Međutim, izvedena je i plinska verzija TLC-a. Kao sitnozrni koriste se sitnozrni, Al 2 O 3 i drugi koji se prekrivaju staklom, folijom ili pločama; za fiksiranje sloja se koristi ili drugi. Prom-Stu proizvodi gotove ploče sa već fiksiranim slojem. Eluenti su obično mješavine org. rastvori, vodeni rastvori, to-t, kompleksotvorni, itd. in-in. Ovisno o izboru hromatografa sistema (sastav mobilnih i stacionarnih faza) u odvajanje u-u main procesi mogu igrati ulogu. U praksi se nekoliko njih često implementira istovremeno. mehanizmi razdvajanja.

U zavisnosti od položaja ploče i pravca toka eluenta, razlikuju se uzlazni, silazni i horizontalni TLC. Prema tehnici rada razlikuje se frontalna analiza (kada analizirana smjesa služi kao mobilna faza) i uobičajena varijanta eluiranja. Koriste se i "kružni" (kada se analizirani rastvor i rastvarač uzastopno unose u centar ploče) i "anti-kružni" TLC (kada se analizirani rastvor nanosi po obodu i eluent se kreće od periferije ka centru ploče), TLC pod (kada se p -rastvarač ispod propušta kroz sloj prekriven čvrsto stisnutim), kao i TLC pod uslovima gradijenta t-ry, sastava itd. U tzv. dvodimenzionalna TLC hromatografija. proces se izvodi uzastopno u dva međusobno okomita pravca sa dekomp. eluenti, što povećava efikasnost razdvajanja. U istu svrhu koristi se višestruko eluiranje u jednom smjeru.

U varijanti eluiranja, kapi (1-5 μl) analiziranog rastvora se nanose na sloj i ivica ploče se uroni u eluent koji se nalazi na dnu hermetički zatvorene staklene komore. Eluent se kreće duž sloja pod dejstvom kapilarnih i gravitacionih sila; analizirana smjesa se kreće u istom smjeru. Kao rezultat višestrukog ponavljanja iu skladu sa koeficijentom. distribucije u odabranom su odvojene i raspoređene na ploči u zasebne zone.

Nakon što je proces završen, ploča se izvlači iz komore, osušene i odvojene zone nalaze se same. bojenjem ili nakon prskanja otopinama koje formiraju obojene ili fluorescentne mrljesa komponentama smjese koje treba odvojiti. Radioaktivne supstance se detektuju autoradiografski (izlaganjem pločici postavljenoj na ploču). Također se primjenjuje. i aktivne metode detekcije. Dobivena slika distribucije hromatografske. zone tzv hromatogram (vidi sliku).

Kromatogram dobijen odvajanjem mješavine tri komponente metodom tankog sloja.

Položaj kromatografa Zone na hromatogramu karakteriše vrednost R f - odnos puta l i koji prelazi centar zone i-te komponente od početne linije do puta l koji prelazi eluent: R f = l i /l; R f 1. Vrijednost R f zavisi od koeficijenta. distribucije () i na omjeru volumena mobilne i stacionarne faze.

Na odvajanje u TLC-u utiču brojni faktori - sastav i svojstva eluenta, priroda i, t-ra, dimenzije i debljina sloja, dimenzije komore. Stoga, da bi se dobili ponovljivi rezultati, potrebno je pažljivo standardizirati eksperimentalne uvjete. Usklađenost sa ovim zahtjevom omogućava vam da postavite R f s relativnom. standardna devijacija 0,03. U standardnim uslovima, R f je konstantan za dati in-va i koristi se za potonji.

Broj komponenti u hromatografiji. zona se određuje direktno na sloju površinom zone (obično njen promjer varira od 3 do 10 mm) ili intenzitetom njene boje (). Također koristite automatsku instrumenti za skeniranje koji mjere apsorpciju, transmisiju ili refleksiju svjetlosti ili hromatografski. zone. Odvojene zone se mogu sastrugati sa ploče zajedno sa slojem, komponenta se može ekstrahovati u rastvarač i analizirati odgovarajućom metodom (fluorescencija, atomska apsorpcija, atomska fluorescencija, radiometrijska analiza, itd.). Greška kvantitativnog određivanja je obično 5-10%; granice detekcije in-in u zonama -10 -3 -10 -2 μg (za obojene derivate) i 10 -10 -10 -9 μg (upotreba).

Prednosti TLC-a: jednostavnost, ekonomičnost, dostupnost opreme, brzina (vreme razdvajanja 10-100 min), visoke performanse i efikasnost separacije, jasnoća rezultata separacije, lakoća detekcije hromatografijom. zone.

TLC se koristi za razdvajanje i analizu i org. i neorgan. in-in: skoro sve inorg.

Kromatografija u moderna hemija

Jedan od važnih zadataka moderne hemije je pouzdana i tačna analiza organska materija, često slične strukture i svojstava. Bez toga je nemoguće provoditi hemijska, biohemijska i medicinska istraživanja, to se u velikoj meri zasniva ekološke metode analiza okruženje, forenzičkom vještačenju, kao i hemijskoj, naftnoj, gasnoj, prehrambenoj, medicinskoj industriji i mnogim drugim sektorima nacionalne privrede.

Jedna od najosetljivijih metoda je hromatografska analiza, koju je prvi predložio ruski naučnik M. S. Cvet početkom 20. veka. i do kraja veka se pretvorio u moćno oruđe, bez kojeg više ne mogu ni sintetičari ni hemičari koji rade u drugim oblastima.

Odvajanje boja je izvršeno u koloni prikazanoj na sl. 1. Mješavina supstanci A, B i C - prirodni pigmenti, izvorno locirani u zoni e,- odvaja se dodavanjem odgovarajućeg rastvarača D (eluent) u odvojene zone.

Kao i uvijek, sve je počelo, čini se, od najjednostavnije stvari koju je svaki školarac mogao učiniti. Prethodnih godina su školarci, uključujući i autora ovog članka, pisali mastilom. A ako bi upijač pao na mrlju od tinte, tada se moglo primijetiti da je otopina tinte na njoj podijeljena na nekoliko "prednjih strana". Kromatografija se zasniva na raspodjeli jedne od nekoliko supstanci između dvije, kako kažu, faze (npr. solidan i gas, između dve tečnosti itd.), a jedna od faza se stalno kreće, odnosno pokretna je.

To znači da takva faza, na primjer, plin ili tekućina, stalno napreduje, narušavajući ravnotežu. Štoviše, što se ova ili ona tvar bolje sorbira (apsorbira) ili otapa u stacionarnoj fazi, to je sporija brzina njenog kretanja, i obrnuto, što je spoj manje sorbiran, tj. ima manji afinitet za stacionarnu fazu, to je veći brzina kretanja. Kao rezultat, kao što je prikazano na sl. 2, ako u početku imamo mješavinu spojeva, onda se postepeno svi, gurnuti mobilnom fazom, kreću do "finiša" različitim brzinama i na kraju se razdvajaju.

Rice. 2. Osnovni princip hromatografskog odvajanja: NF je sloj stacionarne faze koji pokriva unutrašnju površinu kapilarne cijevi T, kroz koju protiče mobilna faza (MP). Komponenta A 1 izdvojene smjese ima visok afinitet za mobilnu fazu, a komponenta A 2 - za stacionarnu fazu. A "1 i A" 2 su položaji zona istih komponenti nakon vremenskog perioda tokom kojeg je došlo do hromatografskog razdvajanja u smjeru označenom strelicom

U praksi se uzorak mješavine supstanci ubrizgava, na primjer, štrcaljkom u sloj stacionarne faze, a zatim se različita jedinjenja koja čine smjesu, zajedno s mobilnom fazom (eluentom), kreću duž sloj, vođen ovom fazom. Brzina kretanja zavisi od količine interakcije (afiniteta) komponenti u stacionarnoj i pokretnoj fazi, te se kao rezultat postiže razdvajanje komponenti.

Nakon razdvajanja, sve komponente moraju biti identificirane i kvantificirane. Ovo je opća shema hromatografije.

Treba napomenuti da ova moderna metoda omogućava određivanje sadržaja desetina i stotina različitih jedinjenja u smeši u roku od nekoliko minuta, čak iu zanemarljivim količinama u „tragovima“ od ~10–8%.

Razmotrimo detaljnije hromatografsku metodu analize. Kromatografski sistemi se mogu podijeliti prema sljedećim principima:

– stanje agregacije mobilne i stacionarne faze;
– geometrijske karakteristike sistema;
– mehanizam interakcije između odvojene supstance i faza.

Kao mobilna faza koristi se plin ili tekućina. Čvrste tvari ili tekućine se koriste kao stacionarne, ili stacionarne, faze.

Prema rasporedu faza, hromatografski sistemi se dele u dve grupe: planarni i kolonski.

Potonji se, pak, dijele na:

- upakovane, punjene granuliranim čvrstim materijalom (male kuglice), bilo da su medij za razdvajanje ili služe kao nosač stacionarne tečne faze;
- kapilara, čiji su unutrašnji zidovi prekriveni filmom nepokretne tečnosti ili slojem čvrstog adsorbenta (apsorbera).

Interakcija između supstance koja se odvaja i faza hromatografskog sistema može se vršiti ili na površini faze ili u zapremini. U prvom slučaju naziva se hromatografija adsorpcija, u drugom distribucija.

Mehanizmi razdvajanja molekula u hromatografskim sistemima najčešće se svode na sledeće:

– stacionarna faza fizički apsorbuje (sorbuje) supstance koje treba odvojiti;
- stacionarna faza hemijski interaguje sa izdvojenim supstancama;
- stacionarna faza rastvara supstance koje se odvajaju od rastvora u rastvaraču koji se ne meša;
- stacionarna faza ima poroznu strukturu, koja otežava difuziju molekula supstanci koje se u ovoj fazi odvajaju.

Hromatografiju, koja je počela sa samoizrađenim uređajima kao što je traka papira umočenog u rastvarač, danas predstavljaju najsloženiji instrumentalni sistemi zasnovani na savremenim preciznim ili preciznim principima i opremljeni kompjuterskim softverom. Dovoljno je reći da jedna od najboljih kompjuterskih firmi, Hewlett-Packard, istovremeno proizvodi moderne hromatografe.

Šema procesa hromatografije je, u suštini, vrlo jednostavna i prikazana je na Sl. 3. Dalje, otprilike u ovom nizu, razmotrit će se princip rada hromatografa.

Glavne vrste hromatografije

Glavne vrste hromatografije uključuju adsorpcionu, jonsku izmenu, tečnu, papirnu, tankoslojnu, gel filtraciju i afinitetnu hromatografiju.

Adsorpciona hromatografija. U ovom slučaju, razdvajanje tvari se provodi zbog selektivne (selektivne) adsorpcije tvari na stacionarnoj fazi. Takva selektivna adsorpcija je posljedica afiniteta jednog ili drugog spoja za čvrsti adsorbens (stacionarna faza), a to je, zauzvrat, određeno polarnim interakcijama njihovih molekula. Zbog toga se hromatografija ovog tipa često koristi u analizi jedinjenja čija su svojstva određena brojem i vrstom polarnih grupa. Adsorpciona hromatografija obuhvata jonoizmenjivačku, tečnu, papirnu, tankoslojnu i gasno-adsorpcionu hromatografiju. Gasna adsorpciona hromatografija je detaljnije opisana u odjeljku Analiza eluenta.

Ionska izmjenjivačka hromatografija. koristi se kao stacionarna faza. jonoizmenjivačke smole(Sl. 4) u kolonama i kao tanak sloj na ploči ili papiru. Odvajanje se obično vrši u vodenim medijima, pa se ova metoda koristi uglavnom u neorganskoj hemiji, iako se koriste i miješani rastvarači. Pokretačka sila razdvajanja u ovom slučaju je različit afinitet odvojenih jona rastvora prema centrima za izmjenu jona suprotnog polariteta u stacionarnoj fazi.

tečna hromatografija. U ovom slučaju, stacionarna faza je tečnost. Najčešći slučaj je adsorpciona verzija tečne kolonske hromatografije. Primjer razdvajanja prirodnih pigmenata prikazan je na sl. 5.

Rice. 5. Kromatografsko odvajanje prirodnih pigmenata (flavona i izoflavona)

Papirna hromatografija. Kao stacionarna faza koriste se trake ili listovi papira (slika 6). Odvajanje se odvija prema mehanizmu adsorpcije, a ponekad se vrši u dva okomita smjera.

Tankoslojna hromatografija je svaki sistem u kojem je stacionarna faza tanak sloj, posebno sloj glinice (2 mm debljine) u obliku paste nanesene na staklenu ploču. Primjer takvog sistema i rezultati razdvajanja prikazani su na Sl. 7.

Gel filtracija, ili molekularno sito, hromatografija. Princip razdvajanja u takvim sistemima je nešto drugačiji nego u prethodnim slučajevima. Stacionarna faza su materijali, najčešće gelovi, sa strogo kontrolisanom poroznošću, usled čega neke komponente smeše, u skladu sa veličinom i oblikom molekula, mogu da prodru između čestica gela, dok druge ne mogu. Najčešće se ova vrsta hromatografije koristi za odvajanje makromolekularnih spojeva. Jedna od primena ove metode je određivanje molekulskih masa supstanci koje se odvajaju, a koje su često neophodne za hemijske studije (slika 8).

afinitetna hromatografija. Ova vrsta hromatografije zasniva se na interakciji između supstance, s jedne strane, sposobne da reaguje sa izolovanim jedinjenjem, as druge strane, povezane sa čvrstim nosačem stacionarne faze. Takva supstanca ima afinitet prema izoliranom spoju i naziva se afinitetni ligand.

Najčešće se ova metoda koristi u biohemijskoj analizi. Na primjer, kada se biološki antigenski objekti koji sadrže proteine ​​prođu kroz celulozu aktiviranu cijanogen bromidom, oni se specifično zadržavaju, kao što je prikazano na shemi 1.

Prema drugoj metodi, da bi se proteini vezali na hidroksilnu grupu celuloze, potonja se prvo tretira sa 2-amino-4,6-dihloro- Sim-triazin, a zatim produkt njihove interakcije reagira s amino grupom proteina prema shemi 2:

Naravno, broj hromatografskih metoda nije ograničen na one gore navedene. Kromatografija se često kombinuje sa drugim fizičko-hemijskim metodama, kao što je masena spektrometrija, ali ovaj članak ima za cilj da čitaoca upozna samo sa opštim principima hromatografije. Stoga ćemo dalje razmatrati obradu rezultata hromatografije.

Metode razvoja hromatograma

Razvoj je proces prenosa odvojenih supstanci mobilnom fazom. Razvoj se može obaviti na tri glavna načina: frontalna analiza, pomicanje i eluiranje. Najviše se koristi elucija.

Frontalna analiza. Ovo je najjednostavniji slučaj, jer ovdje uzorak služi kao mobilna faza. Kontinuirano se dodaje u sistem, tako da su potrebne velike količine uzoraka. Rezultati su prikazani na sl. devet.

Formiranje nekoliko zona uzrokovano je različitim afinitetima različitih komponenti za stacionarnu fazu. Rezna ivica se zove prednja, otuda i ime. Prva zona sadrži samo najmanje zadržanu supstancu A, koja se najbrže kreće. Druga zona sadrži supstance A i B. Treća zona je mešavina supstanci A, B i C. U frontalnoj analizi, samo komponenta A se dobija u tečnom obliku.

analiza pomaka. U ovom slučaju, mobilna faza ima veći afinitet prema stacionarnoj fazi od supstance koja se odvaja. Mali uzorak se uvodi u stacionarnu fazu. Ali zbog visokog afiniteta, mobilna faza istiskuje i potiskuje sve komponente. Ona istiskuje najjače sorbiranu komponentu C, koja zauzvrat istiskuje supstancu B, koja istiskuje najmanje sorbiranu komponentu A. Za razliku od frontalne analize, ova metoda se može koristiti za dobivanje svih glavnih komponenti u pojedinačnom (tečnom) obliku. .

analiza eluenta. Mobilna faza za kretanje otopljene supstance prolazi kroz hromatografski sistem. Do razdvajanja dolazi zbog različitog afiniteta komponenti smjese prema stacionarnoj fazi i, posljedično, zbog različitih brzina njihovog kretanja. U hromatografski sistem se unosi uzorak male zapremine. Kao rezultat toga, postupno će se formirati zone sa komponentama odvojene sekcije odvojeno čistim eluentom. Zbog visoke efikasnosti odvajanja, metoda je postala najšire korištena i u velikoj mjeri zamijenila druge opcije separacije. Stoga ćemo dalje razmatrati teoriju i hardverski dizajn ove metode.

Malo teorije. Često je zgodno posmatrati hromatografske procese kao niz procesa ekstrakcije; u ovom slučaju, supstance sa vrlo sličnim svojstvima mogu se odvojiti, budući da se stotine, pa čak i hiljade ciklusa ekstrakcije dešavaju brzo i istovremeno tokom hromatografskih procesa.

Za procjenu efikasnosti hromatografskih procesa, na osnovu teorijskog koncepta destilacije (po analogiji sa odvajanjem ulja u kolonama za destilaciju, gdje teorijska ploča odgovara dijelu destilacijske kolone u kojoj su para i tekućina u ravnoteži), koncept je uveden "visina ekvivalentna teorijskoj ploči"(VETT). Kromatografska kolona se stoga smatra skupom hipotetičkih slojeva (ploča). HETP se obično podrazumijeva kao takva debljina sloja koja je neophodna da bi smjesa koja dolazi iz prethodnog sloja došla u ravnotežu sa prosječnom koncentracijom tvari u mobilnoj fazi ovog sloja. Može se opisati sljedećom formulom:

HETT = L/N,

gdje L- dužina stuba, N je broj teoretskih ploča.

HETP je sažeta karakteristika odvajanja supstanci. Međutim, odvajanje komponenti mješavine je važno, ali nije dovoljno. Potrebno je identifikovati svaku komponentu i odrediti njenu količinu u uzorku. To se obično radi obradom hromatograma - ovisnosti intenziteta signala, proporcionalnog koncentraciji tvari, o vremenu razdvajanja. Neki primjeri hromatograma prikazani su na sl. 10, 11.

Poziva se vrijeme od trenutka kada je uzorak ubrizgan u kolonu do trenutka kada se registruje maksimalni pik vrijeme zadržavanja (tR). U optimalnim uslovima ne zavisi od količine ubrizganog uzorka i, uzimajući u obzir geometrijske parametre kolone, određuje se strukturom određenog jedinjenja, odnosno kvalitativna je karakteristika komponenti. Kvantitativni sadržaj komponente karakteriše veličina vrha, tačnije njegova površina. Count vršna oblast obično se radi automatski pomoću instrumenta integratora koji bilježi i vrijeme zadržavanja i vršnu površinu. Moderna oprema vam omogućava da odmah dobijete kompjuterski ispis koji pokazuje sadržaj svih komponenti smjese koje treba odvojiti.

Rad hromatografa. Instalacioni dijagram najjednostavnijeg plinskog hromatografa prikazan je na sl. 12. Sastoji se od plinskog cilindra koji sadrži mobilnu inertnu fazu (gas-nosač), najčešće helijum, azot, argon itd. Pomoću reduktora koji snižava pritisak gasa na potreban nivo, gas-nosač ulazi u kolonu, koja je cijev ispunjena sorbentom ili drugim kromatografskim materijalom koji igra ulogu stacionarne faze.

Rice. 12. Šema rada gasnog hromatografa:
1 - balon visokog pritiska sa nosećim gasom; 2 – stabilizator protoka; 3 i 3" - manometri; 4 - hromatografska kolona; 5 - uređaj za ubrizgavanje uzorka; 6 - termostat; 7 - detektor; 8 - snimač; 9 - mjerač protoka

Kromatografska kolona je "srce" hromatografa, jer se u njoj odvajaju smjese. Stubovi se najčešće izrađuju od stakla; postoje čelični, teflonski, a takođe i kapilarni stubovi. Uređaj za ubrizgavanje uzorka je instaliran blizu ulaza gasa u kolonu. Najčešće se uzorak ubrizgava špricom, probijajući gumenu membranu. Analizirana smjesa se odvaja u koloni i ulazi u detektor - uređaj koji pretvara rezultate razdvajanja u oblik pogodan za registraciju.

Jedan od najčešće korišćenih detektora je katarometar, čiji se princip zasniva na merenju toplotnog kapaciteta različitih tela.

Na sl. 13 prikazuje dijagram katarometra. Metalna spirala (otporna nit) postavljena je u cilindričnu šupljinu, koja se zagrijava kao rezultat prolaska jednosmjerne električne struje kroz nju. Kada kroz njega teče plin-nosač konstantnom brzinom, temperatura zavojnice ostaje konstantna. Međutim, ako se sastav plina mijenja s pojavom eluirane tvari, tada se mijenja temperatura zavojnice, što uređaj snima.

Drugi uobičajeni detektor je detektor ionizacije plamena, čija je shema prikazana na Sl. 14. Mnogo je osetljiviji od katarometra, ali zahteva snabdevanje ne samo gasom-nosačem, već i vodonikom. Gas nosač koji napušta kolonu, koji sadrži eluent, miješa se sa vodonikom i prelazi u mlaznicu gorionika detektora. Plamen ionizira molekule eluenta, zbog čega se smanjuje električni otpor između elektroda i povećava struja.

U tečnoj hromatografiji koriste se spektrofotometrijski detektori (u vidljivom, UV i IR području), kao i refraktometrijski detektori zasnovani na mjerenju indeksa prelamanja otopina.

Oni su unutra uopšteno govoreći osnove hromatografske analize. Naravno, članak sadrži samo opšti principi hromatografijom, a često se jednostavno označavaju. Zapravo, "kuhinja" ove metode je prilično velika i složena. glavni cilj ovaj članak, prema autoru, treba skrenuti pažnju mladih čitalaca na ovu moćnu metodu.

Oni koji žele da saznaju više o ovoj oblasti mogu koristiti literaturu u nastavku.

Književnost

Žukhovitski A.A., Turkeltaub N.M. Plinska hromatografija. M.: Gostoptekhizdat, 1962, 240 str.;
Sakodynsky K.I., Kiselev A.V., Iogansen A.V. i sl. Fizičko-hemijska primjena gasna hromatografija. M.: Hemija, 1973,
254 str.;
Kromatografija tečnom kolonom. U 3 toma Ed. Z. Deyla, K. Maceka, J. Janaka. Moskva: Mir, 1972;
Berezkin V.G., Alishoev V.R., Nemirovskaya I.B.. Plinska hromatografija u hemiji polimera. M.: Nauka, 1972, 287 str.;
Morozov A.A. Kromatografija u neorganskoj analizi. M.: Više. škola, 1972, 233 str.;
Berezkin V.G., Bočkov A.S.. Kvantitativna tankoslojna hromatografija. M.: Nauka, 1980, 183 str.;
Laboratorijski vodič za hromatografske i srodne metode. U 2 toma Ed. O. Mikesh. Moskva: Mir, 1982, tom 1–2, 783 str.;
Kromatografska analiza okoline. Ed. R. Coffin. M.: Mir, 1979, 606 str.;
Kirchner Yu. Tankoslojna hromatografija. U 2 tom M.: Mir, 1981, tom 1, 615 str., tom 2, 523 str.;
Ekstrakciona hromatografija. Ed. T.Brown, G.Gersini. M.: Mir, 1978, 627 str.

V.V. Safonov,
profesor moskovskog
državni tekstil
akademija. A.N. Kosygina

MZRF

FESMU

Katedra za opštu, fizičku i koloidnu hemiju

apstraktno

Tankoslojna hromatografija. Primjena u ljekarni

Izvršio: učenik grupe 201-F

Danilov D.I.

Provjerio: Nemov V.A.

Habarovsk, 2005

PLAN:

Uvod

Fizičke i hemijske osnove TLC

Particiona hromatografija na papiru

Osnove tankoslojne hromatografije

• sorbenti
• rastvarači
• priprema ploča
• tehnika primene test rastvora

hromatografija

Ploče za sušenje.

Identifikacija odvojenih supstanci

Primjena TLC metode u farmaciji

• Kvantitativno određivanje triterpenskih saponina HPTLC pomoću skenirajuće denzitometrije
• Proučavanje sastava lipida i flavonoida u uzorcima nekih vrsta iz roda Chin (Lathyrus.)

Zaključak

Književnost

Uvod

Tankoslojna hromatografija (TLC, TLC) je jedna od najčešće korišćenih metoda hromatografske analize, ali najmanje popularna.
Uprkos značajnim nedostacima koji su postojali donedavno, široko se koristi za kvalitativna analiza mješavine, uglavnom zbog jeftinosti i brzine dobivanja rezultata. Tankoslojna hromatografija (TLC) je prvobitno razvijena za odvajanje lipida. Iako je papirna hromatografija brža od hromatografije na koloni, ona ima nedostatak što se papir može napraviti samo od materijala na bazi celuloze, što ga čini neprikladnim za odvajanje nepolarnih supstanci. Tankoslojna hromatografija zadržava sve prednosti papirne hromatografije, ali omogućava upotrebu bilo kog materijala koji se može fino samleti i tada se dobija homogeni sloj. Može biti neorganske supstance, kao što su silika gel, glinica, dijatomejska zemlja i magnezijum silikat, kao i organske supstance, posebno celuloza, poliamidi i polietilenski prah.

Fizičke i hemijske osnove tankoslojne hromatografije.

Osnova tankoslojne hromatografije je adsorpciona metoda, iako postoji i particiona hromatografija.
Metoda adsorpcije zasniva se na razlici u stepenu sorpcije-desorpcije odvojenih komponenti na stacionarnoj fazi. Adsorpcija se odvija zahvaljujući van der Waalsovim silama, što je osnova fizičke adsorpcije, polimolekularne (formiranje više slojeva adsorbata na površini adsorbenta) i hemisorpcije (hemijska interakcija adsorbenta i adsorbata).
Za efikasne sorpciono-desorpcione procese neophodno je veliki trg, što nameće određene zahtjeve adsorbentu. At velika površina fazno odvajanje je brzo uspostavljanje ravnoteže između faza komponenti smeše i efektivno razdvajanje.
Druga vrsta tankoslojne hromatografije koja se koristi u tankoslojnoj hromatografiji je particiona tečna hromatografija.
U particijskoj hromatografiji, obje faze - pokretna i stacionarna - su tekućine koje se ne miješaju jedna s drugom. Razdvajanje supstanci se zasniva na razlici u njihovim koeficijentima raspodele između ovih faza.
Po prvi put se metoda tankoslojne hromatografije deklarirala kao "Papirna tankoslojna hromatografija", koja se zasnivala na metodi distribucije razdvajanja komponenti.

Particiona hromatografija na papiru.

Zbog činjenice da hromatografski papir koji se koristi u ovoj metodi (specijalne sorte filter papira) sadrži vodu (20-22%) u porama, kao druga faza se koriste organski rastvarači.
Upotreba hromatografije na papiru ima niz značajnih nedostataka: proces separacije zavisi od sastava i svojstava papira, promene sadržaja vode u porama papira sa promenama uslova skladištenja, veoma niska brzina hromatografije (do nekoliko dana), niska ponovljivost rezultata. Ovi nedostaci ozbiljno utiču na širenje papirne hromatografije kao hromatografske metode.
Stoga se pojava hromatografije u tankom sloju sorbenta, odnosno tankoslojne hromatografije, može smatrati prirodnim.

Osnove tankoslojne hromatografije.

U TLC metodi, kromatografija tvari se odvija u tankom sloju sorbenta nanesenog na čvrstu ravnu podlogu. Odvajanje u ovoj metodi se uglavnom odvija na osnovu sorpcije-desorpcije.
Upotreba različitih sorbenata omogućila je značajno proširenje i poboljšanje ove metode.
Na početku pojave metode, ploče su morale biti izrađene samostalno. Ali danas se uglavnom koriste montažne napolitanke, koje imaju prilično širok raspon kako u veličini i nosačima, tako i u podlogama.
Moderna kromatografska ploča je osnova od stakla, aluminija ili polimera (na primjer, politereftalata). Zbog činjenice da staklena podloga postaje sve manje popularna (često se lomi, nemoguće je podijeliti ploču na nekoliko dijelova bez oštećenja sloja sorbenta, teške težine), najčešće se koriste ploče na bazi aluminijske folije ili polimera.
Za fiksiranje sorbenta koriste se gips, škrob, silikasol itd. koji drže zrna sorbenta na podlozi. Debljina sloja može biti različita (100 i više mikrona), ali najvažniji kriterij je da sloj mora biti ujednačen po debljini bilo gdje na hromatografskoj ploči.

Sorbenti

Najčešći sorbent je silika gel.
Silika gel je hidratizirana silicijumska kiselina nastala djelovanjem mineralnih kiselina na natrijum silikat i sušenjem nastalog sola. Nakon mljevenja sola, koristi se frakcija određene veličine zrna (označena na ploči, obično 5-20 mikrona).
Silika gel je polarni sorbent, u kojem -OH grupe služe kao aktivni centri. Lako upija vodu na površini i stvara vodonične veze.
Alumina. Aluminij je slabo bazni adsorbens i uglavnom se koristi za odvajanje slabo bazičnih i neutralnih spojeva. Nedostatak ploča na aluminij oksidu je obavezno aktiviranje površine prije upotrebe u ormaru za sušenje kada visoke temperature(100-150 0 C) i nizak kapacitet adsorpcije sloja u odnosu na silika gel.
Diatomejska zemlja je adsorbent dobijen od prirodnih minerala: dijatomejske zemlje. Sorbent ima hidrofilna svojstva, ali niži kapacitet adsorpcije sloja u odnosu na silikagel.
Magnezijum silikat je manje polaran od silika gela i obično se koristi kada polarniji adsorbenti ne daju efikasno odvajanje.
Celuloza – tankoslojne ploče presvučene celulozom su veoma efikasne u odvajanju složenih organskih molekula. Adsorbent su uglavnom kuglice od celuloze prečnika do 50 mikrona, pričvršćene na nosač škrobom. Ali kao i u papirnoj hromatografiji, porast fronta rastvarača je veoma spor.
U hromatografskim pločama za ionsku izmjenu, smole za ionsku izmjenu koje sadrže kvaternarni amonijum ili aktivne sulfo grupe uključene u ionsku izmjenu koriste se kao adsorbens. Tankoslojna hromatografija sa ovom vrstom ploča se izvodi sa mobilnim fazama koje sadrže jake kiseline ili alkalije. Ove ploče su efikasne za odvajanje makromolekularnih i amfoternih jedinjenja.

Navedeni sorbenti su najčešći, ali pored njih, postoje mnoge tvari koje se koriste kao sorbenti. To su talk, kalcijum sulfat, skrob itd.
Istovremeno, čak i već spomenuti sorbenti mogu se modificirati kako bi im se dala nova sorpcijska svojstva (impregnacija sorbenata reagensima, na primjer, AgNO 3 , stvaranje ploča sa obrnutom fazom). Upravo ova raznolikost mogućih faza uz minimalne troškove omogućava korištenje TLC-a za kromatografiju velikog broja tvari.

Rastvarači

U tankoslojnoj hromatografiji kao mobilna faza se koriste ili čiste supstance (etil acetat, benzol itd.) ili mešavine supstanci (sistema) u određenom omjeru.
Odabir mobilne faze (sistema) vrši se prema sljedećim pravilima:

· Odaberite sistem u kojem komponente koje treba odvojiti imaju nisku rastvorljivost (ako je rastvorljivost supstance visoka, tada će se supstance kretati sa prednje strane, ako je rastvorljivost niska, ostaće na početku). Kod particione hromatografije ili kada se koriste obrnute faze, rastvorljivost supstanci mora biti veća u mobilnoj nego u stacionarnoj fazi.

· Sastav sistema mora biti konstantan i lako ponovljiv.

· Rastvarač ili komponente sistema ne smeju biti otrovne ili manjkave.

· Sistem mora potpuno odvojiti supstance slične strukture, a razlike u Rf moraju biti najmanje 0,05.

· Sistem ne smije uzrokovati kemijske promjene u komponentama koje treba odvojiti.

U odabranom sistemu analiti moraju imati razna značenja Rf i raspoređen po cijeloj dužini hromatograma. Poželjno je da vrijednosti Rf budu u rasponu od 0,05-0,85.

· Prilikom odabira sistema, mora se uzeti u obzir i priroda supstanci koje se odvajaju. Dakle, kada se hromatografišu supstance sa osnovnim svojstvima, sistem ne bi trebalo da ima kisela svojstva i obrnuto.

Priprema tanjira

Kada koristite kupljene ploče, one se prvo moraju pripremiti za hromatografiju. To je zbog činjenice da tijekom skladištenja pločasti adsorbenti apsorbiraju ne samo vlagu, već i druge tvari sadržane u zraku. Prilikom upotrebe nepripremljenih ploča tokom hromatografije pojavljuje se front “prljavštine” koji može ometati određivanje supstanci sa velikim Rf vrijednostima, a neke tvari, poput vode, mogu promijeniti sastav mobilne faze, čime se mijenjaju rezultirajuće vrijednosti Rf .
Preliminarna priprema ploča se sastoji u raspršivanju ploča čistim rastvaračem do cijele visine ploče (metanol, benzol, dietil eter), nakon čega slijedi sušenje ploče u pećnici na temperaturi od 110-120 0C u trajanju od 0,5-1 sat. Na ovaj način može se pripremiti nekoliko ploča odjednom, a kada se čuvaju na suvom, zatvorenom mestu, zadržavaju svojstva nekoliko meseci.

Tehnika primjene testnih rješenja.

Kako se ispostavilo, primjena ispitivane tvari nije tako komplikovana operacija, ali u isto vrijeme uvelike utječe na rezultate hromatografije.
Često se testiraju ili tečni analiti ili rastvori čvrstih materija, bez prethodne pripreme uzorka.
Stoga je uvijek potrebno zapamtiti niz tačaka koje ozbiljno utiču na rezultate razdvajanja.
Najvažnija je koncentracija primijenjenih supstanci. U TLC-u je uobičajeno da se primenjuju koncentracije rastvora od oko 1%. Ali s druge strane, osjetljivost metode omogućava vam da odredite tvari s mnogo nižim koncentracijama.
Ako je ukupna koncentracija komponenti u ispitivanoj supstanci nepoznata, ili je koncentracija poznata, ali ova vrsta tvari još nije hromatografirana, potrebno je utvrditi koja je količina ispitne otopine dovoljna za kvalitetnu hromatografiju. Postoji nekoliko metoda da se to utvrdi.
Najprije je potrebno nanijeti nekoliko tačaka hromatografskih otopina, jednakih veličina, ali u različitim količinama (na primjer, 1, 2, 5 µl) i nakon hromatografije proučiti oblik i veličinu odvojenih mrlja.
Dakle, uz pravilno odabranu koncentraciju, oblik odvojenih supstanci je isti kao oblik primijenjen na startnu liniju. Ako su razdvojene tačke veće od tačke na početku, onda je primenjena koncentracija previsoka. Pojava "repova", nepravilnog oblika razdvojenih tačaka na ploči, takođe može ukazivati ​​na visoku koncentraciju, ali može biti uzrokovana pogrešno odabranim hromatografskim sistemom, ili hemijskom interakcijom odvojenih komponenti.
Odabirom količine deponovane supstance i sistema rastvarača moguće je postići potpuno razdvajanje na jednoj ploči do deset komponenti u ispitivanim supstancama. Pogodno je primijeniti uzorke na posebnom stolu s šablonama i grijanjem. Uočavanje se vrši na "početnoj liniji" 1-2 cm od donje ivice ploče. Ovo je neophodno kako se kada se ploča spusti u sistem, uzorci ne bi rastvorili u njoj, a sva taložena supstanca bila podvrgnuta hromatografiji.
Nanošenje otopina vrši se ili mikrošpricom ili graduiranim kapilarama. Veličina nanesenog mjesta ne smije biti veća od 4 mm. To je zbog činjenice da s većom veličinom mrlje dolazi do promjene oblika pod djelovanjem fizičkih sila, a granice odvojenih komponenti mogu se preklapati.
Nanošenje ispitivanih supstanci na ploče ne bi trebalo da bude praćeno uništavanjem sorbenta (koje ima dosta jak uticaj na kvalitet odvajanja), pa se kap nanosi dodirom igle ili kapilare na sloj sorbenta, a ne pritiskom. Na veličinu nastale mrlje ne utiče samo količina nanesene otopine, već i polaritet rastvarača i njegova tačka ključanja. Dakle, kada se ista supstanca primenjuje u različitim rastvaračima, rezultirajuća tačka na kojoj je metanol korišćen kao rastvarač biće veća od mrlje iz rastvora hloroforma. s druge strane, kada se podloga zagrije, isparavanje otapala će biti intenzivnije i veličina mrlje će se također smanjiti.
Naravno, lakše je koristiti sušilo za kosu kada se nanosi na suhe mrlje, ali samo ako postoji potpuno povjerenje da nanesene tvari neće oksidirati pod djelovanjem vrućeg zraka.
Udaljenost između nanesenih tačaka treba biti oko 2 cm.
Ponekad se tokom hromatografije na pločama uočava efekat ruba, zbog čega se mrlje ne nalaze na istoj liniji, već izgledaju kao potkovica ili dijagonalno. Da bi se eliminisao ovaj efekat, svako mesto se može „obezbediti“ sopstvenom stazom, odvajajući primenjeni uzorak od ostalih uklanjanjem linije sorbenta. To je najbolje učiniti ispod ravnala oštrim predmetom (kao što je skalpel), ali pazite da ne uklonite previše sorbenta.
Nakon nanošenja ispitivanih supstanci na ploču, potrebno je postići potpuno uklanjanje rastvarača, jer čak i mala količina rastvarača u ispitivanoj supstanci može uticati na odvajanje, pa čak i promeniti sastav hromatografskog sistema.
Uklanjanje otapala se obično vrši prirodnim sušenjem ploča u trajanju od 5-10 minuta, bilo zagrijavanjem fenom ili u pećnici.

hromatografija

Tankoslojna hromatografija ima nekoliko metoda koje se uglavnom odnose na vrstu kretanja rastvarača.

Tankoslojna hromatografija prema gore

Tankoslojna kromatografija prema dolje

Horizontalna tankoslojna hromatografija

· Radijalna tankoslojna hromatografija.

Uzvodna tankoslojna hromatografija

Ova vrsta hromatografije je najčešća i zasniva se na činjenici da se prednja strana hromatografskog sistema uzdiže duž ploče pod dejstvom kapilarnih sila, tj. prednji dio hromatografskog sistema se kreće odozdo prema gore. Za ovu metodu koristi se najjednostavnija oprema, jer se kao hromatografska komora može koristiti bilo koja posuda s ravnim dnom i poklopcem koji čvrsto pristaje, u koji se može slobodno postaviti kromatografska ploča.
Metoda uzlazne tankoslojne hromatografije ima niz nedostataka. Na primjer, brzina uspona fronta duž ploče javlja se neravnomjerno, tj. u donjem dijelu je najviša, a kako se front diže opada. To je zbog činjenice da je u gornjem dijelu komore zasićenost parama rastvarača manja, pa otapalo sa hromatografske ploče intenzivnije isparava, pa se njegova koncentracija smanjuje i brzina kretanja usporava. Da bi se otklonio ovaj nedostatak, duž zidova hromatografske komore su pričvršćene trake filter papira, duž kojih uzlazni hromatografski sistem zasićuje komoru parom kroz čitav volumen.
Neke hromatografske komore imaju podelu na dva ležišta na dnu. Ovo poboljšanje omogućava ne samo smanjenje potrošnje hromatografskog sistema (potreban je manji volumen da bi se dobila potrebna visina hromatografskog sistema), već i korišćenje dodatne kivete za rastvarač, čime se povećava pritisak pare zasićenja u komori.
Potreba za praćenjem fronta rastvarača također se može smatrati nedostatkom, jer linija fronta rastvarača može „pobjeći“ do gornje ivice. U ovom slučaju više nije moguće odrediti stvarnu vrijednost Rf.

Tankoslojna kromatografija prema dolje

Ova metoda hromatografije zasniva se na činjenici da se prednja strana hromatografskog sistema spušta preko ploče uglavnom pod dejstvom gravitacije, tj. front mobilne faze se kreće odozgo prema dolje.
Za ovu metodu, kiveta sa hromatografskim sistemom je pričvršćena na gornji deo hromatografske komore, iz koje pomoću fitilja u hromatografsku ploču ulazi rastvarač, koji teče prema dole i uzorak se hromatografiše.
Nedostaci ove metode uključuju složenost opreme. Ova metoda se uglavnom koristi u papirnoj hromatografiji.

Horizontalna tankoslojna hromatografija

Ova metoda je najsloženija u dizajnu hardvera, ali i najprikladnija. Dakle, u hromatografskoj komori, ploča se postavlja horizontalno i sistem se dovodi do jedne ivice ploče pomoću fitilja. Front rastvarača se kreće u suprotnom smjeru.
Postoji još jedan trik da se kamera što više pojednostavi. Da bi se to postiglo, hromatografska ploča na bazi aluminijuma se lagano savija i stavlja u komoru. U ovom slučaju, sistem će djelovati s dvije strane istovremeno. Za ovu svrhu su pogodne samo ploče sa aluminijumskom podlogom, jer su plastične i staklene osnove „nesavitljive“, tj. ne zadržava svoj oblik.
Prednosti ove metode uključuju činjenicu da se u horizontalnoj ćeliji zasićenje parom sistema događa mnogo brže, prednja brzina je konstantna. A pri hromatografiji sa obe strane, prednji deo ne "beži"

Radijalna tankoslojna hromatografija.

Radijalna tankoslojna hromatografija se sastoji u tome što se ispitivana supstanca nanosi na centar ploče i tamo se dovodi sistem koji se kreće od centra ka ivici ploče.

Ploče za sušenje.

Nakon procesa odvajanja ispitivanih supstanci, ploče se suše. Ovo je također važan proces, jer ako na ploči ima čak i tragova rastvarača, moguće je dobiti netačne hromatografske rezultate.
Ako je hromatografski sistem uključivao samo komponente niskog ključanja, dovoljno je prirodno sušenje u trajanju od 3-5 minuta. Ako sistem uključuje tečnosti visokog ključanja (alkoholi, voda, organske kiseline itd.), ploče treba sušiti najmanje 10 minuta ili staviti u rernu.

Identifikacija odvojenih supstanci.

Osušena ploča je hromatogram ispitivanih supstanci. Ako su supstance obojene, onda identifikacija počinje određivanjem boje odvojenih supstanci.
Ali u većini slučajeva, izdvojene supstance su bezbojne i jednostavno vizuelno poređenje nije moguće.
Za tankoslojnu hromatografiju postoji nekoliko vrsta kvalitativne analize (identifikacije) izdvojenih supstanci:

· Vizuelne metode i određivanje Rf izdvojenih supstanci.

Reakcije u boji.

· Poređenje sa svjedocima.

· Fizičke i hemijske metode identifikacije.

Razmotrimo detaljnije svaku vrstu kvalitativne analize u tankoslojnoj hromatografiji.

Physical Methods

Vizualne metode se uglavnom koriste za lociranje tačaka odvojenih supstanci na hromatografskoj ploči. Da bi se to postiglo, ploča se gleda u vidljivom svjetlu i korištenjem ultraljubičastog svjetla (uglavnom svjetlosti s valnim dužinama od 366 i 254 nm)
Ovo je prva faza identifikacije koja određuje kvalitet odabranih uslova i rezultata hromatografije.
Dakle, nakon utvrđivanja kvaliteta hromatografije (odsustvo "repova" supstanci koje treba odvojiti ili preklapanje njihovih tačaka, pravilan oblik i veličina, odsustvo spajanja hromatografskih tragova, itd.) i smatrajući da je odvajanje prikladnim za dalje istraživanje, odrediti Rf identifikovanih tačaka.

Rf vrijednost.

Jedan od glavnih indikatora u TLC-u je Rf. Ovaj parametar je analogan vremenu zadržavanja i zavisi kako od svojstava supstanci koje se odvajaju, sastava mobilne faze i sorbenta, tako i od fizičkih parametara.
Određivanje Rf vrijednosti se provodi kao omjer udaljenosti koju je supstanca prošla i udaljenosti koju je prošla fronta rastvarača

Vrijednost Rf je bezdimenzionalna vrijednost i ima vrijednost od 0 do 1. Međutim, u literaturi se često nalaze indikatori kao što su hRf, Rf × 100, koji su isti Rf, ali pomnoženi sa 100, kako ne bi radili sa decimalnim vrijednostima.
Na vrijednost Rf ne utječe udaljenost koju prijeđe front rastvarača, međutim, mnoge metode opisuju prolazak fronta na udaljenosti od 10 cm. Ovo se koristi samo da bi se olakšalo izračunavanje Rf.
U praksi se na početku određuje udaljenost koju prođe front rastvarača: od početne linije (a ne od ruba ploče) do mjesta gdje je front bio na kraju hromatografije. Zatim se određuje udaljenost od startne linije do tačke odvojene supstance. Na to utiče veličina mrlje! Uostalom, ako mrlja ima okruglog oblika i male veličine, onda rezultirajući Rf ima jasnu vrijednost. A ako rezultirajuća mrlja ima veliku veličinu ili nepravilan oblik, tada pri određivanju Rf takve točke greška može doseći 0,1!
U slučaju particione hromatografije, koeficijent distribucije supstance i njen Rf povezani su odnosom:

gdje Sp i Sn- površine poprečnog presjeka pokretne i stacionarne faze.
Kao što vidimo, koeficijent raspodjele, u konstantnom omjeru Sp/Sn je veličina proporcionalno zavisna od Rf i može se odrediti preko nje.

reakcije u boji.

Reakcije u boji u tankoslojnoj hromatografiji se koriste izuzetno široko. Oni služe ne samo za određivanje lokacije odvojenih komponenti (tretman sumpornom kiselinom, parama joda), već i za određivanje i klase supstanci i identifikacije (u prisustvu pojedinačnih reakcija).
Ovdje nećemo razmatrati ovu ogromnu raznolikost boja kvalitativne reakcije, reći ćemo samo da ako se sve kvalitativne reakcije poklapaju i dobijene Rf vrijednosti supstance u tri razni sistemi sa literaturnim podacima, supstanca je identifikovana. Iako je, po mom mišljenju, potrebna dodatna potvrda istraživanjem drugom fizičko-hemijskom metodom.

Poređenje svjedoka.

Prilikom provođenja ispitivanja tvari očekivanog sastava koristi se hromatografska metoda svjedok- poznata supstanca. Ova metoda se koristi kada je teško izdržati hromatografske uslove, ne postoje literaturni podaci o Rf za dati sistem ili adsorbent, upotreba metode gradijenta itd. A kada provodite reakcije u boji, možete porediti ne samo boje, već i nijanse ispitivanih supstanci i svjedoka, što je također važno.
S druge strane, ovaj metod zahtijeva dodatne troškove za svjedoke.

Metode kvantitativne analize

Kvantitativna analiza u tankoslojnoj hromatografiji ima nekoliko tipova koji karakterišu svaku fazu razvoja metode. I iako se neke metode mogu primijeniti samo kao polukvantitativne, one se i dalje koriste u praksi.

metoda vizuelnog poređenja. Kao što je već spomenuto, intenzitet boje mrlje i njena veličina zavise od količine kromatografirane tvari. Stoga se vizualna kvantifikacija temelji na nekoliko tehnika.
Metoda razblaživanja. Ova metoda se sastoji u tome da se za svaku tvar određuje granična koncentracija pri kojoj se tvar ne može odrediti kromatografskom metodom. Prilikom kromatografiranja ispitivane tvari, razrjeđivanje se provodi sve dok se ne prestane pojavljivati ​​na ploči.
Sadržaj supstance C, određen ovom metodom, nalazi se po formuli:

gdje n-razrjeđivanje, a- koncentracija supstance pri kojoj se ne pojavljuje tokom hromatografije.
Metoda za određivanje površine tačke. Ako se primjenjuju iste količine ispitivanih supstanci i svjedoka, tada su površine mrlja dobijene hromatografijom proporcionalne logaritmu koncentracije supstance. S=a ln c+b

gdje su a i b empirijski koeficijenti određeni eksperimentalno.
Ako mrlja odvojene tvari ima oštre granice, tada se područje mrlje može odrediti gravimetrijskom metodom (izrezati mjesto i izvagati), izmjeriti planimetrom. Ova metoda daje grešku do 10-15%.
Međutim, ima niz značajnih nedostataka. Prvi i najznačajniji je da je na ovaj način moguće odrediti koncentraciju obojenih supstanci ili onih koje fluorescentuju u UV području (254, 366 nm). Ovaj nedostatak se može otkloniti dodavanjem različitih fosfora u sorbent, što povećava grešku određivanja.
Može se koristiti i obrada ploča supstancama za razvijanje (reagensima) (npr. korištenjem filter papira impregniranog reagensom za razvijanje, nakon čega slijedi kontakt s kromatografskom pločom i dalje određivanje površine razvijene tvari na njoj), ali greška u određivanju je takođe velika.
Potreba za pouzdanijim rezultatom kvantifikacije dovela je do upotrebe instrumentalnih metoda.
Metoda eluiranja. Ova metoda se sastoji u činjenici da se izdvojena tvar ispere sa sorbenta otapalom i njegova koncentracija se određuje drugim metodama - fotometrijskim, polarografskim itd. Ovo je prilično precizna metoda, ali samo pod uvjetom kvantitativne izolacije izdvojene tvari. Zbog visokog intenziteta rada, metoda se koristi prilično rijetko i neprihvatljiva je za veliki broj uzoraka koji se proučavaju.
Fotografska metoda Definicija se sastoji u fotografisanju ploča sa izdvojenom supstancom i daljem određivanju stepena zacrnjenja pomoću dezintometara.
radiografska metoda slično fotometrijskom, samo s tom razlikom što se utvrđuje pocrnjenje ploče uzrokovano zračenjem izdvojene tvari. Ova metoda se koristi samo za određivanje supstanci sa označenim atomima.
Fotodesintometrijska metoda može se koristiti bez izolacije supstance iz ploče i zasniva se na određivanju ne samo površine mrlje, već i njenog intenziteta.
Ovo je najpreciznija metoda za određivanje koncentracije supstanci, jer omogućava da se, kada se koriste kalibracioni grafikoni, izvrše prilično tačna kvantitativna određivanja svih izdvojenih supstanci (do 2-10%) direktno na ploči u kratkom periodu od vrijeme.
Nije iznenađujuće da se razvojem tankoslojne hromatografije povećava upotreba dezintometara, povećava osjetljivost, a samim tim i točnost određivanja koncentracije izdvojenih supstanci i približava se točnosti tekućinske hromatografije visokih performansi.

Rice. 1. Tipična komora za razvijanje tankoslojne hromatografske ploče

1. poklopac
2. staklena komora
3. TLC ploča
4. sorbent
5. mjesto uzorkovanja
6. rastvarač

Tipični TLC hromatogram metil estera masnih kiselina.

Na hromatogramu POZNAT= metil estri masnih kiselina = metil estri masnih kiselina. start= mjesto primjene smjese koje treba odvojiti.

Kromatogram je napravljen na Sorbfil ploči. Sistem je benzen. Manifestacija - ugljenisanje nakon prskanja sumpornom kiselinom.

Dot 1 - metil estri masnih kiselina. Dot 2 - produkti metilacije ukupnih lipida.

Arrow prikazan je smjer kretanja fronta rastvarača (sistema). Front rastvarača se tokom hromatografije pomerio do gornje ivice ploče.

Primjena TLC metode u farmaciji

Veliku važnost kromatografskih metoda za farmaciju proizilazi iz činjenice da je u proizvodnji lijekova u mnogim slučajevima potrebna prethodna izolacija prirodnih ili sintetičkih proizvoda u čistom obliku. Analiza se takođe često zasniva na razdvajanju smeša na komponente. Razmotrimo dva primjera primjene TLC metode, koja dokazuju njen značaj u analizi i proizvodnji ljekovitih supstanci.

Kvantitativno određivanje triterpenskih saponina HPTLC pomoću skenirajuće denzitometrije

Triterpenski saponini (glikozidi) su aktivni sastojci mnogih lijekova.

Većina trenutno korišćenih metoda za kvantitativno određivanje triterpenskih saponina bazira se na kiseloj hidrolizi ovih potonjih uz dalje određivanje aglikona, najčešće titrimetrijskim, rjeđe spektralnim metodama analize.

Slične metode zasnovane na uništavanju molekula saponina imaju niz nedostataka. Dugi su i ne dozvoljavaju kvantitativnu procjenu omjera pojedinačnih saponina u ukupnim preparatima koji sadrže saponine.

Autori se u većini slučajeva ograničavaju, po pravilu, na kvalitativnu procjenu pomoću TLC metode, najpristupačnije i najjednostavnije hromatografske metode analize. Upotreba TLC-a za određivanje kvantitativnog sadržaja komponenti ograničena je nedostatkom skenirajućih denzitometara.

U radu su prikazani rezultati kvantitativnog TLC određivanja nekih triterpenskih saponina, derivata oleanolne kiseline, u farmaceutskim preparatima i ekstraktima iz biljnog materijala.

Kao predmet proučavanja odabrani su triterpenski saponini mandžurske aralije (aralozidi). čije je kvalitativno određivanje u različitim objektima obrađeno u radovima, kao i triterpenski saponini šećerne repe - supstance sa unapred utvrđenom farmakološkom aktivnošću. Oba su derivati ​​oleanolne kiseline sa malom (ne više od četiri) količinom ostataka šećera, što ukazuje na njihovo slično ponašanje u tankom sloju sorbenta.

Kao standard koristili smo zbir aralozida izolovanih iz Saparal tableta i zbir saponina šećerne repe izolovanih iz svježe ubranih rizoma. Za nanošenje na ploču pripremljeni su vodeno-alkoholni (80% etanol) rastvori saponina sa sadržajem potonjih 0,4–2,0 mg/ml. Kromatografija je obavljena na pločama za TLC "Silufol" (Češka) 15 x 15 cm, "Armsorb" za HPTLC (Jermenija) 6 x 10 cm i "Sorbfil" (Rusija) 10 x 10 cm. Visina prednjeg uspona, dovoljna za potpuno odvajanje, iznosila je 10,6 odnosno 6 cm. Uzorci su nanošeni mikrošpricom MSH-10 (Rusija) na ploču zagrijanu na 40°C Optimalna zapremina apliciranog uzorka bila je 3-5 μl. Nanošenje je vršeno u nekoliko faza tako da je prečnik startnog tačka nije prelazila 2 mm.

Kromatografija je izvedena na temperaturi od 20 - 25 °C. Na kraju eluiranja, ploče su osušene na zraku i tretirane reagensom za detekciju korištenjem laboratorijskog staklenog raspršivača. Zone su skenirane pomoću Shimadzu CS-9000" skenirajućeg denzitometra (Japan). Upoređen je kvalitet zona dobijenih hromatografijom u tri najčešće preporučena sistema za eluiranje: I. hloroform - metanol - voda (30:17:3) : II n-butanol - etanol - amonijak (7:2:5) III n-butanol - voda - sirćetna kiselina (4:5:1), gornji sloj IV benzen - etil acetat (1:1) (za šećerna saponina repa).

Kao detektorski reagensi korišćen je 25% alkoholni rastvor fosfovolframske kiseline (grimizne mrlje saponina na beloj pozadini). najčešće se koristi za kvantitativna TLC određivanja takvih spojeva i 10% alkoholnog rastvora fosfomolibdinske kiseline, preporučuje se za razvoj triterpenoidnih zona (saponinske zone su tamnoplave na žutoj pozadini). Tretiranje ploča s parom amonijaka u potonjem slučaju omogućava promjenu boje pozadine i povećanje kontrasta mrlja.

Kao rezultat provedenih studija izabrani su optimalni uslovi za hromatografski proces za denzitometrijsko određivanje. Najbolje od tri vrste ploča prepoznao je "Armsorb" za HPTLC. visoka efikasnost Proces je olakšan tankim (II0 μm) i homogenim po frakcijskom sastavu (5-10 μm) slojem silika gela, koji omogućava dobro odvajanje i minimalno zamućenje zona čak i kada se front rastvarača podigne za 6 cm. Sorbfil ploče su gotovo jednako dobri kao oni u sposobnosti odvajanja, ali vrijeme eluiranja na njima je skoro dvostruko duže. Ploče "Silufol" pri dovoljno visokoj brzini eluiranja omogućavaju odvajanje komponenti dužom hromatografskom putanjom, što dovodi do određenog zamućenja zona, ali je moguća i njihova upotreba.

Eluiranje se može izvesti dovoljno kvalitetno u bilo kojem od prva tri elucijska sistema. I daje dobitak u vremenu, IV omogućava bolje odvajanje saponina šećerne repe od prva tri.

Oba reagensa za detekciju daju prilično stabilno bojenje zona kada se skeniranje vrši unutar 1 - 2 sata od trenutka razvoja. Nakon tog perioda, saponinske zone na pločama tretiranim fosfovolframnom kiselinom mijenjaju boju iz grimizne u ljubičastu, što može dovesti do izobličenja rezultata kvantitativne analize tokom skeniranja. U ovom slučaju je poželjnije liječenje fosfomolibdinskom kiselinom. Kada se čuvaju na mestu zaštićenom od svetlosti, ploče sa zonama razvijenim ovim reagensom dale su potpuno ponovljive rezultate nakon nekoliko meseci od trenutka razvoja.

Granica detekcije saponina bila je 5 μg u uzorku kod razvijanja fosfovolframskom kiselinom i 0,5 μg u uzorku kod razvijanja s fosfomolibdinskom kiselinom. Tretman parom amonijaka omogućio je smanjenje granice detekcije saponina u potonjem slučaju na 0,2 μg po uzorku.

Kvantitativno određivanje saponina TLC pomoću skenirajuće denzitometrije izvršeno je na Armsorb pločama (brzina hromatografije u ovom slučaju je bila 2 puta više) ili "Sorbfil", u II i III elucionom sistemu (kao što sadrži manje toksične komponente). Zone su detektovane 10% rastvorom fosfomolibdinske kiseline. Volumen primijenjenog uzorka nije veći od 5 μl, visina fronta eluenta je 6 cm, vrijeme eluiranja je 30 - 60 minuta. Talasna dužina skeniranja λ = 675 nm. Nakon obrade ploča, saponini aralije i šećerne repe pojavljuju se u obliku tri zone različitog intenziteta.

Opšti prikaz denzitograma dobijenih tokom skeniranja prikazan je na sl. jedan.

Poređenje hromatograma saponina izolovanih iz tableta "Saparal" (slika 1, a) i "tinktura aralije" (sl. 1,6) nam omogućava da uočimo različit omjer 44

aralozidi A, B i C, koji su dio ovih doznih oblika. Slična varijabilnost u omjeru pojedinačnih saponina u sirovinama, ovisno o uvjetima uzgoja biljke, zabilježena je i ranije. Odnos saponina u gotovom dozni oblici lako procijeniti korištenjem dobijenih denzitograma. Pošto na hromatogramu postoje 3 zone koje odgovaraju saponinom, odnosno tri pika na denzitogramu, površine svih pikova su sumirane prilikom konstruisanja kalibracione zavisnosti. Greška je u ovom slučaju bila manja nego u proračunima na osnovu parametara vrha jedne od komponenti, uzimajući u obzir varijabilnost njihovog odnosa (slika 2).

Rice. I. Denzitogrami dobijeni skeniranjem TLC ploča: a- saponini aralije izolovani iz Saparal tableta; 6 - saponini tinkture aralije; in- saponini šećerne repe. Ukupan sadržaj saponina u uzorku je 5 μg. A, B, C- vrhovi saponina; 0 - startna linija; f- Linija fronta.

Rice. Slika 2. Kalibraciona zavisnost zbira površina peakon saponina na hromatogramu od njihovog sadržaja u uzorku. / - saponini aralije; 2 - saponini šećerne repe. Na osi apscise - sadržaj saponina u uzorku (mcg), na osi ordinata - zbir površina pikova (cm 2).

Kalibraciona zavisnost zbira površina pikova na denzitogramu od sadržaja supstance u uzorku dobijena je hromatografijom serije standardnih rastvora sa poznatim sadržajem saponina. Početna otopina je pripremljena otapanjem u 80% etanolu tačne težine saponina, osušenih do konstantne težine. Serija radnih rastvora je pripremljena uzastopnim razblaživanjem početnog 80% etanola. Sadržaj saponina u njima bio je 0,04 - 2,0 mg/ml (0,2 - 10 µg u uzorku zapremine uzorka od 5 µl). Ovaj raspon koncentracije se može smatrati optimalnim za skeniranje. Minimalni sadržaj saponina određen ovom metodom je 0,2 µg/uzorku. Relativna standardna devijacija u ovom slučaju ne prelazi 0,03.

Rezultirajuće kalibracijske ovisnosti su nelinearne, što je u potpunosti u skladu s Kubelka-Munk teorijom, koja uzima u obzir apsorpciju i raspršivanje svjetlosti od strane sorbenta. U uskom rasponu niskih koncentracija, ovisnosti se mogu smatrati linearnim (0,2 - 2,0 µg/uzorku). Nelinearni dio krive može se linearizirati pretvaranjem količine tvari u uzorku i površine pika u recipročne vrijednosti i poprima oblik prikazan na Sl. 3.

Rice. 3. Zavisnost recipročne vrednosti zbira površina pikova saponina na hromatogramu (1/S 10 -1) od njihove recipročne vrednosti sadržaja u uzorku (1/m - 10 -1). 1 - saponini aralije; 2 - saponini šećerne repe.

Na osnovu dobijene kalibracione zavisnosti određen je sadržaj saponina u tinkturi aralije. 5 ml tinkture razrijeđeno je sa 70% etanolom u volumetrijskoj tikvici od 25 ml. Na početnu liniju "Armsorb" ploča naneseno je 5 μl dobijenog rastvora, a na susednu tačku 5 μl standardnog rastvora aralozida koncentracije 1 mg/ml (5 μg u uzorku). ploče su obrađene kako je gore opisano.

Razlika između dobijenih rezultata i rezultata određivanja prema FS 42-1647-93 (5,3 mg/ml) iznosila je 6-7% prema precenjivanju, što se može objasniti gubitkom saponina tokom višestepene pripreme uzorak prema FS (tabela).

Gore opisana metoda je korištena za određivanje saponina u tabletama "Saparal" iu biljnom materijalu (korijeni mandžurske aralije i rizomi šećerne repe) uz preliminarnu iscrpnu ekstrakciju saponina iz tableta iz sirovine - 80% vrućeg etanola. Odstupanja od rezultata određivanja prema FS 42-1755 - 81 za tablete (0,040 g) su u istim granicama kao i za tinkturu (tabela).

Tako je prikazana mogućnost ekspresnog kvantitativnog određivanja nekih triterpenskih saponina, derivata oleanolne kiseline u farmaceutskim proizvodima i biljnim materijalima HPTLC uz naknadnu kvantitativno vrednovanje dobijenih zona pomoću skenirajuće denzitometrije.

Rezultati determinacije prilično dobro koreliraju sa rezultatima određivanja od strane PS. Tehnika omogućava kombinovanje utvrđivanja autentičnosti preparata TLC (preko FS) sa naknadnim skeniranjem zona komponenti na pločama i njihovom kvantitativnom procenom. Kromatogrami dobijeni tokom skeniranja također omogućavaju određivanje omjera pojedinačnih saponina u analiziranim objektima.

Rezultati kvantitativnog određivanja araloza uCTofik-od aralije (I) i tablete "Saparal" (2) metodom TGC pomoću skeniranja dsnsptoietrnn /" = 0,95, i - 5,/=2,78,/=4

PROUČAVANJE LIPIDNOG I FLAVONOIDNOG SASTAVA UZORAKA NEKIH VRSTA RODA KINA ( Lathyrus .)

Od mnogih predstavnika porodice mahunarki, kao što su lucerka, lupina, djetelina, grahorica, izolovani su flavonoidi koji imaju širok spektar djelovanja: protuupalno, zacjeljujuće, jačaju krvožilni sistem itd. Iz crvene deteline su izolovani izoflavoni: biohanin A - 0,8% i formononetin - 0,78%, koji imaju estrogenu aktivnost.

Proučavali smo sastav flavonoida u pojedinim vrstama rodnog ranga: g. setva (I), šlugovaja (II), gl.

S obzirom na moguću upotrebu lipidnog kompleksa u aditivi za hranu i lijekova, proučavali smo i kompletan frakcijski sastav lipida u travi i sjemenkama brade.

materijali i metode

Izolacija lipidne frakcije iz suhih sirovina obavljena je prema Bligh i Dyer metodi.

Uzorku (0,2 g) suvog biljnog materijala dodano je 1,6 ml destilovane vode i ostavljeno jedan dan na hladnom. Zatim je dodano 6 ml mješavine hloroform - metanol (1:2) i ostavljeno 3 dana, nakon čega je centrifugirano na 8 hiljada okretaja u minuti - 15 minuta. U bistri supernatant dodano je 2 ml vode i 2 ml hloroforma. Rezultirajući 2-fazni sistem je odvojen u lijevu za odvajanje. Sloj hloroforma je dva puta ispran metanolom i uparen do suha na rotacionom isparivaču. Ostatak je osušen u vakuumskom eksikatoru, zatim razrijeđen hloroformom do koncentracije od 10 mg/ml, a rastvor je pohranjen u stabilizovanom hloroformu na +4°C.

Kvalitativna analiza lipidne frakcije izvršena je pomoću TLC na Kizelgel 60 (254) pločama u sljedećim sistemima rastvarača:

A. Za neutralne lipide: 1) Heksan - benzen (9:1); 2) Heksan - etar - sirćetna kiselina (90:10:1).

B. Za polarne lipide (fosfolipide): 1) hloroform - aceton - metanol - sirćetna kiselina - voda (6:8:2:2:1), kisela; 2) hloroform - meta-

nol - 26% amonijaka (65:25:5), bazni; 3) hloroform - metanol - voda (65:25:4), neutralan.

Prilikom određivanja kvalitativnog sastava fosfolipida, njihova identifikacija je izvršena korištenjem različitih razvijača (jodna para, ninhidrin, Dragendorffov reagens, sumporna kiselina) i korištenjem Rf standardima.

Gornji set sistema i reagensa omogućio je da se izvrši iscrpna analiza frakcija lipida izolovanih iz uzoraka brade.

Za proučavanje sastava flavonoida, uzimajući u obzir faze vegetacije, odabrani su sljedeći uzorci: I (faza cvjetanja); IV (faza cvjetanja); III (sočevnik) faza pupanja; II (faza cvjetanja); II (faza plodonošenja); II (vegetacijska faza prije cvatnje).

Izolacija flavonoida iz suhih sirovina obavljena je po metodi koja osigurava njihovu iscrpnu ekstrakciju.

U tu svrhu 1 g zgnječenog bilja stavljen je u tikvicu za refluks, napunjen sa 20 ml 70% etanola i kuhan 20 minuta u vodenom kupatilu. Ekstrakt je ohlađen, filtriran kroz stakleni Schott filter i uparen do suva na rotacionom isparivaču. Ostatak je otopljen u etil alkoholu do konačne koncentracije od 10 mg/ml. Određivanje ukupnog sadržaja flavonoida sprovedeno je primenom rutina kao standarda. Rezultati ove studije prikazani su u tabeli. 3.

Kvalitativni sastav flavonoida određen je TLC na Kieselgel 60(254) pločama kompanije Merck, u sistemu rastvarača n-butanol - sirćetna kiselina - voda (6:1:2). Detektor - sumporna kiselina na UV (254 nm) - flavonoidne mrlje lila boja na zelenoj pozadini.

Tabela 1

Ukupan sadržaj flavonoida u sirovinama (travi) raznih vrsta porcija (u%, u odnosu na apsolutno suvu masu)

Rice. Slika 1. TLC sastava flavonoida odabranih vrsta iz roda Chin. C - količina svjedoka flavonoida: ononin - Rf 0,28; rutina - R.0.48; luteolin-glukozid - Rf 0,58; formononetin - Rf 0,64; kvercetin - Rf0,79: luteolin - Rf 0,82; biochanin A - Rf 0,85; apigenin - Rf 0,92.

Rice. Slika 2. TLC flavonoida livadske trave u različitim fazama vegetacije. IIa - faza cvjetanja; IIb - faza plodonošenja: IIc - faza vegetacije prije cvatnje. C - količina svjedoka flavonoida: ononin - Rf f 0,28; rutina - Rf 0,48; luteolin-glukozid - Rf 0,58; formononetin - Rf 0,64; kvercetin - Rf 0,79; luteolin - R ( 0,82; biochanin A - Rf 0,85; apigenin - Rf 0,92.

Prilikom proučavanja flavonoidnog sastava II u različitim fazama vegetacije, uočeno je da su u ekstraktu, pored rutina i kvercetina, u značajnoj količini prisutni ononin i formononetin. Ostali flavonoidi su pronađeni u tragovima.

Tako je pokazano da se u različitim tipovima brade, u različitim fazama vegetacije, nalaze i glikozidi i aglikoni – ononin, rutin, luteolin-glukozid i njihovi aglikoni: formononetin, kvercetin i luteolin, a njihov sastav varira u zavisnosti od vrste. biljke, a u jednoj biljci (rang livade) u zavisnosti od faze vegetacije.

tabela 2

Kvantitativni sadržaj glavnih flavonoida u pojedinim predstavnicima roda chiny (u %, u smislu apsolutno suve težine)

U II., u vegetativnom periodu pronađeni su i ononin i formononetin. U periodu cvatnje i plodonošenja primetno se smanjuje količina ononina, a povećava se količina formononetina.

Kvantitativni sadržaj glavnih flavonoida u ispitivanim uzorcima određen je kvantitativnom TLC pod istim uslovima. Rezultati ove studije prikazani su u tabeli. 2.

Kako slijedi iz podataka u tabeli. 2, različite vrste Brada je bogat izvor bloflavonoida, zbog čega ove biljke ispoljavaju jednu od vrsta biološke aktivnosti.

zaključak:

Jedan od važnih zadataka moderne hemije je pouzdana i tačna analiza organskih supstanci, često slične strukture i svojstava. Bez toga je nemoguće izvesti hemijske, biohemijske i medicinska istraživanja, ekološke metode analize životne sredine, forenzička ispitivanja, kao i hemijska, naftna, gasna, prehrambena, medicinska industrija i mnogi drugi sektori nacionalne privrede u velikoj meri se zasnivaju na tome. Ovdje je dat samo mali dio metoda i tehnika tankoslojne hromatografije. Ali kao što možete vidjeti iz ove male, tankoslojna hromatografija ima značajne i ozbiljne mogućnosti, u kombinaciji sa praktičnošću i jednostavnošću.