chất được nghiên cứu và nhân chứng, điều này cũng rất quan trọng.
Mặt khác, phương pháp này đòi hỏi thêm chi phí cho người làm chứng.

Phương pháp phân tích định lượng

Phân tích định lượng trong sắc ký lớp mỏng có một số loại, đặc trưng cho từng giai đoạn phát triển của phương pháp. Và mặc dù một số phương pháp chỉ có thể được áp dụng dưới dạng bán định lượng, chúng vẫn được sử dụng trong thực tế.

phương pháp so sánh trực quan. Như đã đề cập ở trên, cường độ màu của vết và kích thước của nó phụ thuộc vào lượng chất được sắc ký. Do đó, định lượng trực quan dựa trên một số kỹ thuật.
Phương pháp pha loãng. Phương pháp này bao gồm thực tế là đối với mỗi chất, nồng độ giới hạn được xác định mà tại đó chất không thể được xác định bằng phương pháp sắc ký. Khi sắc ký chất thử, việc pha loãng được tiến hành cho đến khi chất này không còn xuất hiện trên đĩa.
Hàm lượng của chất C được xác định theo phương pháp này theo công thức:

ở đâu N- pha loãng, một- nồng độ của một chất mà nó không xuất hiện trong quá trình sắc ký.
Phương pháp xác định vùng tại chỗ. Nếu áp dụng các thể tích chất thử và chất chứng như nhau, thì diện tích các vết thu được sau khi sắc ký tỷ lệ với logarit của nồng độ của chất đó. S = a ln c + b

trong đó a và b là các hệ số thực nghiệm được xác định bằng thực nghiệm.
Nếu vết của chất được tách ra có ranh giới rõ ràng, thì diện tích của vết có thể được xác định bằng phương pháp trọng lượng (cắt vết và cân), đo bằng planimeter. Phương pháp này cho sai số lên đến 10-15%.
Tuy nhiên, nó có một số nhược điểm đáng kể. Điều đầu tiên và có ý nghĩa nhất là bằng cách này có thể xác định được nồng độ của các chất có màu hoặc những chất có huỳnh quang trong vùng UV (254, 366 nm). Nhược điểm này có thể được loại bỏ bằng cách thêm các chất phốtpho khác nhau vào chất hấp thụ, điều này làm tăng sai số xác định.
Cũng có thể sử dụng xử lý đĩa bằng chất phát triển (thuốc thử) (ví dụ, sử dụng giấy lọc được tẩm thuốc thử đang phát triển, sau đó tiếp xúc với đĩa sắc ký và xác định thêm diện tích của chất phát triển trên đó), nhưng sai số xác định cũng cao.
Nhu cầu về một kết quả định lượng đáng tin cậy hơn đã dẫn đến việc sử dụng các phương pháp công cụ.
Phương pháp rửa giải. Phương pháp này bao gồm thực tế là chất đã tách được rửa sạch khỏi chất hấp thụ bằng dung môi và nồng độ của nó được xác định bằng các phương pháp khác - trắc quang, phân cực, v.v. Đây là một phương pháp khá chính xác, nhưng chỉ với điều kiện phân lập định lượng chất được tách ra. Do cường độ lao động cao, phương pháp này được sử dụng khá hiếm và không thể chấp nhận được đối với một số lượng lớn các mẫu đang nghiên cứu.
Phương pháp chụp ảnhĐịnh nghĩa này bao gồm việc chụp ảnh các tấm với chất được tách ra và xác định thêm mức độ đen, sử dụng máy đo nhiệt độ.
phương pháp chụp ảnh phóng xạ tương tự như trắc quang, chỉ với sự khác biệt là sự hóa đen của tấm được xác định, gây ra bởi bức xạ của chất được tách ra. Phương pháp này chỉ được sử dụng trong việc xác định các chất có các nguyên tử được đánh dấu.
Phương pháp đo quang tổng hợp có thể được sử dụng mà không cần cô lập chất khỏi tấm và dựa trên việc xác định không chỉ diện tích của vết mà còn cả cường độ của nó.
Đây là phương pháp chính xác nhất để xác định nồng độ của các chất, vì nó cho phép, khi sử dụng đồ thị hiệu chuẩn, thực hiện các phép xác định định lượng khá chính xác của tất cả các chất đã tách (lên đến 2-10%) trực tiếp trên đĩa trong thời gian ngắn. thời gian.
Không có gì đáng ngạc nhiên khi với sự phát triển của sắc ký lớp mỏng, việc sử dụng các thiết bị đo nhiệt độ kế tăng lên, độ nhạy và do đó, độ chính xác của việc xác định nồng độ của các chất tách ra tăng lên và tiệm cận độ chính xác của sắc ký lỏng hiệu năng cao.

Cơm. 1. Buồng điển hình để phát triển bản sắc ký lớp mỏng

1. Nắp
2. buồng kính
3. Tấm TLC
4. chất hấp phụ
5. địa điểm lấy mẫu
6. dung môi

Sắc ký đồ TLC đặc trưng của metyl este của axit béo.

Trên sắc ký đồ DANH TIẾNG= axit béo metyl este = metyl este của axit béo. khởi đầu= điểm áp dụng các hỗn hợp được tách ra.

Sắc ký đồ được thực hiện trên đĩa Sorbfil. Hệ thống là benzen. Biểu hiện - thành than sau khi phun axit sunfuric.

Chấm 1 - metyl este của axit béo. Chấm 2 - sản phẩm metyl hóa của tổng số lipid.

Mũi tên hướng chuyển động của mặt trước dung môi (hệ thống) được hiển thị. Mặt trước của dung môi trong quá trình sắc ký di chuyển lên mép trên của đĩa.

Ứng dụng của phương pháp TLC trong dược phẩm

Tầm quan trọng lớn của phương pháp sắc ký đối với dược là do trong sản xuất thuốc, trong nhiều trường hợp, cần phải phân lập sơ bộ các sản phẩm tự nhiên hoặc tổng hợp ở dạng tinh khiết. Việc phân tích cũng thường dựa trên việc tách hỗn hợp thành các thành phần. Chúng ta hãy xem xét hai ví dụ về việc áp dụng phương pháp TLC, chứng minh tầm quan trọng của nó trong việc phân tích và sản xuất dược chất.

Xác định định lượng Saponin Triterpene bằng HPTLC sử dụng phép đo mật độ quét

Các saponin triterpene (glycoside) là những thành phần hoạt tính của nhiều loại thuốc.

Hầu hết các phương pháp được sử dụng hiện nay để xác định định lượng saponin triterpene dựa trên quá trình thủy phân bằng axit với phương pháp xác định thêm aglycone, thường là bằng phương pháp chuẩn độ, ít thường xuyên hơn bằng phương pháp phân tích phổ.

Các phương pháp tương tự dựa trên sự phá hủy các phân tử saponin có một số nhược điểm. Chúng dài dòng và không cho phép đánh giá định lượng tỷ lệ các saponin riêng lẻ trong tổng số các chế phẩm chứa saponin.

Trong hầu hết các trường hợp, theo quy luật, các tác giả tự giới hạn mình trong việc đánh giá định tính bằng phương pháp TLC, phương pháp phân tích sắc ký đơn giản và dễ tiếp cận nhất. Việc sử dụng TLC để xác định hàm lượng định lượng của các thành phần bị hạn chế do thiếu máy đo mật độ quét.

Bài báo này trình bày kết quả định lượng TLC của một số saponin triterpene, dẫn xuất của axit oleanolic, trong các chế phẩm dược phẩm và dịch chiết từ nguyên liệu thực vật.

Các saponin triterpene của Mãn Châu Úc (aralosides) được chọn làm đối tượng nghiên cứu. Việc xác định định tính trong số các đối tượng khác nhau được đề cập trong các công trình, cũng như saponin triterpene của củ cải đường - chất có hoạt tính dược lý được thiết lập trước. Cả hai đều là dẫn xuất của axit oleanolic với một lượng đường nhỏ (không quá bốn), điều này cho thấy hoạt động tương tự của chúng trong một lớp chất hấp thụ mỏng.

Theo tiêu chuẩn, chúng tôi sử dụng tổng hợp chất aralosit được phân lập từ viên nén Saparal và tổng saponin của củ cải đường được phân lập từ thân rễ mới thu hoạch. Để áp dụng cho đĩa, dung dịch saponin trong nước (80% etanol) được chuẩn bị với hàm lượng của chất sau là 0,4–2,0 mg / ml. Sắc ký được thực hiện bằng các tấm TLC "Silufol" (Cộng hòa Séc) 15 x 15 cm, "Armsorb" cho HPTLC (Armenia) 6 x 10 cm và "Sorbfil" (Nga) 10 x 10 cm. Chiều cao của phần nhô ra phía trước, đủ để tách hoàn toàn, lần lượt là 10,6 và 6 cm. Các mẫu được áp dụng bằng cách sử dụng ống tiêm MSH-10 (Nga) lên đĩa được làm nóng đến 40 ° C. Thể tích tối ưu của mẫu được áp dụng là 3–5 μl. Việc áp dụng được thực hiện theo nhiều giai đoạn sao cho đường kính của đầu điểm không vượt quá 2 mm.

Sắc ký được thực hiện ở nhiệt độ 20 - 25 ° C. Khi kết thúc quá trình rửa giải, các đĩa được làm khô trong không khí và được xử lý bằng thuốc thử phát hiện sử dụng bình xịt thủy tinh trong phòng thí nghiệm. Các vùng được quét bằng máy đo mật độ quét Shimadzu CS-9000 "(Nhật Bản). Chất lượng của các vùng thu được bằng phương pháp sắc ký trong ba hệ thống rửa giải được khuyến nghị phổ biến nhất được so sánh: I. cloroform - metanol - nước (30: 17: 3) : II. N-butanol - etanol - amoniac (7: 2: 5) III. N-butanol - nước - axit axetic (4: 5: 1), lớp trên IV. Benzen - etyl axetat (1: 1) (cho saponin củ cải đường).

Dung dịch axit phosphotungstic 25% cồn được sử dụng làm thuốc thử phát hiện (các vết saponin màu đỏ thẫm trên nền trắng). được sử dụng phổ biến nhất để xác định định lượng TLC của các hợp chất như vậy và dung dịch axit phosphomolybdic 10% cồn, được khuyến nghị cho sự phát triển của vùng triterpenoid (vùng saponin có màu xanh đậm trên nền vàng). Xử lý các tấm bằng hơi amoniac trong trường hợp thứ hai có thể làm mất màu nền và tăng độ tương phản của các đốm.

Kết quả của các nghiên cứu được thực hiện, các điều kiện tối ưu cho quá trình sắc ký để xác định tỷ trọng đã được chọn. Loại tấm tốt nhất trong số ba loại tấm đã được "Armsorb" công nhận cho HPTLC. hiệu quả cao Quá trình này được tạo điều kiện thuận lợi bởi một lớp silica gel mỏng (II0 μm) và đồng nhất về thành phần phân đoạn (5-10 μm), giúp phân tách tốt và làm mờ các vùng tối thiểu ngay cả khi mặt trước dung môi tăng 6 cm. Các tấm Sorbfil là gần như tốt hơn chúng về khả năng phân tách, nhưng thời gian rửa giải trên chúng lâu hơn gần như gấp đôi. Các tấm "Silufol" ở tốc độ rửa giải đủ cao cho phép bạn tách các thành phần bằng một con đường sắc ký dài hơn, dẫn đến một số vùng bị mờ, nhưng việc sử dụng chúng cũng có thể thực hiện được.

Quá trình rửa giải có thể được thực hiện với đủ chất lượng trong bất kỳ hệ thống rửa giải nào trong số ba hệ thống rửa giải đầu tiên. Tôi đưa ra lợi ích về thời gian, IV cho phép bạn tách saponin củ cải đường tốt hơn ba lần đầu tiên.

Cả hai thuốc thử phát hiện đều cho sự nhuộm màu khá ổn định của các vùng khi tiến hành quét trong vòng 1 - 2 giờ kể từ thời điểm phát triển. Sau khoảng thời gian này, các vùng saponin trên các đĩa được xử lý bằng axit photphat sẽ chuyển màu từ đỏ thẫm sang tím, có thể làm sai lệch kết quả phân tích định lượng trong quá trình quét. Điều trị bằng axit phosphomolybdic thích hợp hơn trong trường hợp này. Khi được bảo quản ở nơi tránh ánh sáng, các đĩa có vùng được phát triển bởi thuốc thử này cho kết quả có thể tái lập hoàn toàn sau vài tháng kể từ thời điểm phát triển.

Giới hạn phát hiện saponin là 5 μg trong mẫu khi phát triển bằng axit photpholipit và 0,5 μg trong mẫu khi phát triển bằng axit photphomolybdic. Xử lý bằng hơi amoniac có thể làm giảm giới hạn phát hiện của saponin trong trường hợp thứ hai xuống 0,2 μg mỗi mẫu.

Xác định định lượng saponin bằng TLC sử dụng phép đo mật độ quét được thực hiện trên đĩa Armsorb (tốc độ sắc ký trong trường hợp này là 2 cao hơn lần) hoặc "Sorbfil", trong hệ thống rửa giải II và III (vì chứa ít thành phần độc hại hơn). Các vùng được phát hiện bằng dung dịch axit photphomolybdic 10%. Thể tích của mẫu bôi không quá 5 μl, chiều cao của mặt trước rửa giải là 6 cm, thời gian rửa giải là 30 - 60 phút. Bước sóng quét λ = 675 nm. Sau khi xử lý các tấm, saponin của aralia và củ cải đường xuất hiện dưới dạng ba múi với cường độ khác nhau.

Quan điểm chung của các mật độ đồ thu được trong quá trình quét được thể hiện trong hình. một.

So sánh sắc ký đồ của saponin phân lập từ viên nén "Saparal" (Hình 1, a) và "Aralia cồn thuốc" (Hình. 1,6) cho phép chúng tôi lưu ý tỷ lệ khác nhau 44

araloside A, B và C, là một phần của các dạng bào chế này. Sự thay đổi tương tự về tỷ lệ các saponin riêng lẻ trong nguyên liệu thô, tùy thuộc vào điều kiện phát triển của cây, đã được ghi nhận trước đó. Tỷ lệ saponin trong thành phẩm dạng bào chế dễ dàng đánh giá bằng cách sử dụng các mật đồ thu được. Vì có 3 vùng tương ứng với saponin trên sắc ký đồ và 3 pic tương ứng trên mật đồ, nên diện tích của tất cả các pic được tóm tắt khi xây dựng sự phụ thuộc của hiệu chuẩn. Sai số trong trường hợp này thấp hơn so với các phép tính dựa trên các tham số của đỉnh của một trong các thành phần, có tính đến sự biến thiên của tỷ số của chúng (Hình 2).

Cơm. I. Biểu đồ đặc trưng thu được bằng cách quét các tấm TLC: một- Aralia saponin được phân lập từ viên nén Saparal; 6 - saponin cồn thạch aralia; trong- saponin củ cải đường. Tổng hàm lượng saponin trong mẫu là 5 μg. A, B, C- đỉnh của saponin; 0 - dòng bắt đầu; f- Tiền tuyến.

Cơm. Hình 2. Sự phụ thuộc hiệu chuẩn của tổng diện tích của picon saponin trên sắc ký đồ vào hàm lượng của chúng trong mẫu. / - Aralia saponin; 2 - saponin củ cải đường. Trên trục abscissa - hàm lượng saponin trong mẫu (mcg), trên trục tọa độ - tổng diện tích pic (cm 2).

Sự phụ thuộc hiệu chuẩn của tổng diện tích của các pic trong biểu đồ mật độ vào hàm lượng của chất trong mẫu thu được bằng phương pháp sắc ký của một loạt các dung dịch chuẩn có hàm lượng saponin đã biết. Dung dịch ban đầu được chuẩn bị bằng cách hòa tan trong etanol 80% một lượng saponin chính xác, được làm khô đến khối lượng không đổi. Một loạt các dung dịch làm việc được chuẩn bị bằng cách pha loãng liên tiếp 80% etanol ban đầu. Hàm lượng saponin trong chúng là 0,04 - 2,0 mg / ml (0,2 - 10 µg trong mẫu có thể tích mẫu là 5 µl). Khoảng nồng độ này có thể được coi là tối ưu cho quá trình quét. Hàm lượng saponin tối thiểu được xác định bằng phương pháp này là 0,2 µg / mẫu. Độ lệch chuẩn tương đối trong trường hợp này không vượt quá 0,03.

Kết quả phụ thuộc hiệu chuẩn là phi tuyến tính, điều này hoàn toàn phù hợp với lý thuyết Kubelka-Munk, lý thuyết này có tính đến sự hấp thụ và tán xạ ánh sáng của chất hấp thụ. Trong một phạm vi hẹp của nồng độ thấp, các phụ thuộc có thể được coi là tuyến tính (0,2 - 2,0 µg / mẫu). Phần phi tuyến tính của các đường cong có thể được tuyến tính hóa bằng cách chuyển đổi lượng chất trong mẫu và diện tích pic thành nghịch đảo và có dạng như trong Hình. 3.

Cơm. 3. Sự phụ thuộc nghịch đảo của tổng diện tích các pic saponin trên sắc ký đồ (1 / S 10 -1) vào giá trị nghịch đảo của chúng của hàm lượng trong mẫu (1 / m - 10 -1). 1 - Aralia saponin; 2 - saponin củ cải đường.

Sử dụng sự phụ thuộc vào hiệu chuẩn thu được, hàm lượng saponin trong cồn aralia được xác định. 5 ml cồn được pha loãng với etanol 70% trong bình định mức 25 ml. 5 μl dung dịch thu được được áp dụng cho vạch bắt đầu của các đĩa "Armsorb". 5 μl dung dịch tiêu chuẩn của araloside với nồng độ 1 mg / ml (5 μg trong mẫu) được áp dụng vào điểm liền kề. các tấm đã được xử lý như mô tả ở trên.

Sự khác biệt giữa các kết quả thu được và các kết quả của phép xác định theo FS 42-1647-93 (5,3 mg / ml) là 6–7% theo hướng đánh giá quá cao, điều này có thể được giải thích do sự mất mát saponin trong quá trình chuẩn bị nhiều giai đoạn mẫu theo FS (bảng).

Phương pháp mô tả ở trên được sử dụng để xác định saponin trong viên nén "Saparal" và trong nguyên liệu thực vật (rễ cây Mãn Châu Úc và thân rễ củ cải đường) bằng cách chiết xuất sơ bộ saponin từ viên nén từ nguyên liệu - 80% ethanol nóng. Sai lệch so với kết quả của phép xác định theo FS 42-1755 - 81 đối với viên nén (0,040 g) nằm trong giới hạn tương tự như đối với cồn thuốc (bảng).

Do đó, khả năng xác định định lượng nhanh một số saponin triterpene, dẫn xuất của axit oleanolic trong dược phẩm và nguyên liệu thực vật bằng HPTLC với việc đánh giá định lượng tiếp theo các vùng thu được bằng cách sử dụng phép đo mật độ quét đã được chứng minh.

Kết quả của phép xác định tương quan khá tốt với kết quả của phép xác định bằng PS. Kỹ thuật này có thể kết hợp việc xác định tính xác thực của chế phẩm bằng TLC (bằng FS) với việc quét tiếp theo các vùng của các thành phần trên đĩa và đánh giá định lượng của chúng. Sắc ký đồ thu được trong quá trình quét cũng giúp xác định tỷ lệ các saponin riêng lẻ trong các đối tượng được phân tích.

Kết quả xác định định lượng aralose trongCTofik-từ úc (I) và máy tính bảng "Saparal" (2) bằng phương pháp TGC sử dụng quét dsnsptoietrnn / "= 0,95, và - 5,/=2,78,/=4

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN LIPID VÀ FLAVONOID CỦA MẪU MỘT SỐ LOÀI CỦA THẾ HỆ TRUNG QUỐC ( Lathyrus .)

Từ nhiều đại diện của họ đậu, chẳng hạn như cỏ linh lăng, cây lupin, cỏ ba lá, đậu tằm, flavonoid đã được phân lập có tác dụng rộng rãi: chống viêm, chữa lành vết thương, tăng cường mạch máu, v.v. Isoflavone được phân lập từ cỏ ba lá đỏ: biochanin A - 0,8% và formononetin - 0,78%, có hoạt tính estrogen.

Chúng tôi đã nghiên cứu thành phần flavonoid trong một số loài thuộc chi: ch. Gieo (I), schlugovaya (II), ch.

Với quan điểm về khả năng sử dụng phức hợp lipid trong phụ gia thực phẩm và thuốc, chúng tôi cũng đã nghiên cứu thành phần phân đoạn hoàn chỉnh của lipid trong cỏ và hạt của cây rau má.

Nguyên liệu và phương pháp

Việc phân lập phần lipid từ nguyên liệu khô được thực hiện theo phương pháp Bligh và Dyer.

Thêm 1,6 ml nước cất vào một mẫu (0,2 g) nguyên liệu thực vật khô và giữ trong giá lạnh một ngày. Sau đó, 6 ml hỗn hợp cloroform - metanol (1: 2) được thêm vào và để trong 3 ngày, sau đó được ly tâm ở tốc độ 8 nghìn vòng / phút - 15 phút. 2 ml nước và 2 ml cloroform được thêm vào phần nổi phía trên. Hệ thống 2 pha kết quả được tách trong một phễu chiết. Lớp cloroform được rửa hai lần bằng metanol và làm bay hơi đến khô trên thiết bị cô quay. Cặn được làm khô trong bình hút ẩm chân không, sau đó pha loãng với cloroform đến nồng độ 10 mg / ml, và dung dịch được bảo quản trong cloroform ổn định ở + 4 ° C.

Phân tích định tính phần lipid được thực hiện bằng cách sử dụng TLC trên đĩa Kizelgel 60 (254) trong các hệ dung môi sau:

A. Cho lipit trung tính: 1) Hexan - benzen (9: 1); 2) Hexan - ete - axit axetic (90: 10: 1).

B. Đối với lipit phân cực (photpholipit): 1) cloroform - axeton - metanol - axit axetic - nước (6: 8: 2: 2: 1), có tính axit; 2) cloroform - meta-

nol - 26% amoniac (65: 25: 5), bazơ; 3) cloroform - metanol - nước (65: 25: 4), trung tính.

Khi xác định thành phần định tính của phospholipid, việc xác định chúng được thực hiện bằng cách sử dụng các chất phát triển khác nhau (hơi iốt, ninhydrin, thuốc thử Dragendorff, axit sulfuric) và sử dụng Rf tiêu chuẩn.

Tập hợp các hệ thống và thuốc thử trên giúp có thể thực hiện phân tích toàn diện các phân đoạn lipid phân lập được từ các mẫu cằm.

Để nghiên cứu thành phần flavonoid, có xét đến các giai đoạn của thảm thực vật, các mẫu sau được chọn: I (giai đoạn ra hoa); IV (giai đoạn ra hoa); III (sochevnik) giai đoạn nảy chồi; II (giai đoạn ra hoa); II (giai đoạn đậu quả); II (giai đoạn sinh dưỡng trước khi ra hoa).

Việc phân lập flavonoid từ nguyên liệu khô được thực hiện theo một phương pháp đảm bảo chiết xuất hết chúng.

Với mục đích này, 1 g thảo mộc đã nghiền nhỏ được cho vào bình cầu có hồi lưu, đổ đầy 20 ml etanol 70%, và đun sôi trong 20 phút trong nồi cách thủy. Dịch chiết được làm lạnh, lọc qua bộ lọc Schott bằng thủy tinh, và làm bay hơi đến khô trên thiết bị cô quay. Phần còn lại được hòa tan trong rượu etylic đến nồng độ cuối cùng là 10 mg / ml. Việc xác định tổng hàm lượng của flavonoid được thực hiện bằng cách sử dụng rutin làm chất chuẩn. Kết quả của nghiên cứu này được thể hiện trong bảng. 3.

Thành phần định tính của flavonoid được xác định bằng TLC trên đĩa Kieselgel 60 (254) từ Merck, trong hệ dung môi n-butanol - axit axetic - nước (6: 1: 2). Máy dò - axit sulfuric ở UV (254 nm) - đốm flavonoid màu hoa cà trên nền màu xanh lá cây.

Bảng 1

Tổng hàm lượng flavonoid trong nguyên liệu (cỏ) các loại rau má (tính theo% khối lượng tuyệt đối khô)

Cơm. Hình 1. TLC về thành phần flavonoid của các loài được chọn thuộc chi Chin. C - lượng nhân chứng của flavonoid: ononin - Rf 0,28; công viêc hằng ngày - R.0,48; luteolin-glucoside - Rf 0,58; formononetin - Rf 0,64; quercetin - Rf0,79: luteolin - Rf 0,82; biochanin A - Rf 0,85; apigenin - Rf 0,92.

Cơm. Hình 2. TLC của flavonoid của cỏ đồng cỏ trong các giai đoạn khác nhau của thảm thực vật. IIa - giai đoạn ra hoa; IIb - giai đoạn đậu quả: IIc - giai đoạn thực vật trước khi ra hoa. C - lượng nhân chứng của flavonoid: ononin - Rf f 0,28; công viêc hằng ngày - Rf 0,48; luteolin-glucoside - Rf 0,58; formononetin - Rf 0,64; quercetin - Rf 0,79; luteolin - R ( 0,82; biochanin A - Rf 0,85; apigenin - Rf 0,92.

Khi nghiên cứu thành phần flavonoid của II trong các giai đoạn khác nhau của thảm thực vật, người ta nhận thấy rằng ngoài rutin và quercetin, ononin và formononetin có trong dịch chiết với một lượng đáng chú ý. Các flavonoid khác đã được tìm thấy ở một lượng nhỏ.

Như vậy, người ta đã chỉ ra rằng ở các loại cằm khác nhau, trong các giai đoạn khác nhau của thảm thực vật, có cả glycoside và aglycones - ononin, rutin, luteolin-glucoside và các aglycone của chúng: formononetin, quercetin và luteolin, và thành phần của chúng thay đổi tùy thuộc vào loại thực vật và trong một loại thực vật (xếp hạng đồng cỏ) tùy thuộc vào giai đoạn thực vật.

ban 2

Hàm lượng định lượng của các flavonoid chính trong các đại diện riêng lẻ của chiny (trong %, về trọng lượng khô tuyệt đối)

Trong II, cả ononin và formononetin đều được tìm thấy trong thời kỳ sinh dưỡng. Trong thời kỳ ra hoa và đậu quả, lượng ononin giảm rõ rệt và lượng formononetin tăng lên.

Hàm lượng định lượng của các flavonoid chính trong các mẫu nghiên cứu được xác định bằng phương pháp TLC định lượng trong cùng điều kiện. Kết quả của nghiên cứu này được thể hiện trong bảng. 2.

Như sau từ dữ liệu trong Bảng. 2, các loại khác nhau Chins là một nguồn phong phú của bloflavonoid, do đó những cây này thể hiện một trong những loại hoạt động sinh học.

Sự kết luận:

Một trong những nhiệm vụ quan trọng của hóa học hiện đại là phân tích đáng tin cậy và chính xác các chất hữu cơ, thường giống nhau về cấu trúc và tính chất. Không có điều này, không thể thực hiện các hoạt động hóa học, sinh hóa và Nghiên cứu y khoa, các phương pháp sinh thái phân tích môi trường, giám định pháp y, cũng như các ngành công nghiệp hóa chất, dầu khí, thực phẩm, y tế và nhiều lĩnh vực khác của nền kinh tế quốc dân phần lớn dựa trên điều này. Ở đây chỉ đưa ra một phần nhỏ các phương pháp và kỹ thuật của sắc ký lớp mỏng. Nhưng như bạn có thể thấy từ sắc ký lớp mỏng nhỏ này có những khả năng đáng kể và nghiêm túc, kết hợp với sự tiện lợi và đơn giản.